岳成廣 李忠慧 劉晨曦 賀三剛 馬海葉 劉璇 李婧平 李文蓉

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.024

摘? 要：【目的】分析不同基因編輯類型對成纖維生長因子5 （FGF5）基因編輯細(xì)毛羊羊毛性狀的影響，為開展基因編輯細(xì)毛羊的羊毛性狀遺傳參數(shù)評估提供理論依據(jù)。

【方法】收集181只FGF5周歲基因羊，分析編輯細(xì)毛羊羊毛自然長度、伸直長度、羊毛纖維直徑和剪毛量等性狀的數(shù)據(jù)。

【結(jié)果】FGF5基因編輯細(xì)毛羊羊毛自然長度平均值為10.49 cm，變異系數(shù)為11.82%。FGF5-InDel和FGF5-HDR基因編輯細(xì)毛羊羊毛自然長度和剪毛量均極顯著高于野生型（P<0.01）。-28 bp或-26 bp、2 bp和置換（c.61 C>T）的羊毛自然長度和伸直長度均極顯著長于wt（P<0.01），-28 bp或-26 bp的剪毛量顯著高于wt（P<0.05）。-28 bp基因型的雙等位基因編輯和單等位基因編輯突變的羊毛自然長度和伸直長度均極顯著長于野生型（P<0.01）。

【結(jié)論】不同基因編輯類型的FGF5基因編輯細(xì)毛羊均可顯著提高羊毛自然長度和剪毛量，可利用表型性狀突出的后代組建核心編輯羊群體，促進(jìn)FGF5基因編輯細(xì)毛羊選育擴(kuò)繁。

關(guān)鍵詞：FGF5基因編輯細(xì)毛羊；編輯類型；羊毛自然長度；剪毛量；基因型；突變類型

中圖分類號：S826；S814.8??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??? 文章編號：1001-4330（2024）03-0734-08

收稿日期（Received）：

2023-07-09

基金項(xiàng)目：

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)子課題“長毛型轉(zhuǎn)基因超細(xì)毛羊的培育”（2016ZX08008001-002）

作者簡介：

岳成廣（1997-），男，河南人，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，（E-mail）945372465@qq.com

通訊作者：

李文蓉（1969-），女，江蘇人，研究員，博士，碩士生/博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，（E-mail）xjlwr@126.com

0? 引 言

【研究意義】羊毛是細(xì)毛羊主要的高附加值產(chǎn)品，是一種純天然、可再生、可降解的綠色環(huán)保型纖維，具有透氣性、吸濕性［1］，在紡織業(yè)中具有重要作用［2］。羊毛自然長度、剪毛量、羊毛纖維直徑是細(xì)毛羊重要的經(jīng)濟(jì)性狀，羊毛自然長度更是評價(jià)羊毛品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可為FGF5基因修飾細(xì)毛羊的培育提供有效的技術(shù)手段，縮短了育種進(jìn)程。

將基因編輯育種技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，分析影響基因編輯羊羊毛性狀與羊毛品質(zhì)性狀相關(guān)的基因編輯類型，選擇表型更加突出的基因編輯細(xì)毛羊進(jìn)行定向擴(kuò)繁，培育具有毛品質(zhì)性狀和生產(chǎn)性能優(yōu)良的基因編輯細(xì)毛羊新群體，對FGF5基因編輯細(xì)毛羊的擴(kuò)繁有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated nuclease）是有效、便捷的基因組編輯技術(shù)［3，4］，其不同于常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，是通過細(xì)胞修復(fù)Cas9核酸酶在靶向位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（Double-strand breaks，DSBs），實(shí)現(xiàn)對動(dòng)物基因組本身進(jìn)行刪除、缺失、插入等突變修飾，達(dá)到改變其目標(biāo)性狀的目的［5］。由于不導(dǎo)入任何外源DNA序列成分到動(dòng)物基因組，基因編輯技術(shù)受到關(guān)注，突出性狀表現(xiàn)的基因編輯家畜［6］，為某些與基因型相關(guān)的動(dòng)物疾病提供新的解決思路［7］。成纖維細(xì)胞生長因子5（Febroblast Growth factor，F(xiàn)GF5）基因是目前功能較為明確、決定毛發(fā)長度的重要候選基因之一［8，9］。其通過阻止毛乳頭細(xì)胞的激活和增殖，促使毛囊生長由興盛期向休止期轉(zhuǎn)化，抑制了毛囊生長［10，11］。由于FGF5具有抑制毛囊生長，抑制FGF5的功能或阻斷FGF5信號通路將促進(jìn)毛發(fā)生長［12-14］。綿羊FGF5位于綿羊6號染色體，F(xiàn)GF5基因組全長21 743 bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，全長FGF5的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小為813 bp，三個(gè)外顯子的長度分別為361、104和348 bp［15］。高原等［16］對內(nèi)蒙古絨山羊的FGF5基因靶向敲除后毛長有明顯增加；Hu等［17］研究表明與野生型綿羊相比，F(xiàn)GF5敲除羊的羊毛長度更長；利用CRISPR/Cas9技術(shù)在綿羊體內(nèi)過表達(dá)截短型FGF5，能夠阻斷FGF5的功能作用，促進(jìn)羊毛生長、提高羊毛長度和產(chǎn)毛量［12］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用CRISPR/Cas9創(chuàng)制FGF5基因編輯細(xì)毛羊以來，7年間通過人工授精或自然交配擴(kuò)繁，擴(kuò)大基因型一致的基因編輯羊群數(shù)量，完成了分子特征和脫靶檢測評價(jià)、精液遺傳穩(wěn)定性、表型評價(jià)和自身健康狀況的安全性評價(jià)［18，19］，目前已擁有FGF5基因編輯細(xì)毛羊群體。需系統(tǒng)評價(jià)FGF5基因突變對主要羊毛性狀遺傳改良效果。

【擬解決的關(guān)鍵問題】比較該群體不同基因編輯類型（包括編輯方式、編輯基因型和突變類型）的FGF5基因編輯細(xì)毛羊羊毛性狀的影響，分析基因編輯類型對FGF5基因編輯羊羊毛性狀的影響作用，為FGF5基因編輯細(xì)毛羊主要羊毛性狀的遺傳評估提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材 料

表型性狀數(shù)據(jù)采用新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所綿羊繁育基地2016～2022年FGF5基因編輯周歲羊和正常野生型周歲羊，測定羊毛自然長度、伸直長度、羊毛纖維直徑和剪毛量等測量數(shù)據(jù)。公羊和母羊斷乳后單獨(dú)組群飼養(yǎng)，TMR日糧組成以玉米青貯、苜蓿為主，配以適量天康672精料補(bǔ)充料，采取定量飼喂方式，每日兩次采食，自由飲水。

1.2? 方 法

1.2.1? FGF5基因編輯細(xì)毛羊擴(kuò)繁和后代編輯基因型的鑒定

前期利用CRISPR/Cas9技術(shù)基因編輯技術(shù)對中國美利奴細(xì)毛羊FGF5基因進(jìn)行編輯修飾后［12］，獲得了基于非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）的InDel（Insertion and deletion，InDel）基因編輯細(xì)毛羊和基于同源序列介導(dǎo)的同源重組（Homology-directed repair，HDR）的精準(zhǔn)編輯的FGF5基因編輯細(xì)毛羊F0代。FGF5基因編輯羊主要編輯基因型，其中FGF5編輯基因型28堿基刪除、26堿基刪除、2堿基刪除和置換（c.61 C>T）分別用-28、-26和-2 bp和置換表示。表1

配種前對FGF5基因編輯公羊進(jìn)行補(bǔ)飼和采精訓(xùn)練，挑選4只F0代公羊作為配種公羊，進(jìn)行精液基因型鑒定和品質(zhì)分析，確定含有FGF5基因編輯公羊的精子攜帶了FGF5編輯基因突變。采用基因編輯純合子公羊配基因編輯雜合子母羊或野生型母羊、雜合子基因編輯公羊配雜合子基因編輯母羊或野生型母羊的配種方案，并用人工輸精和自然本交的配種方式對基因編輯細(xì)毛羊進(jìn)行配種擴(kuò)繁，獲得的擴(kuò)繁后代包含4個(gè)不同的家系。

采集擴(kuò)繁后代的尾部組織樣品，用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒（北京天根）提取基因組DNA，按照文獻(xiàn)［12］，采用目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物測序和序列比對為主、T-A克隆為輔的策略進(jìn)行基因編輯羊擴(kuò)繁個(gè)體編輯基因型的鑒定。表2

1.2.2? 主要羊毛性狀性能測定

基因編輯羊與正常野生羊產(chǎn)羔期（3～4月）基本一致，所有性狀均按照《細(xì)毛羊鑒定項(xiàng)目、符號、術(shù)語》（NY1-2004）標(biāo)準(zhǔn)測量。羊毛自然長度和剪毛重由鑒定員場內(nèi)測定，根據(jù)“國家羊毛質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)”（GB1523-2013）采集周歲母羊身體左側(cè)肩胛骨后緣一掌處部位的羊毛樣品在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行伸直長度手工測量，將采集每只個(gè)體毛樣，順著毛叢的方向，分出10個(gè)毛束。在毛樣自然卷曲狀態(tài)下，測量毛束從根部到毛梢的長度，取平均值作為實(shí)驗(yàn)室測量毛束自然長度；另外，每個(gè)毛叢用尖頭鑷子捏住羊毛的根部和毛梢拉直羊毛，測量毛叢從根部到毛梢的長度，取平均值作為實(shí)驗(yàn)室測量毛束伸直長度。計(jì)算毛束伸直率，即毛束伸直率（毛束伸直長度－毛束自然長度）/毛束自然長度，以“現(xiàn)場鑒定自然長度×（1+伸直率）”作為個(gè)體的實(shí)際伸直長度。

根據(jù)GB/T21030-2007操作手冊利用OFDA 2000測定個(gè)體毛樣的羊毛纖維平均直徑，委托農(nóng)業(yè)部－新疆種羊及羊毛羊絨質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心完成。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2021軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后得到148條FGF5-InDel基因編輯周歲羊記錄，33條FGF5-HDR基因編輯周歲羊記錄，29條陰性對照周歲羊記錄，以用于FGF5基因編輯羊毛用性狀的分析。應(yīng)用IBM SPSS Statistics 25軟件對記錄數(shù)、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、最大值和最小值等描述性統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析，對不同編輯方式、編輯基因型和突變類型各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以LSD法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? FGF5基因編輯羊毛用性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

研究表明，F(xiàn)GF5基因編輯羊群體的羊毛自然長度平均為10.49 cm，變異系數(shù)為11.82%。該群體的伸直長度、羊毛纖維直徑和剪毛量的測量值均存在較大的差異，有較大的變異系數(shù)，F(xiàn)GF5基因編輯羊的主要羊毛性狀存在較大的個(gè)體差異，有著一定的選育潛力。表3

2.2? FGF5-InDel和FGF5-HDR基因編輯方式對羊毛性狀的影響

研究表明，F(xiàn)GF5-InDel和FGF5-HDR兩種編輯類型的羊毛自然長度和剪毛量均極顯著高于野生型細(xì)毛羊（WT）（P<0.01），F(xiàn)GF5-InDel和FGF5-HDR兩者差異不顯著（P>0.05）；FGF5-HDR的伸直長度顯著高于FGF5-InDel（P<0.05），極顯著長于WT（P<0.01）；3組間羊毛纖維直徑均無顯著差異（P>0.05）。表4

2.3 ?編輯基因型對羊毛性狀的影響

研究表明，攜帶FGF5不同編輯基因型，即-28 bp或-26 bp、-2 bp和置換的基因編輯羊羊毛自然長度和伸直長度均極顯著長于野生型（WT）（P<0.01），2 bp和置換的剪毛量極顯著高于WT（P<0.01），-28 bp或-26 bp的剪毛量顯著高于WT（P<0.05），各組間羊毛纖維直徑均無顯著差異（P>0.05）。表5

2.4? 相同編輯基因型中等位基因編輯對羊毛性狀的影響

研究表明，選擇群體數(shù)量較多，攜帶-28 bp刪除編輯基因型的FGF5基因編輯羊，比較雙等位基因編輯（-/-）和單等位基因編輯（-/+）突變對羊毛性狀的影響。雙等位基因編輯和單等位基因編輯突變的羊毛自然長度和伸直長度極顯著長于野生型（+/+）（P<0.01），單等位基因編輯突變的剪毛量顯著高于野生型（P<0.05），與雙等位基因的剪毛量差異不顯著，羊毛纖維直徑均無顯著差異（P>0.05）。表6

3? 討 論

3.1

研究中使用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制的FGF5基因編輯羊及其擴(kuò)繁后代的羊毛性狀顯著提高，羊毛自然長度為10.49 cm，剪毛量為4.51 kg，與其他通過CRISPR/Cas9技術(shù)使FGF5基因功能失活能顯著提高羊毛長度的研究結(jié)果一致［16，17］，但這些研究僅是基因編輯羊F0代的羊毛性狀結(jié)果且群體數(shù)量較少。關(guān)鳴軒等［20］報(bào)道了蘇博美利奴羊的毛長和剪毛量性狀均值分別為10.2 cm和3.7 kg；魏趁等［21］報(bào)道的中國美利奴羊（新疆型）的毛長和剪毛量的均值分別為8.949 cm和4.994 kg；喬國艷等［22］以高山美利奴羊?yàn)檠芯繉ο?，毛叢長度和剪毛量的均值分別為10.08 cm和4.195 kg；與選育的正常細(xì)毛羊群體的表型均值相比不一致，除中國美利奴羊（新疆型）的剪毛量高于本群體，其余均低于試驗(yàn)研究群體。其可能是試驗(yàn)群體為FGF5基因編輯羊，經(jīng)CRISPR/Cas9技術(shù)編輯后使FGF5基因功能失活，羊毛長度得到顯著增加。

3.2

前期通過預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表明，由FGF5-InDel所導(dǎo)致的截短FGF5蛋白喪失了原有FGF5的大部分蛋白序列，其中包括行使其生物學(xué)功能作用的β-折疊結(jié)構(gòu)，形成的突變FGF5導(dǎo)致其不能有效激活FGF受體，阻礙了下游的信號傳導(dǎo)，造成FGF5功能喪失［12］；FGF5-HDR精準(zhǔn)替換突變是在FGF5基因外顯子1中提前引入終止密碼子TAA，使得FGF5基因翻譯的蛋白提前終止，進(jìn)而造成FGF5基因僅能翻譯成20個(gè)氨基酸序列，無法正常發(fā)揮生物學(xué)功能，從而達(dá)到阻斷功能型基因表達(dá)的目的。因此研究比較了使用FGF5-InDel和FGF5-HDR方式創(chuàng)制的F0代及其擴(kuò)繁后代的周歲基因編輯細(xì)毛羊的羊毛性狀，發(fā)現(xiàn)FGF5-InDel和FGF5-HDR基因編輯細(xì)毛羊羊毛自然長度和伸直長度顯著長于正常野生型細(xì)毛羊（P<0.01）。FGF5-InDel和FGF5-HDR基因編輯細(xì)毛羊的剪毛量也較正常野生型細(xì)毛羊顯著增加。而且，基因編輯細(xì)毛羊的平均羊毛纖維直徑相比野生型細(xì)毛羊卻無顯著性差異（P>0.05）。FGF5-InDel和FGF5-HDR兩種編輯方式的基因編輯細(xì)毛羊都能顯著提高羊毛自然長度和剪毛量，剪毛量的增加歸因于羊毛長度的增長。

3.3

目前，大多數(shù)通過轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)將外源基因或編輯后的基因整合到宿主動(dòng)物基因組后，均可以得到較好的表達(dá)水平，并且宿主動(dòng)物能表達(dá)相應(yīng)的表型特征［23-25］。其中部分基因編輯動(dòng)物可以將目標(biāo)基因通過生殖細(xì)胞遺傳給下一代。經(jīng)過對基因編輯羊個(gè)體進(jìn)行鑒定，共鑒定到-28 bp、-2 bp和置換等20多種FGF5突變基因型，且通過對F0代基因編輯細(xì)毛羊精液基因型鑒定的研究表明，基因編輯公羊的精液中均存在已知的FGF5編輯基因型，親本所具有的FGF5編輯基因突變能夠通過精液遺傳給后代［19］；進(jìn)一步對常規(guī)繁育技術(shù)獲得的FGF5基因編輯羊的擴(kuò)繁群體開展FGF5突變類型的研究分析，通過比較親本和后續(xù)三代以上后代之間FGF5突變的基因型，發(fā)現(xiàn)親本的FGF5突變的基因型能夠通過生殖細(xì)胞穩(wěn)定地遺傳給后代，其遺傳規(guī)律符合孟德爾遺傳規(guī)律。然而，基因編輯動(dòng)物經(jīng)過擴(kuò)繁的后代是否能夠穩(wěn)定遺傳F0代表型性狀具有不確定性。因此研究對FGF5-InDel中產(chǎn)生的-28 bp或-26 bp、-2 bp以及FGF5-HDR中產(chǎn)生的置換這3種不同編輯基因型的基因編輯細(xì)毛羊羊毛性狀進(jìn)行比較，結(jié)果顯示3種不同基因型的基因編輯細(xì)毛羊自然長度和伸直長度均極顯著長于野生型（P<0.01），剪毛量也較正常野生型細(xì)毛羊顯著增加，羊毛纖維直徑差異不顯著。3種不同基因型的基因編輯細(xì)毛羊均能顯著提高羊毛自然長度和剪毛量，提高羊毛長度可增加剪毛量，擴(kuò)繁后代攜有的編輯基因型均能使FGF基因功能失活，從而獲得羊毛長度顯著增長的這種突出表型性狀

3.4

研究選擇群體數(shù)量較多，攜帶-28 bp基因型的FGF5基因編輯羊的雙等位基因編輯和單等位基因編輯突變進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩種突變類型的羊毛自然長度和伸直長度都顯著長于野生型細(xì)毛羊（P<0.01），單等位基因編輯突變的剪毛量顯著高于雙等位基因編輯突變和野生型細(xì)毛羊（P<0.05），但雙等位基因突變、單等位基因突變和野生型的剪毛量差異不顯著，是受到選配方案造成近親繁殖的影響。FGF5基因編輯羊的單、雙等位基因編輯突變均能顯著提高羊毛長度，基因編輯羊擴(kuò)繁后代具有親本突出表型性狀。

3.5

FGF5不同基因編輯類型（包括編輯方式、編輯基因型和突變類型）的羊毛性狀較野生型有顯著提高。但由于NHEJ途徑修復(fù)DSBs通常會(huì)產(chǎn)生小片段的插入和缺失，使得FGF5-InDel編輯策略會(huì)導(dǎo)致陽性FGF5編輯羊產(chǎn)生多種形式的編輯基因型，會(huì)給隨后的群體擴(kuò)繁、選種選配，以及組建基因編輯類型相對單一的育種群體造成一定困難。另外，群體中個(gè)體的羊毛性狀依然存在較大變異，下一步需在大規(guī)模群體上開展遺傳評估，但由于現(xiàn)階段群體規(guī)模有限，完全依靠F0代組建具有一定群體數(shù)量的FGF5基因編輯羊群體存在困難，因此要通過現(xiàn)有技術(shù)策略對表型性狀突出的基因編輯羊后代進(jìn)行選育，借助常規(guī)繁殖手段對基因編輯F0代以及表型性狀突出、基因型相對一致的后代進(jìn)行擴(kuò)繁是今后主要手段，擴(kuò)繁能穩(wěn)定遺傳突出表型性狀的后代對核心編輯羊群體的建立至關(guān)重要。

4? 結(jié) 論

FGF5不同基因編輯類型均可顯著提高FGF5基因編輯羊的羊毛自然長度和剪毛量。FGF5-InDel和FGF5-HDR兩種編輯策略獲得的基因編輯羊及其后代的周歲主要羊毛性狀表型值均優(yōu)于正常野生型細(xì)毛羊，其中FGF5-HDR編輯方式的羊毛性狀表型值最高。FGF5-HDR基因編輯羊的編輯基因型相對單一，有利于獲得編輯基因型一致、性狀突出、遺傳穩(wěn)定的核心編輯羊群體。

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Effects of different gene editing types on traits of FGF5 gene-edited sheep wool

YUE Chenggung1，LI Zhonghui1，2，LIU Chenxi1，2，HE Sangang1，2，MA Haiye3，LIU Xuan3，LI Jingping1，LI Wenrong1，2

（1. Institute of Biotechnology，Xinjiang Academy of Animal Sciences，Urumqi 830011，China; 2.Key Laboratory of Animal Biotechnology of Xinjiang，Urumqi 830011，China; 3.College of Animal Sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

Abstract：【Objective】 To study the effects of different gene editing types on wool traits in FGF5 gene-edited fine-wool sheep in the hope of providing a theoretical basis for subsequent studies on the genetic parameters of wool traits in gene-edited fine-wool sheep.

【Methods】? In this study，data on traits such as wool length，wool straight length，wool fiber diameter and greasy fleece weight from 181 FGF5-year-old gene-edited fine-wood sheep from the sheep breeding base of Xinjiang Academy of Animal Sciences were collected for analysis.

【Results】? The wool length of FGF5 gene editing fine wool sheep was 10.49 cm with a coefficient variation of 11.82%.Wool length and greasy fleece weight of FGF5-InDel and FGF5-HDR gene-edited fine-wool were extremely significant higher than that of the wild type（P<0.01）.The wool length and wool straight length of -28 bp or -26 bp，-2 bp and replacement（c.61 C>T） were extremely significant longer than that of the wild type（P<0.01），and the greasy fleece weight at -28 bp or -26 bp was significantly higher than that of the wild type（P<0.05）.The wool length and wool straight length of double-allele-edited and single-allele-edited mutations of the -28 bp genotype had extremely significantly longer than those of thewild type（P<0.01）.

【Conclusion】? Different gene editing types of FGF5 gene editing in fine wool sheep significantly increase the wool length and greasy fleece weight，which can be used to form a core population of gene-edited sheep with outstanding phenotypic traits，promote the selection and expansion of FGF5 gene-edited sheep.

Key words：FGF5 gene-edited fine-wool sheep; edit type; wool length; greasy fleece weight; genotype; mutation type

Fund project：National Major Special Sub project for the Cultivation of New Genetically Modified Biological Varieties "Cultivation of Long Hair Type Genetically Modified Superfine Wool Sheep"（2016ZX0808001-002）

Correspondence author： LI Wenrong（1969 -），female，from Jiangsu， researcher，Ph.D， doctoral supervisor，majoring in animal genetics and breeding，（E-mail） xjlwr@126.com