苗 龍 舒 闊 李 娟 黃 茹 王業(yè)杏 Soltani Muhammad YOUSOF 許競(jìng)好 吳傳磊 李佳佳 王曉波,* 邱麗娟

大豆根莖過(guò)渡區(qū)彎曲突變體M的鑒定與基因定位

苗 龍1,**舒 闊1,**李 娟1黃 茹1王業(yè)杏1Soltani Muhammad YOUSOF1許競(jìng)好1吳傳磊1李佳佳1王曉波1,*邱麗娟2,*

1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 安徽合肥 230036;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081

植物根莖過(guò)渡區(qū)(root-stem transition zone, RSTZ)將根和莖相互連接, 其發(fā)育形態(tài)決定了大豆的地上部株型和抗倒伏潛力。本研究通過(guò)EMS誘變獲得一個(gè)RSTZ彎曲或旋轉(zhuǎn)的大豆突變體M, 其形態(tài)特征能夠穩(wěn)定遺傳, 是探究大豆莖稈發(fā)育規(guī)律的特異材料。將該突變體和栽培大豆中黃13雜交構(gòu)建重組自交系群體, 對(duì)群體中直立和彎曲型后代的RSTZ進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)比較, 發(fā)現(xiàn)彎曲型株系比直立型株系的維管形成層較寬、次生木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)較多、細(xì)胞形狀不規(guī)則, 表明維管組織分化可能是導(dǎo)致RSTZ形態(tài)發(fā)生差異的重要因素之一。進(jìn)一步對(duì)化學(xué)組分測(cè)定發(fā)現(xiàn), 木質(zhì)素和粗纖維含量越高越不易彎曲。選取RIL群體中彎曲型和直立型2種極端株系進(jìn)行BSA-Seq, 采用SNP-index和InDel-index關(guān)聯(lián)分析方法鑒定到調(diào)控RSTZ形態(tài)的關(guān)聯(lián)區(qū)域Chr19: 43030943～45849854, 該區(qū)間共含有319個(gè)基因。結(jié)合生物信息學(xué)分析、基因注釋信息和表達(dá)豐度分析篩選到7個(gè)候選基因, 分別為、、、、、、。其中,、和在大豆馴化中潛在影響RSTZ形態(tài)建成。本研究為解析大豆RSTZ組織形成及其遺傳基礎(chǔ)提供了材料基礎(chǔ), 并為挖掘調(diào)控大豆莖稈發(fā)育基因提供新的見(jiàn)解。

大豆; 根莖過(guò)渡區(qū); 突變體; BSA-seq; 候選基因

為了適應(yīng)外界環(huán)境, 植物在不同發(fā)育階段會(huì)不斷形成新器官, 并通過(guò)調(diào)整自身的生長(zhǎng)方式來(lái)維持正常發(fā)育[1]。大豆植株可分為地上部和地下部, 地下部分主要由根系構(gòu)成、地上部主要由莖、葉、花、果莢、種子等構(gòu)成。在大豆萌發(fā)過(guò)程中胚芽和胚根逐漸發(fā)育為莖和根, 而胚軸是連接胚根和胚芽的部位, 隨著豆苗的不斷形成逐步發(fā)育為連接根和莖的根莖過(guò)渡區(qū)(root-stem transition zone, RSTZ), 根和莖的維管束分化形式存在很大差異, 因此RSTZ也被稱為維管束過(guò)渡區(qū)。從根到莖的轉(zhuǎn)變不僅意味著形態(tài)上的變化, 而且意味著從運(yùn)輸和支撐到儲(chǔ)存過(guò)程中的功能變化, 因此RSTZ的形態(tài)結(jié)構(gòu)是衡量大豆株型的重要依據(jù), 同時(shí)與植株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性密切相關(guān)[2-3]。大豆的根系在吸收土壤水分和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)也對(duì)植株起支撐作用, 同時(shí)莖稈的粗細(xì)展現(xiàn)了植株的健壯程度, 莖稈粗壯的植株不易發(fā)生倒伏, 具有豐產(chǎn)性[4-5]。根據(jù)大豆倒伏時(shí)期和倒伏程度的不同, 減產(chǎn)程度在10%～60%不等, 倒伏越重、越早, 減產(chǎn)幅度越大, 也間接加大了田間管理和病蟲(chóng)草害防治的難度, 因而倒伏是制約大豆高產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)收入的重要因素[6]。莖倒伏是因?yàn)樽魑镏仓赀^(guò)高、莖稈細(xì)長(zhǎng)、基部組織強(qiáng)度差所導(dǎo)致的, 比如遇到外因大風(fēng)、暴雨, 引起莖稈不同程度的傾斜或彎曲, 也會(huì)出現(xiàn)根莖彎曲現(xiàn)象, 導(dǎo)致植物生長(zhǎng)不良并造成經(jīng)濟(jì)損失。因此, 探究大豆RSTZ的形態(tài)建成及其關(guān)鍵調(diào)控基因的功能, 對(duì)了解大豆植株抗倒伏能力和培育大豆理想株型具有重要意義。

木質(zhì)部和韌皮部是主要的植物維管組織, 水和溶質(zhì)礦物的運(yùn)輸主要通過(guò)木質(zhì)部完成, 而韌皮部負(fù)責(zé)光合產(chǎn)物和各種信號(hào)分子的分配[7-8]。從細(xì)胞學(xué)角度看, 莖稈的物理結(jié)構(gòu)由機(jī)械組織、維管束、木質(zhì)化薄壁細(xì)胞的特征所決定, 這些結(jié)構(gòu)能夠在莖稈的支撐、運(yùn)輸以及抗倒伏功能中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[9]。一般來(lái)說(shuō), 根莖過(guò)渡區(qū)的機(jī)械組織、維管束、皮層等解剖結(jié)構(gòu)受外界影響較小, 其中維管形成層的紡錘狀原始細(xì)胞通過(guò)平周分裂產(chǎn)生新的木質(zhì)部和韌皮部[10-11]。通常情況下, 朝向木質(zhì)部一側(cè)的平周分裂速率較快, 從而產(chǎn)生較多的木質(zhì)部細(xì)胞, 而韌皮部細(xì)胞較少, 如果形成層各處產(chǎn)生的木質(zhì)部和韌皮部均維持在一個(gè)相對(duì)恒定的比例, 那么植物莖稈發(fā)育基本呈現(xiàn)圓柱型, 即使發(fā)生微小的改變, 最終會(huì)嚴(yán)重影響莖稈形態(tài)及植株抗倒伏能力[12-13]。在雙子葉植物中, 頂端分生組織在根、莖的伸長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用, 而維管形成層主要負(fù)責(zé)促進(jìn)莖和根加粗, 其中維管干細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生次生木質(zhì)部和次生韌皮部, 不僅能夠運(yùn)輸水分和光合產(chǎn)物, 而且起到支撐植物直立生長(zhǎng)的作用[14]。前人在不同玉米品種研究中, 發(fā)現(xiàn)硬皮組織厚度、單位面積的維管束數(shù)目、維管束鞘厚度是玉米莖稈抗倒伏能力的基礎(chǔ)[15-17]。羅茂春等[18]、Duan等[19]和袁新捷等[20]對(duì)水稻抗倒伏植株研究也證實(shí)了莖稈強(qiáng)度與莖稈組織中的維管束數(shù)目存在極顯著正相關(guān)。由此可見(jiàn), 維管組織形態(tài)和細(xì)胞排列情況是評(píng)價(jià)植株抗倒伏能力的重要指標(biāo)之一。

大豆莖稈的主要化學(xué)成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、粗纖維等, 這些化學(xué)成分的含量與莖稈機(jī)械強(qiáng)度以及莖稈形態(tài)息息相關(guān)。對(duì)玉米莖稈化學(xué)成分與其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的研究中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素、纖維素等物質(zhì)含量增加時(shí), 莖稈的抗折能力增加, 表明纖維素和木質(zhì)素含量與莖稈抗倒伏能力呈顯著正相關(guān)[21-24]。Silva等[25]研究發(fā)現(xiàn)抗倒伏性小麥品種的莖稈木質(zhì)素含量越高, 抗倒伏能力越強(qiáng)。Vigols等[26]在玉米突變體中證實(shí)基因的突變會(huì)抑制木質(zhì)素單體合成, 進(jìn)而導(dǎo)致植株抗倒伏能力下降。目前, 越來(lái)越多的報(bào)道表明莖稈的化學(xué)組分, 包括木質(zhì)素含量、纖維素含量對(duì)作物抗倒伏性具有重要作用。然而, 關(guān)于RSTZ形態(tài)及其化學(xué)組分變化影響植物的生理及發(fā)育研究較少。

隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 前人通過(guò)BSA- seq技術(shù)對(duì)作物抗病性、株型以及高產(chǎn)等農(nóng)藝性狀開(kāi)展重要功能基因挖掘, 被廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、大豆等多個(gè)物種中。蔣家煥等[27]利用BSA-Seq方法, 在粳稻早衰突變體的F2分離群體中選擇隱性和顯性各100個(gè)單株構(gòu)建混池, 最終定位到影響水稻早衰相關(guān)基因。崔彥芹等[28]基于BSA-seq技術(shù)對(duì)冀航芝1號(hào)和DW607的株高性狀進(jìn)行基因定位, 在NC026152.1和NC026156.1兩條連鎖群上關(guān)聯(lián)到4個(gè)顯著關(guān)聯(lián)區(qū)域, 并鑒定到18個(gè)參與生長(zhǎng)素響應(yīng)的候選基因。在大豆中, Zhong等[29]通過(guò)該方法在3號(hào)染色體上定位到疫霉病抗性基因。本研究利用大豆根莖過(guò)渡區(qū)彎曲突變體與栽培大豆中黃13雜交構(gòu)建重組自交系(recombinant inbred lines, RIL)群體, 通過(guò)對(duì)親本和2個(gè)極端表型子代混合池進(jìn)行BSA全基因組重測(cè)序及關(guān)聯(lián)分析, 結(jié)合生物信息學(xué)分析、基因注釋信息、基因表達(dá)豐度及熒光定量分析, 挖掘調(diào)控大豆根莖過(guò)渡區(qū)形態(tài)的遺傳位點(diǎn)及候選基因。本研究為解析大豆RSTZ組織形成及其遺傳基礎(chǔ)提供了理論依據(jù), 并為完善和培育大豆抗倒伏株型品種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

通過(guò)EMS誘變大豆中品661獲得突變體材料M, 該突變體表現(xiàn)為根莖過(guò)渡區(qū)(RSTZ)長(zhǎng)度約為3 cm的組織呈現(xiàn)彎曲或旋轉(zhuǎn)的特點(diǎn), 并能夠穩(wěn)定遺傳。將大豆骨干親本中黃13與M雜交獲得由120個(gè)株系構(gòu)成的重組自交系群體。自2019—2021年連續(xù)3年種植于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園和海南南繁基地(F7至F10代), 行播, 行長(zhǎng)2 m、行距45 cm、株距15 cm, 常規(guī)進(jìn)行田間管理與表型鑒定。將大豆突變體M雜交后代材料按照不同的莖稈形態(tài)進(jìn)行分類, 主要分為RSTZ部位彎曲型和直立型植株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根莖過(guò)渡區(qū)的解剖結(jié)構(gòu)分析 大豆生育期間, 隨著光合產(chǎn)物的積累和株高增加, 抗倒伏系數(shù)呈現(xiàn)U型變化, 在R5～R6期表現(xiàn)為最易發(fā)生倒伏, 且R5時(shí)期的主根和側(cè)根生長(zhǎng)最為健壯[30-31]。為比較大豆直立型與彎曲型RSTZ的細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)差異, 在R5期分別取2種類型植株的RSTZ組織, 切成1～2 cm小段, 置于FAA固定液中固定并保存。制成石蠟切片后用番紅固綠染色1～2 h, 然后在顯微鏡下觀察次生韌皮部、維管形成層及次生木質(zhì)部形態(tài)結(jié)構(gòu), 每種性狀類型分別取3 株重復(fù)。

1.2.2 大豆M彎曲型和直立型莖稈的化學(xué)組分分析 對(duì)重組自交系群體分離后代成熟后脫粒, 并保留植株的RSTZ組織部位。采用莖稈切割器(北京昆捷玉成設(shè)備有限公司, KQS-400型), 將干燥后的RSTZ組織切成小段, 隨后利用植物秸稈粉碎機(jī)(杭州綠博機(jī)械設(shè)備制造有限責(zé)任公司, FSD-100A)研磨粉碎, 通過(guò)18目篩子過(guò)濾雜質(zhì)后裝袋。使用DA7200型近紅外成分測(cè)定儀測(cè)量莖稈中木質(zhì)素、纖維素、粗纖維的含量。每種類型株系各40份, 每份樣品重復(fù)檢測(cè)3次, 結(jié)果用于后續(xù)分析。

1.2.3 BSA-Seq測(cè)序 根據(jù)在田間對(duì)中黃13 (父本)、突變體材料M(母本)以及RIL群體后代表型的鑒定, 選取來(lái)自分離群體的30株RSTZ彎曲型和30株RSTZ直立型植株以及2個(gè)親本并提取DNA用于文庫(kù)構(gòu)建。利用Illunima Casava 1.8進(jìn)行堿基識(shí)別分析, 采用150 bp雙末端測(cè)序, 試驗(yàn)流程按照南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司的測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。根據(jù)各樣品混池比對(duì)到大豆參考基因組Wm82.a2.v1的結(jié)果, 對(duì)混池中具有差異性的SNP位點(diǎn)進(jìn)行匯總。使用GATK軟件工具的HaplotypeCaller (局部單體型組裝)算法進(jìn)行SNP和InDel變異檢測(cè), 每個(gè)樣本先各自生成gVCF, 再進(jìn)行群體Joint-genotype。過(guò)濾并得到最終的變異位點(diǎn)集, 為對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制, 最終保留了最大缺失位點(diǎn)、雜合位點(diǎn)小于20%且最小等位基因頻率大于1%的標(biāo)記, 利用SnpEff軟件進(jìn)行變異位點(diǎn)注釋和預(yù)測(cè)變異效應(yīng)。

1.2.4 候選基因挖掘 采用SNP-index和InDel- index方法進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 以置信度99%為篩選閾值, 挖掘調(diào)控大豆RSTZ形態(tài)的遺傳位點(diǎn)。通過(guò)大豆基因組公共數(shù)據(jù)庫(kù)Soybase檢索顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的所有基因, 并借助BLAST軟件對(duì)定位區(qū)間內(nèi)的編碼基因進(jìn)行多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(NR、GO、KEGG、COG、Pfam)注釋分析。利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)所有基因在大豆各組織中的表達(dá)水平, 篩選在根或莖中特異高表達(dá)的基因作為候選基因。

1.2.5 熒光定量分析 為比較候選基因在彎曲型和直立型株系中的表達(dá)水平, 在突變體M后代分離群體中選取不同類型植株V5時(shí)期的RSTZ組織, 分別提取RNA。使用Prime Script RT Master Mix kit (TaKaRa, 日本)作為反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA, 所有cDNA樣品稀釋至相同濃度后用于qRT-PCR分析。

本試驗(yàn)使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)候選基因熒光定量引物, 并在NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站檢測(cè)引物特異性, 選取()作為內(nèi)參基因, 采用2-DDCt法計(jì)算各類型樣品中候選基因的相對(duì)表達(dá)水平, 每個(gè)類型株系進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)描述性統(tǒng)計(jì)分析和檢驗(yàn), 差異顯著水平< 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 彎曲型與直立型株系的根莖過(guò)渡區(qū)解剖學(xué)特征比較

將中黃13與突變體M雜交后代按照不同的形態(tài)進(jìn)行分類, 分為RSTZ彎曲型和直立型植株, 其中彎曲型表現(xiàn)為根和莖連接部位彎曲或旋轉(zhuǎn)等特點(diǎn)(圖1-A)。植物維管組織中, 形成層細(xì)胞的分化能夠影響莖稈側(cè)向形態(tài)建成, 為比較RSTZ維管結(jié)構(gòu)在2種類型株系中的差異, 本研究進(jìn)一步探究彎曲型和直立型大豆的RSTZ細(xì)胞學(xué)解剖結(jié)構(gòu)特征, 發(fā)現(xiàn)彎曲型株系維管形成層較寬、次生木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)較多、細(xì)胞形狀不規(guī)則(圖1-B), 表明不同類型株系RSTZ維管形成層分化可能是導(dǎo)致形態(tài)發(fā)生差異的重要因素。

2.2 彎曲型與直立型株系的根莖過(guò)渡區(qū)化學(xué)組分比較

為探究大豆莖稈化學(xué)組分與RSTZ形態(tài)特征之間的關(guān)系, 對(duì)2種類型各40份大豆莖稈的粗纖維、纖維素和木質(zhì)素含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,M雜交后代中大豆莖稈的粗纖維含量分布于45%～57%, 纖維素含量分布于46%～57%, 木質(zhì)素含量分布于9%～ 15% (圖2)。將直立型和彎曲型植株的木質(zhì)素、纖維素、粗纖維按其含量范圍進(jìn)行劃分, 2種表型RSTZ的粗纖維含量集中分布在49%～55%, 其中直立株系的粗纖維含量較彎曲型植株更高(圖2-A); 77%的直立型RSTZ組織中纖維素含量高于50%, 而70%的彎曲型RSTZ組織中纖維素含量低于50% (圖2-B); 此外, 直立型RSTZ組織中木質(zhì)素含量高于11%的占77%, 而在彎曲型中僅占32% (圖2-C)。RSTZ部位的直立型與彎曲型莖稈中粗纖維與木質(zhì)素含量呈現(xiàn)顯著差異, 纖維素沒(méi)有明顯差異(圖2-D～F)。表明大豆的RSTZ形態(tài)與其莖桿的化學(xué)組分密切相關(guān), 且木質(zhì)素、粗纖維含量高的植株RSTZ不易發(fā)生彎曲。

2.3 大豆根莖過(guò)渡區(qū)形態(tài)的遺傳定位

2.3.1 BSA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 選取RIL群體中30個(gè)直立型和30個(gè)彎曲型株系分別提取DNA并構(gòu)建混池, 與2個(gè)親本中黃13和突變體M在Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)初始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估, 樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估如表1所示。過(guò)濾后的堿基數(shù)量為85.53 Gbps, 檢測(cè)各樣品的插入片段大小分布情況符合正態(tài)分布, 4個(gè)混池測(cè)序文庫(kù)中堿基質(zhì)量值高于30的百分比分別為94.85%、94.54%、94.54%和94.56%, 即Q30>94.54%, GC含量在35.10%以上, 將獲得的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到大豆參考基因組上(Wm82.a2.v1), 平均比對(duì)率為97.99%, 基因組覆蓋度為95.00% (至少1個(gè)堿基覆蓋)。這些參數(shù)說(shuō)明本次測(cè)序得到的數(shù)據(jù)數(shù)量和質(zhì)量均可達(dá)到后續(xù)分析的要求, 為進(jìn)一步開(kāi)展大豆RSTZ形態(tài)性狀候選基因的挖掘提供可靠位點(diǎn)信息。

圖1 根莖過(guò)渡區(qū)直立型與彎曲型植株及其解剖結(jié)構(gòu)比較

A: VC、V6、R5、R8時(shí)期根莖過(guò)渡區(qū)直立型與彎曲型大豆植株; B: R5時(shí)期直立型與彎曲型株系下胚軸解剖結(jié)構(gòu)。Vc: 維管形成層; Sx: 次生木質(zhì)部; Sp: 次生韌皮部。A圖標(biāo)尺表示2 cm, B圖標(biāo)尺表示50 μm。VC: 子葉期; V6: 六葉期; R5: 始粒期; R8: 完熟期。

A: soybean plants with vertical or curved RSTZ at the VC, V6, R5, and R8 stages; B: the anatomical structure of hypocotyl for vertical and curved lines at R5 stage; Vc: vascular cambium; Sx: secondary xylem; Sp: secondary phloem. Bar: 2 cm (A) and 50mm (B). VC: at cotyledon stage; V6: at six leaves stage; R5: at beginning seed stage; R8: at maturity stage.

圖2 彎曲型與直立型根莖過(guò)渡區(qū)的化學(xué)組分分布及比較

A、B、C分別為彎曲型與直立型根莖過(guò)渡區(qū)中粗纖維、纖維素、木質(zhì)素化學(xué)組分分布圖; D、E、F柱狀圖代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(*:< 0.05, **:< 0.01,檢驗(yàn))。

A, B, and C are the distribution maps of chemical components of crude fiber, cellulose, and lignin in the vertical and curved root-stem transition zone, respectively; D, E, F: histogram represents mean ± SD (*:< 0.05, **:< 0.01,-test).

表1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估

2.3.2 大豆根莖過(guò)渡區(qū)形態(tài)的關(guān)聯(lián)分析 通過(guò)GATK軟件獲取不同文庫(kù)間的SNP及InDel變異信息, 在親本樣品池中共鑒定到2,116,251個(gè)SNP和376,054個(gè)Indel; 2個(gè)混合池中共鑒定到395,607個(gè)SNP和87,769個(gè)Indel。采用delta-SNP-index方法進(jìn)行基因組關(guān)聯(lián)分析, 以99%置信度為篩選閾值在19號(hào)染色體上關(guān)聯(lián)到1個(gè)候選區(qū)域, 總長(zhǎng)為3.01 Mb (物理位置Chr19: 43,030,943～46,037,125 bp), 共包含346個(gè)基因(圖3-A和表2)。采用delta-InDel-index方法進(jìn)行基因組關(guān)聯(lián)分析, 以99%置信度為篩選閾值在19號(hào)染色體上定位到1個(gè)候選區(qū)域, 總長(zhǎng)為2.87 Mb (物理位置Chr19:42,975,089～45,849,854 bp), 共包含323個(gè)基因(圖3-B和表2)。2種關(guān)聯(lián)分析方法定位到的候選區(qū)域與Soybase中已收錄的5個(gè)倒伏候選位點(diǎn)重合, 分別是、、、和, 表明該候選區(qū)域具有較高的可信度, 可用于候選基因挖掘。

2.4 大豆根莖過(guò)渡區(qū)形態(tài)的候選基因挖掘

使用GO數(shù)據(jù)庫(kù)將一致性區(qū)間內(nèi)319個(gè)候選基因按照生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞成分(cellular component)和分子功能(molecular function)進(jìn)行基因功能分類。結(jié)果顯示, 大部分基因參與細(xì)胞壁/膜的生物合成、輔酶的運(yùn)輸與代謝、碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝以及對(duì)植物激素激活等信號(hào)通路(圖4)?；诨蚬δ茏⑨屢约吧镄畔W(xué)分析, 篩選參與細(xì)胞分化、調(diào)控纖維素合成、木質(zhì)素分解代謝、粗纖維合成相關(guān)途徑, 鑒定到4個(gè)候選基因, 分別為參與纖維素生物合成過(guò)程、向重力性以及正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的(GO:0016570); 參與細(xì)胞壁大分子代謝過(guò)程、木質(zhì)部發(fā)育的(GO:0008152); 參與纖維素代謝過(guò)程的(GO:0001557)以及編碼細(xì)胞壁果膠酯酶合成基因(GO:0042545)。這些代謝過(guò)程已被證明與根莖組織的形態(tài)變化以及莖稈的生長(zhǎng)習(xí)性相關(guān)[33], 表明候選基因可能在調(diào)控大豆RSTZ形態(tài)結(jié)構(gòu)變異中發(fā)揮重要作用。

本研究利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄大豆不同組織部位RNA-Seq數(shù)據(jù), 分析一致性關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)319個(gè)基因的組織表達(dá)特點(diǎn), 結(jié)果顯示6個(gè)基因在大豆莖或根中表達(dá)高并聚類到相同分枝上(圖5), 它們分別是、、、、、, 也可能是調(diào)控RSTZ形態(tài)的候選基因。

圖3 SNP-index和InDel-index關(guān)聯(lián)值在染色體上的分布

RSTZ兩種類型的delta-SNP-index (A)和delta-InDel-index (B)擬合圖; 橫坐標(biāo)表示染色體的位置, 黑色曲線表示相應(yīng)的關(guān)聯(lián)值, 最上側(cè)的紅線代表置信度為99%的閾值線, 紅色箭頭指示定位的候選區(qū)域。

Delta-SNP-index (A) and delta-InDel-index (B) fitting plots for two types of RSTZ. The abscissa indicates the position of chromosomes and the black curve represents the associated values of each site, while the top red line indicates the threshold line with the confidence level of 99%. The red arrow points to the candidate region for positioning.

表2 BSA-seq關(guān)聯(lián)分析獲得大豆根莖過(guò)渡區(qū)形態(tài)的候選區(qū)域

圖4 候選區(qū)域內(nèi)基因GO注釋分類

橫坐標(biāo)為GO各分類內(nèi)容, 縱坐標(biāo)左邊和右邊分別表示基因數(shù)目所占百分比和基因數(shù)目。

The horizontal axis indicates the GO classification terms, while the left and right of the vertical axis represent the percentage of genes and the number of genes, respectively.

圖5 一致性關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)所有基因在不同大豆組織中的表達(dá)水平聚類熱圖

為進(jìn)一步鑒定以上候選基因在后代中的表達(dá)水平, 取RSTZ組織彎曲型和直立型株系, 通過(guò)qRT-PCR分析上述10個(gè)候選基因的表達(dá)水平(圖6)。以直立型植株中的表達(dá)水平作為對(duì)照, 結(jié)果顯示,、、在彎曲型株系中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。、、、在彎曲型株系中的表達(dá)水平顯著下調(diào)。綜合以上分析結(jié)果, 最終得到7個(gè)可能調(diào)控大豆RSTZ形態(tài)的候選基因, 分別為、、、、、、。

圖6 根莖過(guò)渡區(qū)彎曲型和直立型株系中候選基因表達(dá)水平比較

用作內(nèi)參, 候選基因在不同株系中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢驗(yàn)(*:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001)。

The relative expression levels of candidate genes in different lines were tested by-test (*:< 0.05, **:< 0.01, and ***:< 0.001) usingas the internal reference.

2.5 大豆根莖過(guò)渡區(qū)形態(tài)候選基因的遺傳多樣性分析

利用大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://yanglab.hzau. edu.cn/SoyGVD/#/)已收錄的588份野生大豆、1253份地方品種和2573份育成品種的變異信息對(duì)候選基因進(jìn)行遺傳多樣性及進(jìn)化分析[34]。發(fā)現(xiàn)來(lái)自于全球的4414份大豆材料中,、、、、、、分別具有7種、7種、4種、10種、3種、3種和5種不同單倍型(表3)。其中, 候選基因的hap0單倍型在地方品種中分布頻率為0.737, 在選育品種中分布頻率為0.862, 且hap3單倍型在地方品種和育成品種中均不存在, 而野生大豆中的4種不同單倍型均勻分布, 該基因的核苷酸多態(tài)性(π)在野生大豆群體中為0.00373, 栽培大豆群體中為0.00173, 兩群體間的遺傳分化指數(shù)(ST)為0.26, 表明可能是大豆早期抗倒伏能力馴化的關(guān)鍵事件, 其中hap0為大豆較高抗倒伏能力提升的優(yōu)異單倍型。候選基因的hap4單倍型在野生大豆中分布頻率為0.811, 在地方品種和育成品種中分布頻率分別為0.002、0.003, 該基因π值在野生大豆群體中為0.00170, 栽培大豆群體中為0.001,07, 野生大豆與栽培大豆群體間的ST值為0.32, 結(jié)果分析表明可能是野生大豆RSTZ形態(tài)馴化的關(guān)鍵事件。候選基因的hap0單倍型在地方和育成品種中分布頻率分別為0.437、0.512, 在野生品種中分布頻率為0.05, 該基因的π值在野生大豆群體中為0.00195, 栽培大豆群體中為0.00123, 兩群體間的ST值為0.28, 該基因和候選基因分析一致, 表明也可能是大豆早期選擇影響RSTZ形態(tài)的關(guān)鍵事件, 且hap0單倍型植株被選擇性保留。

3 討論

3.1 大豆根莖過(guò)渡區(qū)形態(tài)特征與其解剖結(jié)構(gòu)的關(guān)系

維管組織由木質(zhì)部和韌皮部組成, 在植物整個(gè)生命周期中不斷形成新的組織和器官, 并在它們之間運(yùn)輸各種分子, 對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要[35-37]。大豆根和莖作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕緩? 并對(duì)植株起支撐作用, 其中銜接植株根和莖的過(guò)渡區(qū)域(RSTZ)也被稱為維管束過(guò)渡區(qū)。從根到莖的轉(zhuǎn)變, RSTZ會(huì)伴隨著維管組織的分化, 維管柱變粗, 同時(shí)木質(zhì)部的位置和方向也發(fā)生轉(zhuǎn)變, 經(jīng)過(guò)一系列的細(xì)胞分裂和分化, 最終將二者結(jié)構(gòu)緊密連接起來(lái)。前人對(duì)野生大豆和栽培大豆?fàn)I養(yǎng)器官和生殖器官進(jìn)行解剖學(xué)結(jié)構(gòu)分析, 發(fā)現(xiàn)野生型大豆初生維管組織系統(tǒng)的連接, 以子葉節(jié)為中心, 具有一個(gè)過(guò)渡區(qū)和一個(gè)連接區(qū), 在面對(duì)不同的生長(zhǎng)環(huán)境和生理?xiàng)l件下, 維管組織中木質(zhì)部、韌皮部表現(xiàn)較高重塑性[38-39]。因此了解維管組織隨莖稈形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化, 對(duì)其解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 有利于預(yù)測(cè)和維持植株未來(lái)的生長(zhǎng)和產(chǎn)量情況。本試驗(yàn)比較大豆根莖過(guò)渡區(qū)彎曲型與直立型的解剖結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)發(fā)現(xiàn), RSTZ表型變化與根莖組織中形成層密度、木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)密切相關(guān)。

表3 大豆根莖過(guò)渡區(qū)形態(tài)候選基因的遺傳多樣性分析

*表示候選基因不同單倍型分別在野生品種、地方品種和育成品種中的分布頻率。π中表示核苷酸多態(tài)性,ST: 遺傳分化指數(shù)。

*: the distribution frequency of candidate genes different haplotypes in wild, landraces, and cultivar; π: the nucleotide diversity,ST: genetic differentiation index.

3.2 大豆根莖過(guò)渡區(qū)形態(tài)特征與其化學(xué)組分的關(guān)系

木質(zhì)素是一種光敏酚類化合物, 也是植物細(xì)胞壁的骨架物質(zhì), 能夠提高細(xì)胞壁硬度、機(jī)械支持力、抗壓強(qiáng)度, 還能促進(jìn)機(jī)械組織形成, 因此木質(zhì)素含量的增加可顯著增強(qiáng)莖稈抗壓和抗倒伏能力[21-24,40-42]。木質(zhì)素合成途徑涉及到許多酶促作用, 是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。由于木質(zhì)素重要的生物學(xué)功能, 近年來(lái)有關(guān)木質(zhì)素合成途徑中的機(jī)制研究越來(lái)越多, 不僅研究水平逐漸深入, 而且還涉及植物體內(nèi)的多條途徑, 有關(guān)基因表達(dá)調(diào)控和基因功能分析的報(bào)道逐漸增多。最近一項(xiàng)研究遮蔭對(duì)莖稈中木質(zhì)素代謝的影響表明, 木質(zhì)素含量減少會(huì)導(dǎo)致莖稈變細(xì)、較脆弱。遮蔭降低了參與木質(zhì)素生物合成的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaric acid coenzyme aligase, 4-CL)和肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)的代謝活性, 莖的維管束和厚壁組織細(xì)胞中木質(zhì)素沉積減少, 引起莖彎曲和生長(zhǎng)遲緩, 其中、和為小麥莖稈木質(zhì)素代謝的關(guān)鍵酶基因[43-46];、、、為油菜莖稈木質(zhì)素代謝的關(guān)鍵酶基因, 其表達(dá)量與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān);、、和為亞麻木質(zhì)部木質(zhì)素代謝的關(guān)鍵酶基因[45]。通過(guò)探究大豆莖稈化學(xué)組分與RSTZ形態(tài)特征之間的關(guān)系, 分析2種類型莖稈中粗纖維、纖維素、木質(zhì)素的含量。本研究發(fā)現(xiàn)RSTZ直立型植株的3種化學(xué)組分含量顯著高于彎曲型植株, 表明大豆的RSTZ形態(tài)特征與其莖桿的化學(xué)組分密切相關(guān)。本研究中, 在篩選影響RSTZ形態(tài)特征的候選基因中, 其中和主要是參與莖稈次生細(xì)胞壁纖維與細(xì)胞壁相關(guān)組分的合成和代謝過(guò)程。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果和化學(xué)組分分析可知,、可能在參與木質(zhì)素、纖維素合成中起到負(fù)調(diào)控作用。植物細(xì)胞壁的強(qiáng)大纖絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可為細(xì)胞及整個(gè)植物體提供機(jī)械支持作用, 而且纖維素和木質(zhì)素是細(xì)胞壁的主要成分, 纖維素和木質(zhì)素對(duì)維持莖稈強(qiáng)度具有明顯的促進(jìn)作用, 進(jìn)而對(duì)保持莖稈形態(tài)穩(wěn)定有一定的優(yōu)勢(shì), 最終表現(xiàn)出植株對(duì)不良環(huán)境更強(qiáng)的適應(yīng)性[39,47]。因此,和候選基因?yàn)樘骄炕瘜W(xué)組分影響RSTZ形態(tài)建成提供新的思路。

3.3 大豆根莖過(guò)渡區(qū)與倒伏相關(guān)候選基因分析

對(duì)影響倒伏相關(guān)基因的挖掘一直是大豆生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)[48]。Hwang等[48]利用Harosoy和Clark雜交群體進(jìn)行大豆抗倒伏QTL定位, 結(jié)果在大豆遺傳圖譜上鑒定到88個(gè)潛在QTL。通過(guò)對(duì)16個(gè)顯著的QTL聚類, 其中14個(gè)在2個(gè)或2個(gè)以上的定位群體中或在不同環(huán)境條件下的單個(gè)群體中得到了證實(shí),被認(rèn)為是最穩(wěn)定的QTL[49]。劉碩等[50]對(duì)已經(jīng)報(bào)道過(guò)的QTL信息進(jìn)行整合, 鑒定出了6個(gè)重演性較好的QTL區(qū)間, 分別位于6號(hào)、13號(hào)和19號(hào)染色體上, 進(jìn)一步篩選獲得了一個(gè)穩(wěn)定性較高的分子標(biāo)記Satt277,為大豆抗倒伏分子標(biāo)記和抗倒伏基因挖掘提供參考。本研究對(duì)控制RSTZ彎曲相關(guān)基因進(jìn)行初步定位, 鑒定到19號(hào)染色體上與RSTZ彎曲顯著相關(guān)的QTL, 并與Soybase中已收錄的多個(gè)倒伏候選位點(diǎn)(、、、和)物理位置重合, 進(jìn)一步鑒定到7個(gè)候選基因。其中,和分別功能注釋為參與纖維素生物合成、木質(zhì)素分解代謝過(guò)程, 通過(guò)不同類型的RSTZ化學(xué)組分分析發(fā)現(xiàn)直立型株系中粗纖維與木質(zhì)素含量顯著高于彎曲型株系, 然而表達(dá)水平顯著低于彎曲型株系(圖2和圖6), 表明、可能在參與木質(zhì)素、纖維素合成中起到負(fù)調(diào)控作用。編碼果膠甲酯酶(pectin methylesterase, PME), 催化果膠去酯化為果膠酸鹽和甲醇。果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分之一, 在植物生長(zhǎng)、形態(tài)和植物防御中具有重要作用[51]。研究發(fā)現(xiàn), PME能夠參與細(xì)胞壁的纖維素和果膠加工過(guò)程, 通過(guò)影響莖的伸長(zhǎng)調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育[52]。擬南芥突變體中果膠甲酯酶活性降低, 導(dǎo)致莖倒伏, 表明PME活性參與調(diào)節(jié)植株抗倒伏能力[53]。根據(jù)注釋信息,與植物細(xì)胞的氧化還原酶活性相關(guān),參與細(xì)胞壁大分子代謝過(guò)程、木質(zhì)部發(fā)育,潛在參與植物器官形態(tài)發(fā)生以及分生組織生長(zhǎng),功能注釋與細(xì)胞壁生物發(fā)生、葡糖醛酸木聚糖代謝過(guò)程、木聚糖生物合成過(guò)程相關(guān)。通過(guò)序列比對(duì), 發(fā)現(xiàn)上述7個(gè)候選基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)在雙親中無(wú)變異位點(diǎn)。進(jìn)一步對(duì)自然群體4414份大豆材料的遺傳多樣性分析, 可知、和在大豆馴化中存在選擇性清除現(xiàn)象, 其中的hap0單倍型、的hap4單倍型、的hap0單倍型可能在大豆馴化中參與RSTZ形態(tài)建成, 對(duì)于大豆抗倒伏能力提升發(fā)揮重要作用。

已有研究報(bào)道表明miRNAs在次生生長(zhǎng)中至關(guān)重要, 其中過(guò)表達(dá)導(dǎo)致木質(zhì)素沉積減少, 木質(zhì)部導(dǎo)管和纖維次生細(xì)胞壁厚度減小[54]。Zhao等[55]介紹了miR857調(diào)控?cái)M南芥轉(zhuǎn)錄, 進(jìn)而影響次生木質(zhì)部細(xì)胞壁中木質(zhì)素的含量。結(jié)合細(xì)胞學(xué)解剖特征分析(圖1), 這些基因可能與miRNAs共同參與木質(zhì)素的合成代謝, 通過(guò)調(diào)控單位面積的維管束數(shù)目、維管束鞘厚度影響RSTZ的發(fā)育, 進(jìn)而影響大豆生長(zhǎng)過(guò)程中RSTZ組織的形態(tài)變化。

4 結(jié)論

本研究對(duì)大豆根莖過(guò)渡區(qū)(RSTZ)進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分鑒定, 并利用BSA-seq技術(shù)定位到19號(hào)染色體上與其表型顯著相關(guān)的2.87 Mb區(qū)間。結(jié)合生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)綠組數(shù)據(jù)以及熒光定量分析, 最終得到7個(gè)可能調(diào)控大豆RSTZ形態(tài)的候選基因、、、、、和。其中,、和在大豆馴化中潛在影響RSTZ形態(tài)建成。本研究結(jié)果為解析大豆RSTZ組織形成及其遺傳基礎(chǔ)提供理論依據(jù), 并為完善大豆抗倒伏株型提供新的見(jiàn)解。

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Identification and gene mapping of soybean mutantMin root-stem transition zone

MIAO Long1,**, SHU Kuo1,**, LI Juan1, HUANG Ru1, WANG Ye-Xing1, Soltani Muhammad YOUSOF1, XU Jing-Hao1, WU Chuan-Lei1, LI Jia-Jia1, WANG Xiao-Bo1,*, and QIU Li-Juan2,*

1College of Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, Anhui, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / the National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI), the Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Key Laboratory of Crop Gene Resource and Germplasm Enhancement, the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081, China

Root-stem transition zone (RSTZ) connects roots and stems, and its morphology modifies the structure of aerial part and lodging resistance potential in soybean. In this study, a soybean mutantM,appearing with curved or rotated RSTZ, was obtained by EMS mutagenesis. Its morphological characteristics were stably inherited and could provide specific sources for exploring the development patterns of soybean stems. Therefore, this mutant was crossed with Zhonghuang 13 to construct a recombinant inbred line population. By comparing the anatomical structure of vertical RSTZ and curved RSTZ, the wider vascular cambium, more secondary xylem cell layers and irregular cell shape were identified in curved lines, indicating that vascular cambium differentiation may be one of the important factors leading to the difference of RSTZ morphology. Subsequently, the chemical compositions of lines with vertical RSTZ or curved RSTZ were determined, respectively. It was found that the higher lignin and crude fiber content in the RSTZ, the more difficult to bend. The RSTZ with curved or vertical lines were further selected for BSA-seq. SNP-index and InDel-index methods were employed to mine a significant association region, Chr. 19: 43,030,943-45,849,854 containing 319 genes, which may regulate RSTZ morphology. Combined bioinformatics analysis, gene annotation information and expression abundance analysis, seven candidate genes (,,,,,,) were screened. Among them,,, andpotentially affected RSTZ morphogenesis in soybean domestication. This study not only provides germplasm resources for the understanding of soybean RSTZ tissue formation and its genetic basis, but also provides new insights for further exploration of genes regulating soybean stalk development.

soybean; root and stem transition zone; mutant; BSA-seq; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2024.34142

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2021YFD1201605), 安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2308085MC88, 2108085QC114)和安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(k2031005)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2021YFD1201605), the Natural Science Foundation of Anhui Province (2308085MC88, 2108085QC114), and the Natural Science Foundation Project of Anhui Agricultural University (k2031005).

王曉波, E-mail: wxbphd@163.com; 邱麗娟, E-mail: qiulijuan@caas.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

苗龍, E-mail: lmiao5@163.com; 舒闊, E-mail: 1125974604@qq.com

2023-07-20;

2024-01-12;

2024-02-08.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240205.1150.004

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).