劉珊廷　易顯榮　周民武　吳瀟　齊開杰　徐志美　趙碧英

摘? ? 要：【目的】闡明廣西地方梨種質(zhì)的遺傳多樣性、親緣關(guān)系及群體結(jié)構(gòu)，加快梨種質(zhì)的鑒定、評(píng)價(jià)和保護(hù)，促進(jìn)地方優(yōu)質(zhì)梨種質(zhì)資源的合理有效利用，助推品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新?！痉椒ā坷煤Y選獲得的15個(gè)SSR分子標(biāo)記對(duì)71份廣西地方梨種質(zhì)和48份外地梨種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析?！窘Y(jié)果】共檢測(cè)出190個(gè)等位基因（Na），平均等位基因數(shù)（Na）為12.667，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為5.454，位點(diǎn)多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）平均值為0.762，較好地揭示了梨的遺傳多樣性；觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He）平均值分別為0.682和0.788，說(shuō)明梨群體內(nèi)存在近緣交配；香農(nóng)指數(shù)（I）平均值為1.876，反映梨群體的遺傳多樣性豐富。廣西地方種質(zhì)的平均等位基因數(shù)為11.53，平均有效等位基因數(shù)為5.606，香農(nóng)指數(shù)（I）為1.894，均高于外地種質(zhì)，說(shuō)明廣西地方種質(zhì)的遺傳多樣性更豐富。聚類分析顯示大部分廣西地方種質(zhì)與外地種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，隸屬兩個(gè)不同類群，但二者存在少量的相互交叉，少數(shù)的廣西梨和外地梨聚為一類，有較近的親緣關(guān)系。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析也表明大部分廣西梨和外地梨的遺傳結(jié)構(gòu)差異較大，并且2個(gè)居群的近交系數(shù)（Fis）均值都大于0，存在近緣交配。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，71份廣西地方種質(zhì)聚為3個(gè)類群，從群體遺傳結(jié)構(gòu)上可劃分為4個(gè)不同群體，但群體間未表現(xiàn)明顯的區(qū)域分化特征。分子方差分析結(jié)果表明，供試?yán)娣N質(zhì)的變異主要來(lái)源于個(gè)體內(nèi)，群體間和個(gè)體間的遺傳分化程度較低，應(yīng)關(guān)注對(duì)群體內(nèi)個(gè)體的選擇和保護(hù)。【結(jié)論】廣西地方梨種質(zhì)遺傳多樣性相對(duì)豐富，居群內(nèi)普遍存在近緣交配，沒(méi)有明顯的區(qū)域分化特征，其遺傳背景和外地一些栽培種或雜交種差異較大，建議加強(qiáng)對(duì)廣西地方梨種質(zhì)的保護(hù)和利用。

關(guān)鍵詞：梨；廣西；SSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性；群體結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2024）03-0379-13

Analysis of genetic diversity and population structure of pear germplasm resources in Guangxi

LIU Shanting1， YI Xianrong1， ZHOU Minwu1， WU Xiao2， QI Kaijie2， XU Zhimei1， ZHAO Biying1*

（1Guangxi Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization of Specialty Commercial Crops in North Guangxi/Guangxi Academy of Specialty Crops， Guilin 541004， Guangxi， China; 2Jiangsu Engineering Research Center for Pear/College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， Jiangsu， China）

Abstract： 【Objective】 Pear， one of the most economically important temperate fruit trees， belongs to the genus Pyrus. China is one of the origin centers of Pyrus plants with a wide range of germplasm resources and has a long history of cultivation. As one of the important producing areas in southern China， pear cultivation area and production of Guangxi were 2.1×104 hm2 and 5.08×105 tons in 2022， respectively. There is a rich wild pear germplasm resources in Guangxi according to the previous investigation. However， the understanding of the genetic diversity and population structure of the pear resources in Guangxi is still limited. It is of great significance for accelerating the identification， evaluation and conservation of the pear germplasm， and promoting the effective utilization of the local high-quality pear germplasm resources by clarifying the genetic diversity， population structure of the local pear germplasms in Guangxi， as well as its relationship with the nonlocal germplasms. 【Methods】 A total of 119 pear cultivars and landraces were collected and subjected to analyze the genetic diversity and the population structure using 15 pair of SSR primers reported in previous research. The genomic DNA was extracted by genomic DNA extraction kit of magnetic bead method， and the purity concentration and integrity of the extracts were assessed by NanoDROP and agarose gel electrophoresis. A 10 μL PCR system was adopted， including 5.0 μL of 2×Taq PCR Master Mix， 0.5 μL of each of forward and reverse primers （10 pmol·μL-1）， 1.0 μL genomic DNA （20 ng·μL-1）， and 3.0 μL of ddH2O. The DNA was amplified according to the molecular weight records using capillary electrophoresis technology. According to the polymorphic bands， the data matrix was obtained. The number of alleles （Na）， the number of effective alleles （Ne）， the Shannon information index （I）， the expected heterozygosity （He）， the observed heterozygosity （Ho）， the polymorphic information content （PIC）， and the inbreeding coefficient （Fis） were calculated using GenAlEx version 6.501 software. The Neis genetic distance among between 119 accessions of the germplasm resources were calculated using Powermarker software. The UMPGA cluster trees of the 119 pear germplasm resources based on the Neis genetic distance were constructed using MEGA7.0 software. The genetic structure analysis of the populations of pear was performed using STRUCTURE 2.3.4 software. The population number （K） was set to 1-20. Each K value was simulated 20 times， and the Markov Chain Monte Carlo （MCMC） was set 100 000 times. Finally， the optimal ?K value was calculated using the online tool STRUCTURE HARVESTER. The genetic linkage map was constructed using CLUMMP and DISTRUCT software. The principal coordinate analysis （PCoA） was accomplished using GenAIEx software. 【Results】 A total of 190 alleles were detected in the pear germplasm resources by the 15 polymorphic SSR markers. The average number of alleles was 12.667. The average effective allele per SSR marker was 5.454. The average polymorphic information content （PIC） was 0.762. These results showed that there was a relatively high genetic diversity within this population. The average observed heterozygosity （Ho） and expected heterozygosity （He） were 0.682 and 0.788， respectively， suggesting that the presence of inbreeding would exist within the pear population. The average Shannon information index （I） was 1.876， reflecting that there was a high genetic diversity in the local pear population. Compared with the nonlocal germplasms， the genetic diversity of the local pear was higher with an average allele of 11.53， an average effective allele of 5.606， and a Shannon information index （I） of 1.894. The cluster analysis showed that the majority of the local germplasms in Guangxi and nonlocal germplasms were divided into two different groups， with a distant genetic relationship. The analysis of population genetic structure also indicated that there was a significant difference in the genetic structure between the majority of the local germplasms in Guangxi and the nonlocal germplasms. The Fis mean values of the two populations were over 0， indicating that there would be inbreeding within the population. Further research found that the 71 local germplasms in Guangxi were clustered into three groups， which could be divided into four different populations based on population genetic structure. However， there were no obvious regional differentiation characteristics between the populations. The result of the analysis of molecular variance （AMOVA） indicated that the genetic variation in the pear germplasms mainly occurred within individuals， while the genetic differentiation between the populations and individuals was relatively small. 【Conclusion】 The fifteen SSR primers had the characteristics of clear amplification results， good repeatability and high polymorphism， and would be suitable for pear germplasm identification， genetic linkage map construction， genetic diversity， and molecular marker-assisted breeding. Furthermore， the genetic diversity of the local pear germplasms in Guangxi was relatively rich. There would be a general inbreeding and no obvious regional differentiation within the populations， and the genetic background differed greatly from some cultivars or hybrids of nonlocal pear. Therefore， we proposed to strengthen the conservation and utilization of the local pear germplasm in Guangxi.

Key words： Pear; Guangxi; SSR markers; Genetic diversity; Population structure

梨為薔薇科（Rosaceae）梨屬（Pyrus L.）植物，是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)的重要溫帶果樹之一，距今已有3000余年的栽培歷史[1]。一般認(rèn)為梨的原種起源于第三紀(jì)甚至更古老的中國(guó)西部或者西南部的山區(qū)，經(jīng)過(guò)亞歐大陸傳播到中亞地區(qū)，最后到達(dá)亞洲西部和歐洲[2]。根據(jù)出身、原產(chǎn)地，梨可分為兩大類：東方梨（Oriental pears）和西方梨（Occidental pears）。目前發(fā)現(xiàn)的梨屬植物至少有30個(gè)種，其中原生種（基本種）大約有20個(gè)。在中國(guó)，梨產(chǎn)區(qū)遍布東西南北中，梨的種質(zhì)資源極為豐富，可以說(shuō)，我國(guó)是梨屬植物的起源中心，也是遺傳多樣性中心，形成了中國(guó)豆梨、柯漢梨或臺(tái)灣豆梨、川梨、砂梨和秋子梨等基本種[3]，還有各種各樣的品種資源和地方野生資源，它們形狀各異，顏色多樣，早、中、晚熟皆有，風(fēng)味各具特色[4]。中國(guó)南疆廣西壯族自治區(qū)地處亞熱帶和熱帶氣候區(qū)，水、光、熱資源充足，生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多變，孕育了許多具有特色的梨種質(zhì)資源，比如砂梨中的優(yōu)質(zhì)品種灌陽(yáng)雪梨，被評(píng)為全國(guó)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2022年廣西梨栽培面積2.1萬(wàn)hm2，產(chǎn)量50.78萬(wàn)t，是廣西重要的水果產(chǎn)業(yè)之一。然而，廣西梨產(chǎn)業(yè)存在品種競(jìng)爭(zhēng)力不強(qiáng)等突出問(wèn)題，加快品種改良和種質(zhì)資源創(chuàng)新利用是有效的解決方法之一。因此，對(duì)廣西地方梨種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)鑒定、遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)分析具有重要意義。

種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性研究是品種改良和種質(zhì)資源創(chuàng)新的基礎(chǔ)。在植物研究中，傳統(tǒng)的做法是主要依據(jù)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、酶學(xué)等方法來(lái)鑒定種質(zhì)，但實(shí)際中仍存在許多困難，而且可靠性不高。20世紀(jì)70年代以來(lái)，以個(gè)體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)得到了快速發(fā)展和應(yīng)用，極大地推動(dòng)了植物種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性研究，常見的分子標(biāo)記有：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、擴(kuò)增限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。其中，SSR分子標(biāo)記符合孟德爾共顯性遺傳，具有數(shù)量豐富、操作技術(shù)簡(jiǎn)便、可靠性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[5]，在評(píng)價(jià)植物遺傳多樣性、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、揭示進(jìn)化歷史和分子輔助育種等方面得到了廣泛應(yīng)用。21世紀(jì)以來(lái)，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在梨品種鑒定、遺傳多樣性研究和新品種選育等方面已有許多成功先例。日本學(xué)者Yamamoto等[6]最早借鑒蘋果上建立的SSR分子標(biāo)記，應(yīng)用于梨的多態(tài)性和遺傳多樣性鑒定并最終取得成功。在中國(guó)，Bao等[7]利用6對(duì)SSR引物對(duì)東亞主要原生栽培種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明，供試材料分為10個(gè)類群。其中，所有中國(guó)砂梨被劃分到4個(gè)類群，具有豐富的遺傳多樣性，中國(guó)白梨被劃分到3個(gè)類群，日本梨僅存在于1個(gè)類群中，中國(guó)砂梨和中國(guó)白梨沒(méi)有形成離散群甚至亞群，此外，一些日本梨栽培種與中國(guó)砂梨栽培種的關(guān)系十分相近。Xue等[8]從篩選出的332個(gè)多態(tài)SSR標(biāo)記中隨機(jī)選取18個(gè)多態(tài)SSR標(biāo)記，對(duì)44個(gè)梨品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，為鑒定梨品種的族譜基因型、系譜推斷提供了重要參考。

新中國(guó)成立以來(lái)，中國(guó)學(xué)者在梨種質(zhì)資源、品質(zhì)發(fā)育及遺傳育種研究領(lǐng)域取得了豐碩成果，特別是近年來(lái)對(duì)梨的起源進(jìn)化、遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究不斷深入，梨的“前世今生”被逐漸揭開神秘面紗。限于多種因素，廣西地方梨種質(zhì)資源的鑒定、遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)的研究還比較薄弱，加上各地區(qū)之間的苗木繁育和種質(zhì)交流進(jìn)程加快，導(dǎo)致品種混雜、關(guān)系不清、同物異名等問(wèn)題突出，極不利于廣西梨種質(zhì)資源的保護(hù)和創(chuàng)新利用。筆者在本研究中以119份梨種質(zhì)作為試驗(yàn)材料，利用15個(gè)多態(tài)性良好的SSR標(biāo)記，分析廣西地方梨種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，及其與外地種質(zhì)之間的親緣關(guān)系和遺傳差異，旨在為廣西地方梨種質(zhì)資源的保護(hù)和創(chuàng)新利用以及現(xiàn)代梨育種工作提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

119份供試?yán)娣N質(zhì)采自自治區(qū)級(jí)農(nóng)作物種質(zhì)資源圃—廣西梨種質(zhì)資源圃（桂林），其中原產(chǎn)于廣西的種質(zhì)有71份，外地種質(zhì)48份。詳細(xì)信息見表1。

1.2 基因組DNA提取

每份梨種質(zhì)材料取嫩葉（鮮質(zhì)量20～50 mg）液氮冷凍后研磨，采用磁珠法基因組提取試劑盒（武漢納磁生物科技有限公司）提取樣本DNA。獲得的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，用NanoDROPTM? 8000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)純度和濃度。

1.3 SSR-PCR

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)中的58對(duì)SSR引物信息[9-12]，委托武漢天一華煜基因科技有限公司合成，用8個(gè)樣本進(jìn)行引物篩選驗(yàn)證，篩選出15對(duì)擴(kuò)增成功、峰型良好的引物（表2）。

PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括：2×Taq Master Mix（Mg2+）5.0 μL，濃度為10 pmol·μL-1 的正反向引物各0.5 μL，20 ng·μL-1 的DNA模板1 μL，ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，62～52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)下降1 ℃；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 20 min延伸后4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物1.0 μL，分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液（0.5∶8.5，v/v）9.0 μL；95 ℃變性3 min，在ABI 3730XL測(cè)序儀上進(jìn)行分型檢測(cè)，讀取擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

將從ABI 3730XL測(cè)序儀上得到的結(jié)果在GeneMarker軟件上進(jìn)行分析，導(dǎo)出Excel基因型數(shù)據(jù)。用GenAlEx version 6.501軟件計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、香農(nóng)指數(shù)（I）、多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和近交系數(shù)（Fis）。用Powermarker軟件計(jì)算各群體間的遺傳距離。用UMPGA方法進(jìn)行聚類分析，繪制聚類圖。利用STRUCTURE 2.3.4進(jìn)行居群遺傳結(jié)構(gòu)分析，設(shè)置K=1～20，Burn-in周期為10000，MCMC設(shè)為100 000，每個(gè)K值運(yùn)行20次，并利用在線工具STRUCTURE HARVESTER算出最佳△K值。根據(jù)相應(yīng)的K值作圖。結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果圖用CLUMMP和DISTRUCT軟件繪制。根據(jù)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，在GenAlEx version 6.501軟件中計(jì)算遺傳分化系數(shù)（Fst）和基因流（Nm）。用GenAIex軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的多態(tài)性

利用熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)，從58對(duì)引物中篩選出15對(duì)峰型良好、特異性較高的引物。由表3可知，15對(duì)引物在119個(gè)樣本中共檢測(cè)出190個(gè)等位基因（Na），最少的5個(gè)，最多的19個(gè)，平均為12.667個(gè)。有效等位基因（Ne）數(shù)為2.772～9.743，平均為5.454。香農(nóng)指數(shù)（I）為1.277～2.456，平均為1.876。觀測(cè)雜合度（Ho）為0.437～0.897，平均為0.682。期望雜合度（He）為0.639～0.897，平均為0.762；多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）為0.602～0.889，平均為0.762。這些指標(biāo)均表明15對(duì)SSR引物多態(tài)性較高[13]。

2.2 聚類分析

基于遺傳距離進(jìn)行聚類，全部材料明顯分為兩大類群（圖1），第Ⅰ類群包含23份種質(zhì)，其中22份原產(chǎn)于廣西，僅1份為外地種質(zhì)（橫山梨，中國(guó)臺(tái)灣）；第Ⅱ類群包含96份種質(zhì)，其中廣西種質(zhì)49份，外地種質(zhì)47份。第Ⅱ類群可進(jìn)一步劃分為兩個(gè)亞群，亞群1由38份廣西種質(zhì)和1份外地種質(zhì)（云和粗花雪梨，產(chǎn)地：浙江云和）組成，亞群2由11份廣西種質(zhì)（灌陽(yáng)2號(hào)、龍勝2號(hào)、灌陽(yáng)清香梨、六月梨、富川蜜梨、銅板梨、全州蜜梨、龍勝糖梨、龍勝1號(hào)、灌陽(yáng)黃蜜、南山梨）和46份外地種質(zhì)組成，說(shuō)明這11份廣西種質(zhì)與外地種質(zhì)的親緣關(guān)系較近。以上結(jié)果表明廣西種質(zhì)可大致劃分為3種類型；總體上，廣西種質(zhì)和外地種質(zhì)既形成了相對(duì)獨(dú)立的類群，又存在少量的相互交叉，大部分廣西種質(zhì)與外地種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

由表4可知，廣西居群的平均等位基因數(shù)（Na）為11.53，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為5.606，平均香農(nóng)指數(shù)（I）為1.894，均高于外地種質(zhì)，說(shuō)明廣西地方種質(zhì)的遺傳多樣性更為豐富；2個(gè)居群的觀測(cè)雜合度（Ho）均低于期望雜合度（He），F(xiàn)is＞0，說(shuō)明兩個(gè)居群內(nèi)均發(fā)生近緣交配。

利用Structure構(gòu)建119份梨種質(zhì)的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果顯示當(dāng)K=2時(shí)，ΔK為最大值，供試材料可分為2個(gè)不同群體。由圖2可知，群體1由45份外地梨（占比81.81%）和10份廣西梨（占比18.18%）構(gòu)成，這10份廣西梨為富川蜜梨、南山梨、灌陽(yáng)黃蜜、六月梨、桂花梨、龍勝糖梨、銅板梨、龍勝1號(hào)、灌陽(yáng)2號(hào)、全州蜜梨；群體2主要由61份廣西梨（占比93.75%）構(gòu)成，中國(guó)臺(tái)灣的橫山梨、浙江的云和粗花雪梨以及湖北選育的鄂梨2號(hào)也劃歸到群體2中，表明廣西梨和外地梨在遺傳結(jié)構(gòu)上有較大差別，與聚類分析結(jié)果對(duì)應(yīng)。

當(dāng)K=3時(shí)，供試材料被劃分為3個(gè)群體，原本歸屬群體2的19份廣西梨（灌陽(yáng)小把子雪梨、灌陽(yáng)大把子雪梨、米珠山假雪梨、資源1號(hào)、黃皮梨、興安梨、清水梨、早禾梨、龍勝大砂梨、灌陽(yáng)清香梨、牛卵梨、資源3號(hào)、荔浦黃皮糖梨、岑溪墨煙梨、岑溪沙梨、永福青皮梨、永福橢圓形早禾梨、永福圓形早禾梨、平樂(lè)糖梨）以及外地的鄂梨2號(hào)被重新劃分到群體3中。

當(dāng)K=4時(shí)，供試材料被劃分為4個(gè)群體，原本歸屬群體3的4份廣西梨（資源1號(hào)、資源3號(hào)、興安梨、龍勝大砂梨）和原本歸屬群體1的4份外地梨（六月酥、紅早酥、新梨7號(hào)、中梨4號(hào)）被重新劃分到群體4中，說(shuō)明廣西的資源1號(hào)、資源3號(hào)、興安梨、龍勝大砂梨和外地的六月酥、紅早酥、新梨7號(hào)、中梨4號(hào)有更多相同的遺傳組成。有意思的是，六月酥、紅早酥、新梨7號(hào)、中梨4號(hào)都具有早酥的遺傳背景，其中六月酥和紅早酥為早酥的芽變品種，新梨7號(hào)和中梨4號(hào)分別是以早酥為親本之一的二元交雜品種和三元雜交品種。由此推測(cè)廣西的資源1號(hào)、資源3號(hào)、興安梨、龍勝大砂梨與早酥有共同的遺傳來(lái)源。早酥是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所利用蘋果梨和身不知梨育成的早熟新品種，其母本蘋果梨，屬于白梨系統(tǒng)，是中國(guó)優(yōu)良梨品種之一，主產(chǎn)于吉林省延邊朝鮮族自治州，中國(guó)各地的蘋果梨都發(fā)源于此，其父本身不知梨，原產(chǎn)日本，親本不詳，被認(rèn)為是西洋梨與砂梨的自然雜交后代。

為深入了解廣西地方梨種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)行獨(dú)立的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。71份種質(zhì)在K=4時(shí)ΔK取得最大值，可劃分為4個(gè)群體（圖3），群體1包含37份材料，其地理來(lái)源有桂林、梧州、百色、柳州、賀州、欽州；群體2包含10份材料，其地理來(lái)源有桂林、梧州、來(lái)賓、河池、南寧；群體3包含10份材料，其地理來(lái)源有桂林、梧州；群體4包含14份材料，其地理來(lái)源有桂林、梧州、柳州。

2.4 主坐標(biāo)分析

利用GenAIex軟件對(duì)供試材料進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA），繪制出二維主坐標(biāo)散點(diǎn)圖（圖4），從圖中可以看出，在主坐標(biāo)1方向上，整個(gè)群體清晰地分為2個(gè)組群，廣西材料和外地材料分別聚集成簇，同時(shí)也存在少量的相互滲透，說(shuō)明二者之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但有一定的基因交流。另外，部分材料的坐標(biāo)位置幾乎重疊，比如鄂梨2號(hào)和灌陽(yáng)清香（廣西灌陽(yáng)）；岑溪煙墨梨（廣西岑溪）、岑溪沙梨（廣西岑溪）、牛卵梨（廣西岑溪）和永福橢圓形早禾梨（廣西永福）；灌陽(yáng)大把子雪梨（廣西灌陽(yáng)）、灌陽(yáng)小把子雪梨（廣西灌陽(yáng)）和黃皮梨（廣西樂(lè)業(yè)），與聚類樹結(jié)果相吻合，證明它們的親緣關(guān)系很近。結(jié)合地理位置來(lái)看，廣西材料在圖中的分布未表現(xiàn)明顯的地域性特征。

2.5 分子方差分析

AMOVA方差分析（表5）表明，119份梨種質(zhì)的遺傳變異，8%存在于群體間，10%存在于個(gè)體間，82%存在于個(gè)體內(nèi)，個(gè)體內(nèi)差異是指由雜合的等位基因引起的遺傳差異，大小與個(gè)體雜合位點(diǎn)數(shù)相關(guān)，即個(gè)體的遺傳多樣性，說(shuō)明個(gè)體內(nèi)各基因之間存在高度遺傳分化，個(gè)體的遺傳變異是梨變異的主要來(lái)源。

3 討 論

梨屬植物間不存在生殖隔離，種間雜交十分普遍，使得梨屬種間有時(shí)缺乏明顯可以區(qū)分的形態(tài)學(xué)性狀，導(dǎo)致梨屬植物的分類比較混亂[3]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，可以較好地彌補(bǔ)、修正和完善梨?zhèn)鹘y(tǒng)分類中的一些不足。引物的多態(tài)性是評(píng)估種質(zhì)多樣性的重要因素，筆者在本研究中使用的15個(gè)SSR標(biāo)記的PIC全部大于0.50，多態(tài)性較高，可以較好地反映梨種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系[14]。I和Ho是衡量種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要指標(biāo)[15]。在本研究中，廣西地方梨種質(zhì)的I和Ho均高于外地種質(zhì)，反映出廣西地方梨種質(zhì)較高的遺傳多樣性。相關(guān)研究認(rèn)為梨起源于中國(guó)西南部的山區(qū)[2]，北上向東移動(dòng)，形成了東亞種群，中國(guó)白梨、中國(guó)砂梨和日本梨可能起源于共同的野生砂梨祖先[16]。廣西可能是梨的起源地之一或早期傳播地區(qū)，在長(zhǎng)期的環(huán)境適應(yīng)下逐漸形成了不同遺傳信息的群體。基于Neis的遺傳距離構(gòu)建的聚類樹中，廣西梨被劃分為3個(gè)聚群，而外地梨主要?dú)w于1個(gè)聚群，同時(shí)二者又有一定的相互交叉，表明存在基因交流。筆者在本研究中關(guān)注的廣西梨種質(zhì)基本為砂梨類型，外地種質(zhì)主要為經(jīng)人工馴化選擇或雜交獲得的栽培梨，與前者相比，后者具有更多地從早期適應(yīng)發(fā)生時(shí)積累的多種遺傳變異，因此在聚類關(guān)系上表現(xiàn)為二者的遺傳距離較遠(yuǎn)。值得注意的是，中國(guó)臺(tái)灣的橫山梨以及浙江云和的云和粗花梨并沒(méi)有與其他外地種質(zhì)聚在一類，而是與大部分廣西梨種質(zhì)聚在一起，并且在群體結(jié)構(gòu)分析和PCoA分析中也獲得相似的結(jié)果，表明橫山梨和云和粗花梨與廣西梨有較近的親緣關(guān)系，很可能是從廣西引種到臺(tái)灣和浙江的。另?yè)?jù)文獻(xiàn)記載，中國(guó)臺(tái)灣梨系1890年由我國(guó)香港和華南一帶引入種植于臺(tái)灣漢溪、橫山一帶，主要為橫山梨[17]，在一定程度上印證了本文的結(jié)果。廣西的灌陽(yáng)2號(hào)、龍勝2號(hào)、灌陽(yáng)清香梨、六月梨、富川蜜梨、銅板梨、全州蜜梨、龍勝糖梨、龍勝1號(hào)、灌陽(yáng)黃蜜、南山梨與外地種質(zhì)聚在一起，同時(shí)群體結(jié)構(gòu)分析和PCoA分析也呈現(xiàn)相似的分組結(jié)果，提示這些材料可能是由外地梨種質(zhì)雜交獲得的或引種到廣西而被誤認(rèn)為是廣西地方種。

梨是典型的自交不親和性物種，后代的繁殖依靠異花授粉[18]，這種授粉特性增加了居群間的雜交概率，因此具有較高的雜合特性。在本研究中，廣西居群和外地居群的觀測(cè)雜合度（Ho）均低于期望雜合度（He），且Fis＞0，居群內(nèi)發(fā)生近緣交配。近緣交配是一種非隨機(jī)交配，如果一個(gè)群體持續(xù)進(jìn)行近緣交配，那么該群體中的雜合子會(huì)快速丟失[19]。在主坐標(biāo)分析圖中，廣西梨種質(zhì)沒(méi)有很明顯地被分為多個(gè)類群，也反映出廣西梨品種在形成過(guò)程中，或許雜交較為普遍，導(dǎo)致許多供試地方梨種質(zhì)資源遺傳組成比較復(fù)雜。本研究中的119份梨的遺傳變異8%存在于群體間，10%存在于個(gè)體間，82%存在于個(gè)體內(nèi)，說(shuō)明梨居群間的遺傳分化程度較低，遺傳變異主要來(lái)源于居群內(nèi)的個(gè)體。多個(gè)內(nèi)外因素可影響居群遺傳結(jié)構(gòu)，其中基因流、突變和演替階段等會(huì)顯著影響居群遺傳結(jié)構(gòu)[19]。當(dāng)基因流Nm＞1時(shí)，說(shuō)明居群間的基因流較大，居群間遺傳分化程度較低；當(dāng)Nm＜1時(shí)，說(shuō)明居群間的基因流較小，居群間遺傳分化程度較高[20]。在本研究中，居群間的Nm=5.717（Nm＞1），基因流主要發(fā)揮均質(zhì)化作用，較大的基因流有效地阻止了遺傳漂變，降低了梨居群間的遺傳分化程度，頻繁的基因流使得梨種群間的遺傳分化程度低，因此變異主要存在于居群個(gè)體內(nèi)。

梨育種的核心基礎(chǔ)就是收集足夠多具有遺傳多樣性的種質(zhì)資源。種質(zhì)資源是品種改良的基礎(chǔ)，尤其是具有廣泛遺傳基礎(chǔ)的品種資源[21]。胡春云[22]認(rèn)為我國(guó)西南地區(qū)擁有最豐富的原始品種資源，是我國(guó)砂梨品種的起源中心。筆者在本研究中收集的71份廣西地方梨種質(zhì)遺傳多樣性豐富，品種間遺傳距離大，涵蓋了廣西主要梨生產(chǎn)區(qū)，具有一定代表性，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析將其分為4個(gè)群體，但不同群體未表現(xiàn)明顯的區(qū)域分化，下一步可采集一些廣西鄰省如云南、貴州等地原產(chǎn)的梨種質(zhì)資源，以便加深對(duì)廣西梨種質(zhì)的來(lái)源及傳播的了解。此外，利用分子標(biāo)記結(jié)合數(shù)量性狀指標(biāo)可以更全面地反映種質(zhì)資源間的差異，張瑩等[23]對(duì)梨種質(zhì)資源果實(shí)若干數(shù)量性狀評(píng)價(jià)指標(biāo)研究的結(jié)果表明，果實(shí)中可滴定酸含量的變異系數(shù)最大，更能體現(xiàn)梨品種間的差異。因此，后續(xù)可進(jìn)一步研究廣西梨種質(zhì)資源的數(shù)量性狀指標(biāo)，以便對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。隨著日益加快的城市化進(jìn)程，地方品種會(huì)加速流失[24]。而地方品種中可能含有許多有價(jià)值的基因，如特殊性狀基因、抗病蟲基因、抗逆基因等，這些基因在以選擇少數(shù)理想性狀為目標(biāo)的栽培品種中可能已經(jīng)丟失[25]。因此，筆者建議各方要重視地方種質(zhì)資源保護(hù)，在有條件的情況下，實(shí)行就地保護(hù)或建立種質(zhì)資源圃進(jìn)行遷地保護(hù)，避免一些特殊種質(zhì)的永久性流失。

4 結(jié) 論

廣西地方梨種質(zhì)具有較豐富的遺傳多樣性，與供試的外地種質(zhì)形成2個(gè)不同的遺傳群體，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但二者存在一定的基因交流，此外，兩個(gè)居群內(nèi)普遍存在近緣交配，變異的主要來(lái)源為居群內(nèi)個(gè)體的遺傳變異。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明廣西地方種質(zhì)可劃分為4個(gè)群體，但不同群體未呈現(xiàn)明顯的區(qū)域分化規(guī)律，后續(xù)可結(jié)合不同的個(gè)體性狀進(jìn)行深入探究。值得注意的是，中國(guó)臺(tái)灣的橫山梨以及浙江的云和粗花梨或許原產(chǎn)于廣西，一部分廣西本地梨也可能是外地梨種質(zhì)雜交獲得或引種到廣西，有待進(jìn)一步印證。

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