單治國　馬劍　滿紅平　劉麗　張春花

小粒種咖啡是指咖啡豆粒徑較小、產(chǎn)量較低的咖啡品種，主要分布于非洲、亞洲、南美洲等地區(qū)。由于生長環(huán)境、種植條件、加工工藝等方面的差異，小粒種咖啡的品質(zhì)也存在著較大的差異，因此，建立一種全面、客觀、有效的咖啡品質(zhì)控制方法，對于保障小粒種咖啡的品質(zhì)和消費者利益具有重要意義。

色譜指紋圖譜技術(shù)是一種以色譜為基礎(chǔ)，結(jié)合指紋圖譜的理念，對復(fù)雜樣品進行全面、準確分析的方法，具有高分辨率、高靈敏度、高重復(fù)性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域的質(zhì)量控制中。近年來，有研究者將化學(xué)指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于咖啡品質(zhì)控制中，通過比較不同咖啡樣品的色譜圖，可以對咖啡中的化學(xué)成分進行分析和比較。本文旨在探討基于色譜指紋圖譜技術(shù)的小粒種咖啡質(zhì)量控制方法，以期為提高小粒種咖啡品質(zhì)提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

一、儀器與試劑

1.主要儀器。高效液相色譜儀，型號為Agilent100；色譜柱，型號為ODS，規(guī)格為5μm；1/1萬電子分析天平，型號為BP135S；1/10萬電子分析天平，型號為BP33S；數(shù)控超聲波清洗器，型號為KG-250OE；電熱恒溫水浴鍋，型號為XNCF-3000。

2.試劑和樣品。試劑：甲醇、乙腈、甲酸、磷酸、磷酸二氫鈉，甲醇和乙腈為色譜純，其余均為分析純。小粒種咖啡實驗用對照品：咖啡酸（質(zhì)量分數(shù)為99.7%）、阿魏酸、木犀草素、單咖啡酞。實驗用水：娃哈哈純凈水。10批小粒種咖啡樣品：5批（S1-S5）為小粒種咖啡，4批（Z1-Z4）為混偽品野生小粒種咖啡，1批（R）為優(yōu)異小粒種咖啡。10批次樣品均用封口袋盛裝，置于干燥器中備用。

二、實驗與方法

1.對照品溶液的制備?？Х人帷⑽核?、木犀草素和單咖啡酞各稱取0.5g置于5mL量瓶中，向其中添加甲醇，使樣品完全溶解。依次制得質(zhì)量濃度為0.7856mg/mL、0.9085mg/mL、0.8511mg/mL、0.2182mg/mL的標準溶液。吸取以上四個標準品各2mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋，定容，混合均勻，制得咖啡酸為0.1571mg/mL、阿魏酸為0.1817mg/mL、木犀草素為0.4256mg/mL、單咖啡酞為0.0218mg/mL。

2.供試品溶液的制備。將10批小粒種咖啡試樣粉碎成粉后過四號篩，各取0.5g放入10個有塞的錐形瓶中，加入甲醇，將其定容到5mL容量瓶中。在100kHz下超聲波萃取40min，在室溫下冷卻，用0.45mm的微孔濾膜過濾，取出濾液，最后得到濃度為0.69mg/mL的供試品溶液。

3.色譜條件。采用梯度洗脫方法進行洗脫，所使用的流動相為0.1%甲醇（A）和乙腈（B），柱溫為250℃，流速為1.0mL/min，檢測波長為360nm，進樣量為10μL。

4.建立小粒種咖啡色譜指紋圖譜。制備10批小粒種咖啡溶液，利用高效液相色譜儀對其進行色譜分析，生成小粒種咖啡色譜圖。將獲得的色譜信息輸入到指紋圖譜評估體系，以小粒種咖啡R批為基準，設(shè)定時間窗口寬度0.1min，采用中值方法進行多點修正，得到指紋圖譜。

5.小粒種咖啡含量測定。通過高效液相色譜法生成小粒種咖啡的指紋圖譜后，仍然無法有效區(qū)分小粒種咖啡與混偽品野生小粒種咖啡，因此需要對兩者指紋圖譜中指認的4個共有成分進行含量測定，為小粒種咖啡的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

（1）線性關(guān)系。每次選取5μL，以待測化合物的峰面積和對照品的濃度進行線性回歸，前者為縱坐標，后者為橫坐標，通過逐漸增加對照品溶液的濃度，記錄峰面積和濃度數(shù)據(jù)，運用線性回歸分析確定峰面積和濃度之間的線性關(guān)系，最終確定保持良好直線性質(zhì)的濃度范圍，據(jù)此得到各成分的標準曲線，如表1所示。由表1可知，各成分之間的線性關(guān)系良好，可進行后續(xù)操作。

（2）含量測定。將所需要的咖啡酸、阿魏酸、木犀草素和單咖啡酞4種成分的含量作為變量，測定5批小粒種咖啡和4批混偽品野生小粒種咖啡。以9批小粒種咖啡樣品和9個共有峰的峰面積為變量，利用組間連接法對樣品進行CA，結(jié)果見圖1。利用主成分分析（PCA）將9批小粒種咖啡樣品的共有峰峰面積進行標準化處理，在此基礎(chǔ)上，以所測各成分的含量作為自變量，利用各成分間的線性關(guān)系對各成分進行主成分分析。

三、結(jié)果與分析

1.指紋圖譜結(jié)果分析。10批小粒種咖啡樣品的對照色譜指紋圖譜如圖2所示。由圖2可知，R為小粒種咖啡對照圖譜，最終確定了9個共有峰。對比對照品溶液的色譜圖，在色譜指紋圖譜共有峰中共指認出4個成分，2號峰為咖啡酸、4號峰為阿魏酸、5號峰為木犀草素、7號峰為單咖啡酞。綜合發(fā)現(xiàn)，本次實驗選取的小粒種咖啡和優(yōu)良小粒種咖啡色譜圖大體上相似。

2.相似度結(jié)果分析。當相似度越接近1，說明兩個色譜越相似。將對照圖譜與10批小粒種咖啡樣品的色譜指紋圖譜進行相似度分析，結(jié)果見表2。由表2可知，小粒種咖啡相似度均大于0.940，表明本次實驗選取的小粒種咖啡與優(yōu)良小粒種咖啡的差異性不大，證明本次實驗選取的小粒種咖啡質(zhì)量好，建立的色譜指紋圖譜方法可用于小粒種咖啡的鑒別和整體的質(zhì)量控制。

3.含量測定結(jié)果分析。小粒種咖啡樣品的PCA得分圖如圖3所示。由圖3可知，5批小粒種咖啡和4批混偽品野生小粒種咖啡均含有咖啡酸、阿魏酸、木犀草素、單咖啡酞，對比兩者中的咖啡酸含量發(fā)現(xiàn)，小粒種咖啡所含咖啡酸的含量普遍高于混偽品野生小粒種咖啡，因此可以通過比較咖啡酸的含量，較好地區(qū)分小粒種咖啡和混偽品野生小粒種咖啡。

綜上所述，本研究所建立的基于色譜指紋圖譜技術(shù)的小粒種咖啡質(zhì)量控制方法，不僅簡便、準確，還能進行定性和定量雙重分析，為小粒種咖啡的質(zhì)量評價提供了參考依據(jù)。

基金項目：2022年度普洱市科技局普洱學(xué)院咖啡研究專項（2022KFZX03）。

作者簡介：單治國（1979-），男，漢族，山東兗州人，副教授，博士，主要研究方向為茶葉與咖啡科學(xué)技術(shù)。

張春花（1984-），女，彝族，云南瀘西人，副教授，博士，主要研究方向為茶葉與咖啡科學(xué)技術(shù)。