張紅梅 張 威 王 瓊 賈倩茹 孟 珊 熊雅文 劉曉慶 陳 新 陳華濤,,*

大豆籽粒Ve含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析

張紅梅1張 威1王 瓊1賈倩茹1孟 珊2熊雅文3劉曉慶1陳 新1陳華濤1,3,*

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 江蘇南京 210014;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所, 江蘇南京 210014;3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇南京 210095

維生素E (Ve)是大豆油中一種天然抗氧化劑, 是評價大豆油營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。本研究利用含有264份的大豆自然群體在2021年和2022年測定了籽粒中α-、γ-和δ-生育酚含量, 并進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study, GWAS)。本研究共檢測到199個與大豆Ve含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點, 其中9個可在2個環(huán)境或者2個性狀被重復(fù)檢測到, 分別位于3號、7號、11號、12號、13號、15號、17號和18號染色體上。其中位于7號染色體上的顯著關(guān)聯(lián)信號是控制α-生育酚含量的主效位點, 可在2年環(huán)境中被檢測到, 表型變異解釋率為9.83%。對該位點候選基因進(jìn)行篩選, 獲得一個編碼myb轉(zhuǎn)錄因子的基因, 可能是這個位點的效應(yīng)基因。另外, 在12號染色體上得到2個編碼γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的基因和, 有可能是影響Ve含量的重要基因。本研究結(jié)果有助于解析大豆籽粒Ve含量的遺傳基礎(chǔ)及其調(diào)控機(jī)制, 為大豆品質(zhì)遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

大豆; 籽粒; Ve含量; 全基因組關(guān)聯(lián)分析; 候選基因

維生素E (Ve)是人體必需的微量營養(yǎng)物質(zhì), 對維持人體正常生理活動具有重要作用。大豆籽粒中富含Ve, 為0.09%～0.28%。在植物體內(nèi)Ve主要以4種不同分子結(jié)構(gòu)和功能的生育酚(α-、β-、γ-和δ-生育酚)形式存在, 其中α-生育酚的生理活性最強(qiáng), γ-生育酚的抗氧化能力最強(qiáng), β-生育酚含量非常少, 一般忽略不計; β-、γ-和δ-生育酚的活性分別是α-生育酚的50%、10%和3%[1]。Ve是大豆油中一種天然抗氧化劑, 可用來保持油脂的風(fēng)味、延長油脂的儲藏時間, 是評價大豆油營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)。在許多發(fā)達(dá)國家, Ve每日推薦攝入量已從7～10 mg增加到15 mg[2], 而且在天然生育酚中只有α-生育酚能在人體內(nèi)被很好地吸收和代謝[3]。因此, 選育高Ve和α-生育酚的大豆品種是滿足大豆Ve市場需求的重要途徑[4-5]。

目前, 已發(fā)現(xiàn)多個大豆Ve生育酚含量相關(guān)的QTL。Dwiyanti等[6]利用KAS × Ichihime構(gòu)建的F2群體, 檢測到位于9號染色體上與α-生育酚含量相關(guān)的QTL位點區(qū)間Satt_167 (Gm09: 11,261,927～11,262,197)和Satt_243 (Gm09: 43,235,031～43,235,326)。利用此群體的剩余雜合系(F5-24), 發(fā)現(xiàn)位于9號染色體上與α-生育酚含量相關(guān)的QTL位點KSC138-17, 并且KSC138-17和Satt_243還與γ-生育酚和δ-生育酚含量相關(guān)[7]。Li等[8]采用144個株系的重組自交系(recombinant inbred lines, RIL), 利用107個多態(tài)性SSR標(biāo)記進(jìn)行QTL分析, 發(fā)現(xiàn)4個與生育酚含量相關(guān)的QTL, 分別位于14號、6號、2號和20號染色體上。張紅梅等[9]利用包含208個家系的大豆RIL群體, 共檢測到8個與維生素E相關(guān)的QTL位點, 分布在6條染色體上, 其中γ-生育酚與維生素E總含量相關(guān)位點QTL均位于20號染色體的Satt617～Satt001區(qū)間和Chr.01的Sat_346～Satt436區(qū)間。Shaw等[10]利用RIL群體在多年多點環(huán)境下, 采用復(fù)合區(qū)間作圖法定位到26個QTL與大豆維生素E及其組分相關(guān), 并且2年均檢測到與α-生育酚含量相關(guān)的QTL為位于Chr.15上的Satt117標(biāo)記。Park等[11]利用低α-生育酚含量的品系TK780和高含量品系B04009構(gòu)建大豆RIL群體為材料, 進(jìn)行大豆籽粒α-生育酚含量QTL分析, 2年重復(fù)鑒定到3個穩(wěn)定的QTL, 分別位于9號、11號和12號染色體上, 其中9號染色體上的(S09_ 43927286 /S09_44366371)與Dwiyanti等[6-7]檢測的α-生育酚含量相關(guān)QTL位于相鄰區(qū)間, 11號和12號染色體上的QTL是新發(fā)現(xiàn)的QTL。Knizia等[12]以Forrest和Williams 82構(gòu)建的大豆RIL群體為材料, 共得到32個與大豆籽粒生育酚含量相關(guān)QTL, 在6號染色體上鑒定到1個新的主效QTL, 對δ-、α-和總生育酚含量的表型變異解釋率分別為27.8%、9.9%和6.9%。Park等[13]利用大豆RIL群體, 通過連鎖分析, 在3年環(huán)境下, 分別在9號和14號染色體上檢測到控制大豆籽粒生育酚含量的2個QTL簇, 其中定位于9號染色體上的QTL簇對應(yīng)基因為(γ-TMT3), 調(diào)控γ-Toc向α-Toc的轉(zhuǎn)化; 定位于Chr.14的QTL簇對應(yīng)與甲基轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)的基因, 該基因可能調(diào)控δ-生育酚前體MPBQ向γ-生育酚前體DMPBQ的轉(zhuǎn)化。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)是在自然群體中檢測全基因組水平分子標(biāo)記基因型信息的基礎(chǔ)上, 開展群體中個體表型與基因型的相關(guān)性分析, 從而解析影響復(fù)雜性狀的基因變異, 具有高分辨率和高通量的優(yōu)勢。近年來, GWAS已廣泛應(yīng)用于大豆重要的農(nóng)藝性狀和復(fù)雜性狀的遺傳結(jié)構(gòu)解析[14-16]。Zhang等[17]利用高密度SNP圖譜, 對313份不同大豆種質(zhì)材料的蛋白質(zhì)、油脂、脂肪酸和氨基酸組成進(jìn)行了GWAS分析, 共鑒定出87個染色體區(qū)段與種子成分含量相關(guān), 解釋了8%～89%的遺傳變異。利用自然群體檢測大豆生育酚含量的關(guān)聯(lián)分析還比較少[18-19]。Yu等[20]利用來自中國國家大豆基因庫175份種質(zhì)資源的自然群體, 在3個種植地點, 采用6種分析方法, 定位到101個與α-、γ-、δ-和總生育酚含量相關(guān)的QTL。

在大豆籽粒Ve組分相關(guān)的QTL研究中, 因遺傳背景和環(huán)境條件的不同, 尚未檢測到不同環(huán)境條件下表現(xiàn)穩(wěn)定的QTL, 因此在多種環(huán)境和遺傳背景下檢測Ve含量相關(guān)QTL對于大豆遺傳育種十分重要。本研究利用264份大豆種質(zhì)資源材料, 對大豆籽粒Ve含量進(jìn)行遺傳分析, 檢測與α-、γ-和δ-生育酚和總生育酚含量(TVe)顯著相關(guān)的SNP位點, 挖掘優(yōu)異等位變異, 以期為大豆品質(zhì)育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

本試驗材料為264份中國大豆種質(zhì)資源, 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。材料包括212份育成品種和52份地方種, 主要來源于我國東北地區(qū)10個、黃淮海地區(qū)214個和南方地區(qū)40個[21]。于2021年和2022年夏季種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合試驗基地(32.50°N, 118.68°E), 采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計, 壟作栽培, 一壟2行, 壟距60 cm, 行長4 m, 株距13 cm, 每穴留苗2株, 2個行區(qū), 3次重復(fù)。田間管理按照一般大田管理進(jìn)行, 材料均能正常成熟, 收獲大豆籽粒。

1.2 大豆籽粒Ve含量檢測

每份材料選取10.00～15.00 g籽粒飽滿大小一致的大豆籽粒, 經(jīng)樣品研磨儀(FOSS, Knifetec 1095) 60 s粉碎, 稱取0.2 g粉碎后的豆粉樣品, 加入維生素C (Vc) 0.05 g和4 mL 80%乙醇溶液混勻, 低溫水浴超聲30 min; 然后, 加入8 mL正己烷溶液; 最后, 低溫水浴超聲30 min, 離心, 取上清, 過0.22 μm有機(jī)相濾膜, 放入–20℃冰箱待上機(jī)檢測。

利用高效液相色譜技術(shù)(HPLC), 采用外標(biāo)法對維生素E生育酚各異構(gòu)體進(jìn)行定量分析。色譜柱為DIKMA公司產(chǎn)品, 色譜柱填料為symmetry, 鉆石C18, 5 μm, 柱規(guī)格為250.0 mm×4.6 mm; 熒光檢測器激發(fā)波長290 nm, 發(fā)射波長300 nm; 流動相為甲醇, 流速1.0 mL min–1; 柱溫35℃; 進(jìn)樣量20 μL; 檢測時間10 min。以α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚峰面積代入回歸方程= 1160.8+ 5057.3 (2=1)進(jìn)行定量分析。Ve總生育酚(TVe)含量為α-、γ-、δ-生育酚含量值之和。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SAS 9.13軟件進(jìn)行方差分析、描述性統(tǒng)計分析、相關(guān)性分析; 使用ORIGIN軟件繪制柱狀分布圖。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

本研究用于全基因組關(guān)聯(lián)分析的自然群體SNP標(biāo)記物理圖譜來自前期的重測序工作, 共2,597,425個, 該群體的連鎖不平衡衰減區(qū)間為120 kb, 具體群體結(jié)構(gòu)分析見本實驗室的研究報道[21]。

將基因型、2年表型平均值、Q矩陣和K矩陣導(dǎo)入Tassel 5.0后, 進(jìn)行混合線性模型(mixed linear model, MLM)的全基因組關(guān)聯(lián)分析。在關(guān)聯(lián)分析過程中計算獲得每個SNP位點的值和2。將顯著性閾值設(shè)置為–log10()≥5.0, 使用R語言將GWAS分析結(jié)果繪制成曼哈頓圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆籽粒Ve含量的表型分析

對2021年和2022年264份大豆種質(zhì)資源籽粒α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和TVe含量表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 分別統(tǒng)計了平均值、變幅和變異系數(shù)等。結(jié)果表明, 2021年α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和TVe含量的變化范圍分別為5.62～40.26 μg g–1、56.69～269.85 μg g–1、4.53～35.04 μg g–1和75.69～ 321.98 μg g–1, 平均值分別為20.22 μg g–1、164.37 μg g–1、19.96 μg g–1和204.48 μg g–1; 2022年分別為1.79～ 59.72 μg g–1、46.57～426.70 μg g–1、5.26～47.24 μg g–1和54.70～498.38 μg g–1, 平均值分別為15.00 μg g–1、188.31 μg g–1、22.26 μg g–1和225.57 μg g–1(表1)。α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、TVe含量2022年比2021年變幅大, 說明Ve含量較容易受環(huán)境影響。Ve含量的變異系數(shù)較大, 從2021年Ve總含量的19.79%到2022年α-生育酚含量的55.78%, 并且2022年均大于2021年。總的來看, Ve含量在不同年份呈數(shù)量性狀的連續(xù)分布特點(圖1)。方差分析表明, 關(guān)聯(lián)群體基因型間存在極顯著差異(附表1), 說明關(guān)聯(lián)群體基因型間α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和TVe含量存在極顯著的遺傳變異。相關(guān)性分析(表2)表明, 2021年和2022年Ve含量間的相關(guān)系數(shù)均為正相關(guān), 達(dá)到極顯著水平(≤0.01)。

表1 大豆籽粒Ve含量表型變異

α-Toc: α-生育酚; γ-Toc: γ-生育酚; δ-Toc: δ-生育酚; TVe: Ve總含量。

α-Toc: α-tocopherol; γ-Toc: γ-tocopherol; δ-Toc: δ-tocopherol; TVe: the total Ve. CV: the coefficient of variation.

表2 大豆籽粒Ve含量的相關(guān)性分析

**表示0.01概率水平相關(guān)性顯著。α-Toc: α-生育酚; γ-Toc: γ-生育酚; δ-Toc: δ-生育酚; TVe: Ve總含量。

**means significant correlation at the 0.01 probability level. α-Toc: α-tocopherol; γ-Toc: γ-tocopherol; δ-Toc: δ-tocopherol; TVe: the total Ve.

圖1 不同年份大豆籽粒Ve含量的頻率分布圖

2.2 大豆籽粒Ve含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用MLM模型對2021年和2022年大豆籽粒Ve含量進(jìn)行GWAS分析發(fā)現(xiàn), 2021年和2022年α-生育酚分別檢測到8和112個顯著位點, 表型變異解釋率為7.10%～12.82%; γ-生育酚分別檢測到13和20個顯著位點, 表型變異解釋率為6.96%～10.24%; δ-生育酚分別檢測到7個和50個顯著位點, 表型變異解釋率為7.52%～11.05%; Ve總含量分別檢測到5個和17個顯著位點, 表型變異解釋率為6.88%～9.51% (圖2)。其中α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和Ve總含量在2年或2個性狀被重復(fù)檢測到9個顯著性SNP位點, 分布在大豆3號、7號、11號、12號、13號、15號、17號和18號染色體上, 可以解釋7.94%～11.05%的表型變異(圖2和表3)。

表3 大豆籽粒Ve顯著關(guān)聯(lián)SNP位點

(續(xù)表3)

以上位點為2年或2個性狀均檢測到的QTL。α-Toc: α-生育酚; γ-Toc: γ-生育酚; δ-Toc: δ-生育酚; TVe: Ve總含量。

The QTL detected in 2 years or 2 traits are on the table. α-Toc: α-tocopherol; γ-Toc: γ-tocopherol; δ-Toc: δ-tocopherol; TVe: the total Ve.

(圖2)

A: 2021年和2022年α-生育酚含量關(guān)聯(lián)分析Manhattan圖和Q-Q plot圖; B: 2021年和2022年δ-生育酚含量關(guān)聯(lián)分析Manhattan圖和Q-Q plot圖; C: 2021年和2022年γ-生育酚含量關(guān)聯(lián)分析Manhattan圖和Q-Q plot圖; D: 2021年和2022年總生育酚含量關(guān)聯(lián)分析Manhattan圖和Q-Q plot圖。當(dāng)SNP閾值-log10() ≥ 5.0 (紅線以上)時, 則認(rèn)為該SNP位點顯著。

A: Manhattan and Q-Q plots of α-tocopherol content in 2021 and 2022; B: Manhattan and Q-Q plots of δ-tocopherol content in 2021 and 2022; C: Manhattan and Q-Q plots of γ-tocopherol acid content in 2021 and 2022; D: Manhattan and Q-Q plots of total-tocopherol content in 2021 and 2022. When the threshold of SNP-log10() ≥ 5.0 (above the red line), it is considered the SNP is significant site.

2.3 大豆籽粒Ve含量關(guān)鍵候選基因篩選

對上述9個與大豆籽粒Ve含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP進(jìn)行單倍型分析發(fā)現(xiàn), 2022年SNP S03_22378753堿基變化為G至T, 攜有SNP S03_22378753-G大豆種質(zhì)的γ-生育酚和δ-生育酚平均含量分別為202.29 μg g–1和24.10 μg g–1, 極顯著高于基因型S03_22378753-T的大豆種質(zhì)139.98 μg g–1和16.37 μg g–1(圖3-A)。2021年和2022年攜有SNP S07_4623771-T大豆種質(zhì)α-生育酚的平均含量均極顯著低于攜有基因型S07_4623771-C大豆種質(zhì)(圖3-B)。2022年攜有SNP S11_5633216-A大豆種質(zhì)γ-生育酚和TVe的平均含量均極顯著高于攜有基因型SNP S11_5633216-C大豆種質(zhì)(圖3-C)。2022年攜有SNP S12_980498-A和S13_26738088-A大豆種質(zhì)γ-生育酚、δ-生育酚和TVe的平均含量均顯著低于攜有基因型S12_ 980498-T和S13_26738088-G大豆種質(zhì)(圖3-D, E)。2022年攜有S15_15320539-C、S18_51917901-A和S18_55638538-G大豆種質(zhì)γ-生育酚和TVe的平均含量要極顯著低于攜有S15_15320539-T、S18_ 51917901-C和S18_55638538-A大豆種質(zhì)(圖3-F, H, I)。2021年攜有S17_21854720-G大豆種質(zhì)γ-生育酚和TVe的平均含量要顯著低于攜有S17_21854720-A大豆種質(zhì)(圖3-G)。

2.4 關(guān)鍵候選基因的驗證

前期研究結(jié)果顯示該群體的連鎖不平衡衰減區(qū)間為120 kb[21], 在上述9個與大豆籽粒Ve含量顯著關(guān)聯(lián)SNP上下游120 kb范圍內(nèi)的候選基因, 基于基因功能注釋, 初步鑒定到6個與Ve含量顯著相關(guān)的關(guān)鍵候選基因(表4)。其中, 定位于3號染色體上的基因編碼HTH轉(zhuǎn)錄因子; 定位于7號、11號和13號染色體上的基因基因編碼myb轉(zhuǎn)錄因子;和均編碼鋅指蛋白。和基因預(yù)測編碼γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶, 這些基因可能與籽粒中Ve的合成、積累和分解緊密相關(guān)。

(圖3)

A: 2022年攜有SNP S03_22378753-G/T的大豆種質(zhì)γ-生育酚和δ-生育酚含量箱線圖; B: 2021年和2022年攜有SNP S07_4623771- C/T的大豆種質(zhì)α-生育酚含量箱線圖; C: 2022年攜有SNP S11_5633216- C/A的大豆種質(zhì)γ-生育酚和TVe含量箱線圖; D: 2022年攜有SNP S12_980498- A/T的大豆種質(zhì)γ-生育酚、δ-生育酚和TVe含量箱線圖; E: 2022年攜有SNP S13_26738088-G/A的大豆種質(zhì)γ-生育酚、δ-生育酚和TVe含量箱線圖; F: 2022年攜有SNP S15_15320539-T/C的大豆種質(zhì)γ-生育酚和TVe含量箱線圖; G: 2021年攜有SNP S17_21854720-G/A的大豆種質(zhì)γ-生育酚和TVe含量箱線圖; H: 2022年攜有SNP S18_51917901-A/C的大豆種質(zhì)γ-生育酚和TVe含量箱線圖; I: 2022年攜有SNP S18_55638538-G/A的大豆種質(zhì)γ-生育酚和TVe含量箱線圖。α-Toc: α-生育酚; γ-Toc: γ-生育酚; δ-Toc: δ-生育酚; TVe: Ve總含量。顯著性分析使用檢驗。*、**和***分別表示在< 0.05、< 0.01和< 0.001水平顯著。

A: the box plot of γ-tocopherol and δ-tocopherol content of soybean varieties with S03_22378753-G or S03_22378753-T in 2022. B: the box plot of α-tocopherol content of soybean varieties with S07_4623771-C or S07_4623771-A in 2021 and 2022. C: the box plot of γ-tocopherol and TVe content of soybean varieties with S11_5633216-C or S11_5633216-A in 2022. D: the box plot of γ-tocopherol, δ-tocopherol and TVe content of soybean varieties with S12_980498-A or S12_980498-T in 2022. E: the box plot of γ-tocopherol, δ-tocopherol and TVe content of soybean varieties with SNP S13_26738088-G or SNP S13_26738088-A in 2022. F: the box plot of γ-tocopherol and TVe content of soybean varieties with S15_15320539-T or S15_15320539-C in 2022. G: the box plot of γ-tocopherol and TVe content of soybean varieties with S17_21854720-G or S17_21854720-A in 2021. H: the box plot of γ-tocopherol and TVe content of soybean varieties with S18_51917901-A or S18_51917901-C in 2022. I: the box plot of γ-tocopherol and TVe content of soybean varieties with S18_55638538-G or S18_55638538-A in 2022. α-Toc: α-tocopherol; γ-Toc: γ-tocopherol; δ-Toc: δ-tocopherol; TVe: Total Ve. The significance analysis was used-test. *, **, and *** indicate significance at< 0.05,< 0.01, and< 0.001, respectively.

表4 大豆自然群體籽粒Ve關(guān)鍵候選基因

根據(jù)本課題組已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得知[22], 在大豆籽粒發(fā)育過程中(開花后7～28 d),和基因在開花授粉7 d后的表達(dá)量最高, 然后表達(dá)量隨之降低;的表達(dá)量在開花14 d后達(dá)到峰值, 然后在21 d和28 d后下降;和基因表達(dá)量一直呈上升趨勢, 在開花28 d后達(dá)到最大;的表達(dá)量在開花7 d后達(dá)到峰值, 隨后表達(dá)量降為0 (圖4)。

2.5 Ve性狀特異種質(zhì)的優(yōu)選

大豆籽粒Ve育種的方向是培育出高Ve品質(zhì)的大豆品種, 因此在遴選特異種質(zhì)時, 僅考慮高α-生育酚和TVe含量的種質(zhì)。對于α-生育酚和TVe性狀來說, 分別以含量大于30 μg g–1和400 μg g–1為篩選標(biāo)準(zhǔn), 最終獲得9份特異種質(zhì)材料(表5), 其中2份材料NPS020和NPS023為雙高(高α-生育酚和高TVe含量)特異種質(zhì), 均來源于寧夏, 建議可以直接用于生產(chǎn)的高Ve大豆品種。優(yōu)選結(jié)果說明寧夏大豆生態(tài)區(qū)可能擁有更多可以直接利用的高Ve的資源。從入選資源的優(yōu)異等位變異位點來看, 除NPS001和NPS027外, 其余7份大豆資源兼具多個優(yōu)異等位變異位點, 包括NPS020和NPS023種質(zhì)。

圖4 大豆籽粒發(fā)育過程中6個Ve含量相關(guān)候選基因的表達(dá)模式

表5 入選的Ve相關(guān)性狀的特異資源

α-Toc: α-生育酚; TVe: Ve總含量。

α-Toc: α-tocopherol; TVe: total Ve.

3 討論

大豆種子Ve主要成分中, α-生育酚營養(yǎng)價值最高, 容易穩(wěn)定在細(xì)胞中, 具有最強(qiáng)的保護(hù)不飽和脂肪酸免受氧化的能力[23]; γ-生育酚占生育酚總含量的70%左右, 在食用油中占生育酚總含量的60%～ 65%。γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶作用于芳香環(huán)上, 使γ-生育酚形成α-生育酚[24-25]。本研究檢測到9個控制大豆Ve含量SNP位點, 6個候選基因在種子發(fā)育過程中均有不同程度的表達(dá)。

本研究檢測到與α-生育酚含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點S07_4623771, 2年分別可以解釋7.88%和9.83%的表型變異。據(jù)文獻(xiàn)報道, 前人[26]利用3個大豆RIL群體, 在S07_4623771位點檢測到與大豆油分含量相關(guān)的QTL (Gm07: 2025244～10465123), 這一方面佐證了本文中S07_4623771位點與大豆油分有關(guān), 另一方面啟示育種中此位點進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇, 可以同時改良大豆α-生育酚與油分含量。所以, 本文發(fā)掘到的S07_4623771位點在大豆品質(zhì)育種中可能具有重要意義, 還需對該位點進(jìn)一步精細(xì)定位, 挖掘其潛在的候選基因。同時, 在15號和18號染色體上定位到的S15_15320539和S18_51917901位點, 分別與種子含油量和油酸含量的主效QTL重疊[27-28],但未見與種子Ve含量相關(guān)報道, 它們可能是潛在的新QTL, 該位點的遺傳效應(yīng)有待進(jìn)一步研究證實。前人研究表明, 大部分與大豆籽粒Ve組分性狀相關(guān)的QTL主要集中于5號、6號、9號、14號、15號和20號染色體上[8-10,29]。劉煥成[30]利用‘北豐9’和低維生素E含量的大豆品種‘Freeborn’構(gòu)建包含238個家系的RIL群體, 首次定位到同時與α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和維生素E總含量相關(guān)2個重要的QTL, 其中BARCSOYSSR_15_0855-BARCSOYSSR_ 15_0887與本研究定位到15號染色體SNP位點S15_15320539區(qū)域不同, 其原因可能是由于控制大豆Ve成分的基因不同, 也可能是試驗材料不同, 群體種類和大小不同。此外, 本研究中定位出的S03_22378753、S11_5633216、S12_980498、S13_26738088和S18_55638538位點, 均未見相關(guān)報道。

本研究共篩選出6個Ve相關(guān)的關(guān)鍵候選基因。和與擬南芥同源, 編碼γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-TMT),該酶是生育酚生物合成途徑中最后一個關(guān)鍵酶, 具有較高的生物活性, 分別可將γ-和δ-生育酚甲基化為α-和β-生育酚。Chu等[19]用6,291,929個SNP標(biāo)記對727份(2013年)和807份(2014年)大豆種質(zhì)資源進(jìn)行GWAS分析, 發(fā)現(xiàn)18個與大豆種子生育酚或總生育酚相關(guān)的SNP位點, 鑒定了3個與α-生育酚生物合成基因:、和。該研究僅對進(jìn)行了功能驗證, 但未對和進(jìn)行深入驗證。相關(guān)研究表明, 過表達(dá)玉米的生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶可使轉(zhuǎn)基因擬南芥中α-生育酚含量增加4～5倍, 轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中的含量增加約6.5倍, 并使α/γ-生育酚比率分別增加到約15和17[31]。在油菜過表達(dá)可使種子中α-生育酚和總生育酚含量增加[32]。因此,和有可能為大豆Ve代謝相關(guān)候選基因, 功能有待進(jìn)一步驗證。與同源, 在擬南芥中, 該基因參與葉片發(fā)育、側(cè)器官發(fā)生以及作為植物免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子。MYB轉(zhuǎn)錄因子在次生代謝途徑中發(fā)揮著重要作用[33],的同源物(MYB111), 被報道參與調(diào)控擬南芥次生代謝物黃酮醇的生物合成[34]。但MYB轉(zhuǎn)錄因子是否參與大豆Ve合成尚不明確。與擬南芥同源, 被報道參與調(diào)控光形態(tài)發(fā)生和開花時間[21,35], 尚未有參與Ve合成的相關(guān)報道。與(BASIC LEUCINE ZIPPER TRANSCRIPTION FACTOR 67, ATBZIP67)同源, 該基因功能尚無明確研究。本研究中篩選到特異種質(zhì)共計9份, 其中有7份來自寧夏, 云南和河北各1份。存在7份兼具多個優(yōu)異等位變異位點的特異種質(zhì), 如來自寧夏的NPS020和NPS023既為高α-生育酚種質(zhì)又為總生育酚高的種質(zhì), 為“雙高”種質(zhì)。篩選到的特異種質(zhì), 可針對目標(biāo)性狀直接改良后投入生產(chǎn), 也可以作為育種改良的中間材料。在利用特異材料開展育種工作的時候, 不僅要考慮表型的高低, 還應(yīng)明確控制表型高低的遺傳位點, 從全局上把握特異材料中優(yōu)異等位的分布情況, 并在育種中進(jìn)行輔助選擇, 這不僅能縮短育種年限, 還能獲得可靠的結(jié)果[36]。

4 結(jié)論

本研究采用264份大豆種質(zhì)資源籽粒中Ve的α-、γ-和δ-生育酚含量表型數(shù)據(jù)結(jié)合重測序基因型數(shù)據(jù), 進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)(GWAS)分析, 共檢測到9個顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點, 并發(fā)掘出6個關(guān)鍵候選基因, 其中MYB轉(zhuǎn)錄因子以及編碼γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的基因和, 可能是參與Ve代謝過程的重要基因。遴選到7份兼具多個優(yōu)異等位變異位點的特異種質(zhì), 可供生產(chǎn)應(yīng)用或作為育種特異種質(zhì)利用。

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附表1 不同年份大豆籽粒Ve含量的方差分析

Table S1 Analysis of variance (ANOVA) for Ve of soybean seed in two years

年份Year生育酚Tocopherol變異來源Source of variation自由度DF均方MSF值F-value 2021α-生育酚α-Toc基因型Genotype253114.6137.78** 重復(fù)Replication25.451.80 誤差Residual error5063.03 γ-生育酚γ-Toc基因型Genotype2533379.1628.53** 重復(fù)Replication21588.3213.41** 誤差Residual error506118.43 δ-生育酚δ-Toc基因型Genotype25364.1552.03** 重復(fù)Replication25.504.46* 誤差Residual error5061.23 總生育酚TVe基因型Genotype2534914.2416.96** 重復(fù)Replication22022.396.98** 誤差Residual error506289.80 2022α-生育酚α-Toc基因型Genotype208182.18118.53** 重復(fù)Replication20.770.50 誤差Residual error4161.54 γ-生育酚γ-Toc基因型Genotype20816,365.0090.26** 重復(fù)Replication2315.281.74 誤差Residual error416181.31 δ-生育酚δ-Toc基因型Genotype209210.0079.66** 重復(fù)Replication24.741.80 誤差Residual error4162.64 總生育酚TVe基因型Genotype20823,217.00130.40** 重復(fù)Replication210,967.0061.60** 誤差Residual error416178.04

*和**分別表示在< 0.05和< 0.01水平顯著。

*and**indicate significance at< 0.05 and< 0.01, respectively.DF: degree of freedom; MS: mean square. α-Toc: α-tocopherol; γ-Toc: γ-tocopherol; δ-Toc: δ-tocopherol; TVe: total Ve.

Genome-wide association study for vitamin E content in soybean (L.) seed

ZHANG Hong-Mei1, ZHANG Wei1, WANG Qiong1, JIA Qian-Ru1, MENG Shan2, XIONG Ya-Wen3, LIU Xiao-Qing1, CHEN Xin1, and CHEN Hua-Tao1,3,*

1Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China;2Institute of Germplasm Resources and Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China;3College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

Vitamin E (Ve) is a natural antioxidant in soybean oil and an important index to evaluate the nutritional value of soybean oil. In this study, α-, γ-, and δ- contents of seed were determined from a natural soybean population containing 264 germplasm resources in 2021 and 2022, and genome-wide association study (GWAS) was conducted. A total of 199 SNPs significantly associated with soybean Ve content were detected in this study, among which 9 SNPs that could be repeatedly detected in two different environments or two traits, which located on chromosomes 3, 7, 11, 12, 13, 15, 17, and 18, respectively. Among them, the significant association signal on chromosome 7 was a major effect site controlling α-tocopherol content, which can be detected in two environments, with the explanation rate of phenotypic variation 9.83%. By screening the candidate genes of this site,encoding myb transcription factor was obtained, which may be the effect gene of this site. In addition, two genes encoding γ-tocopherol methyltransferaseandobtained on chromosome 12, may be important genes affecting Ve content. The results of this study are helpful to analyze the genetic basis and regulatory mechanism of Ve content in soybean seed, and lay a foundation for genetic improvement of soybean quality.

soybean; seed; Ve content; GWAS; candidate gene

10.3724/SP.J.1006.2024.34202

本研究由江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金項目(CX(22)5002)和國家自然科學(xué)基金項目(32001455, 30771360)資助。

This study was supported by the Jiangsu Agricultural Science and Technology Innovation Fund (CX(22)5002) and the National Natural Science Foundation of China (32001455, 30771360).

陳華濤, E-mail: cht@jaas.ac.cn

E-mail: zhm@jaas.ac.cn

2023-12-01;

2024-01-31;

2024-02-09.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240207.2159.007

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