羅聰 鐘崛 鄧敏敏 肖瀟 黃丹霞 范慧 王盼

摘要? 目的：探討田薊苷（TIL）對腦出血（ICH）大鼠認知功能、神經(jīng)元損傷及腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）/沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）/過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（PGC1α）信號通路的影響。方法：采用Ⅳ型膠原酶注射法構建ICH大鼠模型，將造模成功的ICH大鼠隨機分為模型組（ICH組）、TIL組（16 mg/kg）、AMPK抑制劑組（Compound C組，250 μg/kg）、TIL＋AMPK抑制劑組（TIL＋Compound C組），另設假手術組（Sham組），每組12只。采用改良的Garcia JH法、Morris水迷宮實驗和敞箱實驗評價大鼠的神經(jīng)功能和認知功能；蘇木素-伊紅（HE）和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）法行腦組織病理學和神經(jīng)元凋亡觀察；蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測AMPK/SIRT1/PGC1α通路蛋白表達。結果：與Sham組相比，ICH組大鼠腦組織出現(xiàn)細胞核皺縮、排列紊亂等損傷，神經(jīng)功能評分、穿越平臺次數(shù)、垂直活動得分和水平活動得分、磷酸化AMPK（p-AMPK）/AMPK、SIRT1、PGC1α蛋白水平均明顯下降（P＜0.05），找尋平臺時間、神經(jīng)元凋亡率、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表達水平均明顯增加（P＜0.05）；與ICH組相比，TIL組大鼠腦組織損傷減輕，神經(jīng)功能評分、穿越平臺次數(shù)、垂直活動得分和水平活動得分、p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1α蛋白水平均明顯增加（P＜0.05），找尋平臺時間、神經(jīng)元凋亡率、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）；而Compound C組大鼠以上指標呈現(xiàn)相反的趨勢。且TIL對ICH大鼠腦組織及認知功能的保護作用均被AMPK抑制劑Compound C減弱（P＜0.05）。結論：TIL可能通過激活AMPK/SIRT1/PGC1α通路，改善ICH大鼠認知功能，減輕神經(jīng)元損傷。

關鍵詞? 腦出血；田薊苷；腺苷酸激活蛋白激酶/沉默調(diào)節(jié)蛋白1/過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α通路；認知功能；神經(jīng)元；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.012

Influences of Tilianin? on Cognitive Function and Neuronal Damage in Rats with Cerebral Hemorrhage

LUO Cong， ZHONG Jue， DENG Minmin， XIAO Xiao， HUANG Danxia， FAN Hui， WANG Pan

Wuhan Sixth Hospital， Wuhan 430015， Hubei， China

Corresponding Author? ZHONG Jue，? E-mail： zhongjue1985@163.com

Abstract? Objective：To investigate the influences of tilianin（TIL） on cognitive function and neuronal damage?? in rats with intracerebral hemorrhage（ICH）.Methods：The ICH rat model was established by Ⅳ collagenase injection.The successful modeling ICH rats were randomly dvided into model group（ICH group），TIL group（16 mg/kg），AMP-activated protein kinase（AMPK） inhibitor group （Compound C group，250 μg/kg），TIL＋AMPK inhibitor group （TIL＋Compound C group），and sham operation group（Sham group），with 12 rats in each group.The neurological and cognitive functions of rats were evaluated by modified Garcia JH method，Morris water maze test，and open-box test.The brain histopathology and neuronal apoptosis were observed by hematoxylin-eosin（HE） and Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling（TUNEL） staining.The expression of AMPK/Sirtuin type 1（SIRT1）/peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α （PGC1α） pathway proteins was measured by Western Blot.Results：Compared with Sham group，nucleus shrinkage disordered arrangement and other damages was observed in the rat brain tissue，the neurological score，platform crossing times，vertical activity score，horizontal activity score，and phosphorylated AMPK（p-AMPK）/AMPK，SIRT1，PGC1α protein levels decreased obviously（P＜0.05），the searching platform time，neuron apoptosis rate，and Caspase-3，Bcl-2 protein levels of ICH group increased obviously（P＜0.05）.Compared with ICH group，the brain tissue damage of TIL group? reduced，the neurological deficit score，platform crossing times，vertical activity score，horizontal activity score，and p-AMPK/AMPK，SIRT1，PGC1α protein levels? increased obviously（P＜0.05），the searching platform time，neuron apoptosis rate，and Caspase-3，Bcl-2 protein levels? decreased obviously（P＜0.05）.The above indicators in Compound C group showed the opposite trends.The protective effects of TIL for brain tissue and cognitive function of ICH rats were attenuated by AMPK inhibitor Compound C（P＜0.05）.

Conclusion：TIL may improve cognitive function and reduce neuronal damage in ICH rats by activating AMPK/SIRT1/PGC1α pathway.

Keywords? ?intracerebral hemorrhage; tilianin; AMP-activated protein kinase/Sirtuin type 1/peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α pathway; cognitive function; neuron; experimental study

基金項目? 武漢市醫(yī)學科研項目（No.WX21Q15）

作者單位? 1.武漢市第六醫(yī)院（武漢 430015）；2.武漢市第三醫(yī)院（武漢 430061）

通訊作者? 鐘崛，E-mail：zhongjue1985@163.com

引用信息? 羅聰，鐘崛，鄧敏敏，等.田薊苷調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/PGC1α信號通路對腦出血大鼠認知功能和神經(jīng)元損傷的影響［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（2）：274-279.

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是以腦部自發(fā)性和非創(chuàng)傷性出血為特征的腦卒中類型，具有較高的發(fā)病率和死亡率［1］。目前，神經(jīng)外科醫(yī)生已采用各種醫(yī)療和手術方式來預防和治療該疾病，然而成功率并不理想［2］。田薊苷（Tilianin，TIL）是香青蘭總黃酮中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化和抑制神經(jīng)元凋亡等作用，已應用于對動脈粥樣硬化的防治［3］。研究發(fā)現(xiàn)，TIL可能對腦缺血再灌注損傷具有保護作用［4］。而TIL是否對ICH大鼠也有一定治療作用的研究較少。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是代謝功能的中心調(diào)節(jié)劑，包括脂質(zhì)代謝和線粒體功能，AMPK通過其在蘇氨酸172處的磷酸化而被激活，發(fā)揮神經(jīng)保護作用［5］。報道稱，激活AMPK/沉默調(diào)節(jié)蛋白1（SIRT1）通路可以在ICH病理過程中發(fā)揮神經(jīng)保護作用［6］。因此，本研究構建ICH大鼠模型，觀察TIL對ICH大鼠認知功能和神經(jīng)元損傷的影響，并初步探究AMPK/SIRT1/過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α（PGC1α）通路在其中的作用。

1? 材料與方法

1.1? 實驗動物

無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠，體質(zhì)量260～275 g，7周齡，購自廣東南模生物科技有限公司，動物許可證號SCXK（粵）2022-0062。本實驗得到醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.2? 主要試劑及儀器

TIL（貨號：SND-1786），由滁州仕諾達生物科技有限公司生產(chǎn)；AMPK抑制劑Compound C（貨號：HY-145432），購自MCE公司；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）神經(jīng)元凋亡檢測試劑盒（貨號：FS-79507），購自上海撫生實業(yè)有限公司；AMPK（貨號：ab32112）、磷酸化AMPK（p-AMPK）（貨號：ab133448），購自美國abcam公司；SIRT1（貨號：9475）、PGC1α（貨號：ab544481）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（貨號：9661）、促凋亡基因（Bax）（貨號：2774），購自英國Biorbyt公司。

熒光顯微鏡（貨號：FMA-04），購自香港友誠生物科技有限公司；石蠟切片機（貨號：S700/S700A），購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.3? ICH模型的構建及分組

ICH模型構建參照文獻［7-8］，通過將Ⅳ型膠原酶注射到大腦紋狀體區(qū)來建立。假手術組（Sham組）手術過程同ICH模型，用生理鹽水代替Ⅳ型膠原酶。共造模成功48只ICH大鼠。隨機將造模成功的48只大鼠分為4個處理組，分別為模型組（ICH組）、TIL組、AMPK抑制劑組（Compound C組）、TIL＋AMPK抑制劑組（TIL＋Compound C組），每組12只。另設Sham組12只。TIL組灌胃16 mg/kg TIL，Compound C組尾靜脈注射250 μg/kg Compound C［9］，ICH＋TIL組在灌胃TIL前15 min尾靜脈注射250 μg/kg Compound C，Sham組和ICH組給予等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)7 d。

1.4? 神經(jīng)功能評分

末次灌胃TIL后，采用改良的Garcia JH法評價大鼠的神經(jīng)功能。神經(jīng)行為研究包括以下6項測試內(nèi)容：自發(fā)活動、四肢運動的對稱性、前爪伸展、攀爬、身體本體感覺和對觸須觸摸的反應。神經(jīng)系統(tǒng)評分最低為3分，最高為18分，評分越低表明神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.5? Morris水迷宮實驗

在1.4項完成后，進行Morris水迷宮實驗。在水池里放1個平臺，標上記號，記錄大鼠從進入水池到找到平臺所花費的時間，連續(xù)記錄4 d。完成后，撤去平臺，記錄大鼠120 s內(nèi)經(jīng)過原平臺的次數(shù)。

1.6? 敞箱實驗

在1.5項完成后，將大鼠放入敞開的箱子內(nèi)，以大鼠雙腳離開底面直立次數(shù)為垂直活動得分，以大鼠3只腳跨入鄰格的次數(shù)記為水平活動得分，測定10 min內(nèi)兩種得分情況。

1.7? 標本采集

在1.6項完成后，麻醉處死，每組取6只大鼠的出血部位腦組織固定于4%多聚甲醛中，剩余大鼠的出血部位腦組織儲存于－80 ℃。

1.8? 腦組織病理學變化

腦組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后，脫水、包埋、切成5 μm左右的石蠟切片，用蘇木素-伊紅（HE）染色后在光學顯微鏡下觀察。

1.9? TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡情況

按照TUNEL神經(jīng)元凋亡檢測試劑盒產(chǎn)品說明書進行。在熒光顯微鏡下觀察腦神經(jīng)元凋亡情況，凋亡神經(jīng)元呈綠色熒光。

1.10? 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測AMPK/SIRT1/PGC1α蛋白表達

用RIPA裂解緩沖液提取腦組織總蛋白，將蛋白質(zhì)進行變性、定量、電泳、轉膜，將膜室溫封閉2 h后分別加入一抗AMPK（1∶1 000）、p-AMPK（1∶2 000）、SIRT1（1∶2 000）、p-SIRT1（1∶2 000）、PGC1α（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育2 h，加入電化學發(fā)光（ECL）試劑檢測蛋白質(zhì)印跡。使用Image LabTM軟件分析目標蛋白的灰度值。

1.11? 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用SNK-q檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結? 果

2.1? 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

與Sham組相比，ICH組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低（P＜0.05）；與ICH組相比，TIL組大鼠神經(jīng)功能評分明顯升高（P＜0.05），Compound C組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低（P＜0.05）；與TIL組相比，TIL＋Compound C組大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2? Morris水迷宮實驗結果

與Sham組相比，ICH組大鼠找尋平臺時間明顯延長（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與ICH組相比，TIL組大鼠找尋平臺時間明顯縮短（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)明顯增加（P＜0.05），Compound C組大鼠找尋平臺時間明顯延長（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與TIL組相比，TIL＋Compound C組大鼠找尋平臺時間明顯延長（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)明顯減少（P＜0.05）。詳見表2。

2.3? 敞箱實驗結果

與Sham組相比，ICH組大鼠垂直活動得分和水平活動得分均明顯降低（P＜0.05）；與ICH組相比，TIL組大鼠垂直活動得分和水平活動得分均明顯升高（P＜0.05），Compound C組大鼠垂直活動得分和水平活動得分均明顯降低（P＜0.05）；與TIL組相比，TIL＋Compound C組大鼠垂直活動得分和水平活動得分均明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.4? HE染色結果

Sham組大鼠腦組織結構清晰，細胞排列整齊，無異?，F(xiàn)象；與Sham組相比，ICH組大鼠腦組織出現(xiàn)細胞核皺縮、細胞數(shù)量減少、排列紊亂等損傷；TIL組細胞排列較ICH整齊，腦組織結構趨于Sham組；Compound C組細胞排列最亂，腦組織損傷最重；TIL＋Compound C組細胞減少且排列紊亂，腦組織結構與ICH組相似。詳見圖1。

2.5? 各組大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡情況比較

與Sham組相比，ICH組腦組織神經(jīng)元凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與ICH組相比，TIL組腦組織神經(jīng)元凋亡率明顯下降（P＜0.05），Compound C組腦組織神經(jīng)元凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與TIL組相比，TIL＋Compound C組腦組織神經(jīng)元凋亡率明顯升高（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6? 各組大鼠腦組織AMPK/SIRT1/PGC1α通路蛋白表達水平比較

與Sham組相比，ICH組大鼠腦組織p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1α蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05），Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與ICH組相比，TIL組大鼠腦組織p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1α蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Compound C組大鼠腦組織p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1α蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05），Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與TIL組相比，TIL＋Compound C組大鼠腦組織p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1α蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05），Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

3? 討? 論

ICH是預后最差的腦卒中類型［10］。58%的ICH病人在1年內(nèi)死亡，66.7%的幸存者處于中度甚至重度殘疾狀態(tài)［11-12］。因此，探究ICH的發(fā)病機制，可能為尋找ICH新藥物提供方向。本研究通過注射Ⅳ型膠原酶構建ICH模型，發(fā)現(xiàn)ICH組大鼠腦組織出現(xiàn)細胞核皺縮、細胞排列紊亂等損傷，神經(jīng)功能評分、穿越平臺次數(shù)、垂直活動得分和水平活動得分明顯降低，找尋平臺時間明顯延長，提示ICH模型構建成功。TIL是香青蘭總黃酮中含量最高的成分，可通過減輕脂質(zhì)沉積和炎癥反應，對動脈粥樣硬化起到一定改善作用［13］。既往研究發(fā)現(xiàn)，TIL可以促進腦血管新生，對腦組織起到一定保護作用［4］。本研究結果顯示，TIL可明顯減輕ICH大鼠腦組織損傷，提高神經(jīng)功能評分、穿越平臺次數(shù)、垂直活動得分和水平活動得分，縮短大鼠找尋平臺的時間，提示TIL可能減輕ICH大鼠腦損傷，并對其認知功能起到積極改善作用。

神經(jīng)元凋亡在ICH后繼發(fā)性腦損傷的病理生理過程中起關鍵作用［14］。Caspase-3、Bcl-2等凋亡蛋白是細胞凋亡的關鍵效應物，可反映細胞凋亡程度。Huang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，促進神經(jīng)元凋亡會加重ICH損傷。Li等［16］研究發(fā)現(xiàn)，抑制神經(jīng)元凋亡可以對ICH起到一定保護作用。本研究結果顯示，ICH大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率以及Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，而TIL可以明顯降低神經(jīng)元凋亡率以及Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平，表明TIL可能對ICH大鼠神經(jīng)元損傷起到一定修復作用。

AMPK作為細胞能量傳感器，是調(diào)節(jié)生物能量代謝的關鍵分子，活化后可上調(diào)SIRT1、PGC1α的表達并增加其活性，進而在線粒體生物合成、能量代謝和氧化應激中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［17-18］。AMPK/SIRT1/PGC1α通路的激活有利于維持神經(jīng)元的氧化還原平衡，保護神經(jīng)元氧化應激、衰老等誘導的凋亡［19］。Xu等［20］研究發(fā)現(xiàn)，通過激活AMPK通路可以減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血造成的大鼠腦損傷，改善神經(jīng)功能受損情況。本研究結果顯示，ICH組大鼠腦組織p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1α水平明顯下降，表明ICH大鼠可能通過調(diào)節(jié)AMPK/SIRT1/PGC1α信號通路加重認知功能障礙和神經(jīng)元損傷；而TIL組p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1α水平明顯升高，表明TIL可能通過抑制AMPK/SIRT1/PGC1α信號通路減輕認知功能障礙和神經(jīng)元損傷。為了驗證推測，本實驗利用AMPK抑制劑Compound C進行干預，結果顯示，與TIL組相比，TIL＋Compound C組大鼠認知功能變差，腦組織神經(jīng)元凋亡率、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平均明顯增加，p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1α蛋白表達水平均明顯下降，進一步證實TIL可能通過抑制AMPK/SIRT1/PGC1α信號通路對ICH大鼠的認知功能和神經(jīng)元起到保護作用。

綜上所述，TIL可能通過抑制AMPK/SIRT1/PGC1α信號通路來減輕ICH大鼠的認知功能障礙和神經(jīng)元損傷。然而，黃酮類藥物是否都有此類功效，需要進一步探究。

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（收稿日期：2022-08-11）

（本文編輯王麗）