胡志宏

（百色市茶業(yè)發(fā)展中心，廣西 百色 533000）

“凌云白毫茶”原名白毛茶，因其葉背長滿白毫而得名，據(jù)考證有一千多年的生長歷史，是全國第一批認定的國家級茶樹良種之一[1]。《中國名茶志》記載：凌云白毛茶為歷史名茶，創(chuàng)于清乾隆以前，原產(chǎn)于凌云縣。“凌云白毫茶”因其葉背長滿白毫而得名，主產(chǎn)于凌云縣四季云霧繚繞的岑王老山、青龍山一帶[2]。得天獨厚的自然環(huán)境，使凌云白毫茶以色翠、毫多、香醇、味濃、耐泡五大特色成為中國名茶中的新秀[3]?！傲柙瓢缀敛琛比~芽肥壯，持嫩性好，加工后條索緊結微曲、白毫顯露，香氣馥郁持久、回味甘甜、板栗香型，而且適宜性強，目前已開發(fā)出綠、紅、白、青、黃、黑等六大茶類，在國內(nèi)外享有較高的聲譽。

從1995年確定為優(yōu)良單株，歷經(jīng)28年的努力，廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所科研人員選育的“桂熱2號”茶樹新品種于2023年正式獲得國家級優(yōu)良品種登記[4]?！肮馃?號”屬喬木型大葉類，偏早芽，特顯毫，樹勢強且適制綠茶、紅茶及黃茶，適宜在廣西地區(qū)栽培，現(xiàn)已在崇左市、百色市、柳州市等地推廣[5]?！肮馃?號”制作的綠茶條索緊結，外形肥壯，香氣持久，有栗香，滋味鮮爽醇厚；制紅茶，外形顯毫，烏潤、勻凈、香氣持久，滋味濃強、鮮爽?！肮馃?號”所制茶產(chǎn)品曾7次在“中茶杯”“國飲杯”、中國黃茶斗茶大賽等全國性茶葉評比中榮獲特等獎、一等獎、金獎，是極具推廣潛力的廣西本土茶葉品種?！肮馃?號”茶樹品種的優(yōu)良特性將有利于其在廣西茶區(qū)大面積推廣，對廣西茶園品種結構優(yōu)化調整及茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有良好的促進作用，同時可新增廣西茶產(chǎn)品的種類，提升產(chǎn)品品質與產(chǎn)量，促進茶企及茶農(nóng)增收[6]。

維生素B6（vitamin B6，VB6）發(fā)現(xiàn)于20世紀30年代，屬于B族的水溶性維生素，遇光或堿易被破壞且不耐高溫[7]。VB6是生物體必需的微量營養(yǎng)物質，參與人體重要細胞代謝，同時具有抗氧化、抗病毒及抗炎等功能，對心腦血管疾病、糖尿病、癌癥和神經(jīng)性疾病等多種疾病治療至關重要，在食品和制藥行業(yè)中具有極高商業(yè)價值[8]。Chen CC等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在PDXK或PLP水平上，維生素B6的藥理學阻斷明顯有著抗白血病活性，維生素B6代謝通路在開發(fā)抗白血病的藥物中有著重要的研究價值。張憶美[10]研究表明，對輕、重度膿毒癥大鼠的6小時和12小時各組間的差異代謝物通過代謝途徑分析，結果均與維生素B6代謝途徑相關，進一步證明了維生素B6在預防膿毒癥腦功能障礙中有一定的作用。

轉錄組分析在破譯基因結構和功能，識別細胞、生理生化甚至生物系統(tǒng)基礎的遺傳網(wǎng)絡以及應對生物和非生物脅迫方面發(fā)揮著至關重要的作用。目前，轉錄組測序技術在茶樹功能基因探索[11]、制茶工藝[12]、品質及功效研究[13-14]等方面有著廣泛的應用。目前，關于“凌云白毫茶”和“桂熱2號”的轉錄組學研究報道較少，基于此，本研究以這兩個茶樹品種為試驗材料，進行維生素B6代謝通路的轉錄組分析，探索“凌云白毫茶”和“桂熱2號”在維生素B6上的差異，以期為二者的功能開發(fā)及深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集地點：廣西百色市凌云縣廣西正道茶業(yè)有限公司茶園

采集時間：2023年7月

采集對象：“凌云白毫茶”茶樹枝條上的一芽二葉，三個重復，樣本編號為A；“桂熱2號”為嫁接茶樹（砧木為“凌云白毫茶”），同樣為茶樹枝條上的一芽二葉，三個重復，樣本編號為B。

1.2 試驗方法

通過對試驗材料進行轉錄組測序，將獲得的Clean Reads使用HISAT2[15]比對到參考基因組[16]以獲取在參考基因組或基因上的位置信息和測序樣本唯一的序列特征信息。然后對2個樣本的FPKM值進行統(tǒng)計，用DEseq軟件分析差異基因表達，將差異基因篩選后注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中，并重點分析維生素B6代謝KEGG通路和進行GSEA分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析Microsoft Excel 2019軟件，轉錄組分析用R軟件進行。

2 結果與分析

2.1 PCA分析

通過對樣本的PCA分析（主成分分析），可以反映不同樣本之間組成成分的差異。如圖1所示，樣本的第一主成分（PC1）為49.87%，第二主成分（PC2）為15%，第三主成分（PC3）為12.9%且兩個樣本在3D圖中存在明顯的空間距離，說明兩個茶樹品種的基因組成有著顯著區(qū)別。

圖1 各組樣本基因的PCA得分圖

2.2 差異基因KEGG通路富集分析

生物體內(nèi)的不同基因產(chǎn)物通過相互作用行使生物學功能，對差異基因的通路注釋分析有助于進一步解讀基因的功能。在A與B的比較中，有2219個差異基因被注釋到了138條通路中，這些通路主要包括類胡蘿卜素生物合成、植物-病原相互作用、核黃素代謝、單萜生物合成、D-氨基酸代謝等途徑（圖2）。

圖2 樣本A和B差異基因KEGG富集圖

2.3 維生素B6代謝KEGG通路分析

在進行KEGG富集分析之后，選取維生素B6代謝通路（ko00750）進一步分析，共有4個酶和6個差異基因參與此通路。其中，一個差異基因對應吡哆醛磷酸酶（EC:3.1.3.74），一個差異基因對應吡哆胺5'-磷酸氧化酶（EC:1.4.3.5），一個差異基因對應吡哆醛5'-磷酸合成酶pdxS亞基（EC:4.3.3.6），三個差異基因對應吡哆醇4-脫氫酶（EC:1.1.1.65），酶和基因的對應關系如表1所示，有2個上調基因，4個下調基因。圖3為差異基因參與的維生素B6代謝通路可視化。

表1 與維生素B6代謝通路相關的基因

圖3 維生素B6代謝通路的差異基因

2.4 維生素B6代謝KEGG通路GSEA分析

常規(guī)的基于超幾何分布的富集分析依賴于顯著上調或下調的基因，容易遺漏部分差異表達不顯著但有重要生物學意義的基因?；蚣患治觯℅SEA）[17]不需要指定明確的差異基因閾值，把基因按照在兩組樣本中的差異表達程度進行排序，然后采用統(tǒng)計學方法檢驗預先設定的基因集合是否在排序表的頂端或底端富集。GSEA分析可以有效解釋某個通路中既有上調基因又有下調基因時該通路總體上是被抑制還是被激活的狀態(tài)。

通過GSEA分析，發(fā)現(xiàn)維生素B6代謝KEGG通路的ES值（Enrichment Score富集得分值）為0.27，NES值（ES值標準化后的富集得分值）為1.16，NOM p-val值（p值，富集分析統(tǒng)計學顯著水平）為0.22，F(xiàn)DR q-val值（對p值的校正）為0.44，F(xiàn)WER p-val值（總體錯誤率P值）為1。從維生素B6代謝通路的背景基因聚類熱圖（圖4）中發(fā)現(xiàn)注釋到該通路的基因有43個（CSA031162、CSA013361、CSA011221、CSA034509、novel.20473、CSA021653、CSA033984、CSA011806、CSA011222、CSA021654、CSA004703、CSA004704、CSA011807、CSA004138、CSA029833、CSA011805、CSA005035、CSA029934、CSA035444、CSA025321、CSA016678、CSA000602、CSA031802、Novel.19988、CSA006642、CSA030934、CSA005036、CSA028404、CSA005241、CSA 036155、Novel.6649、CSA031803、CSA022002、CSA022003、CSA031801、CSA028518、CSA016826、CSA034003、CSA035284、CSA011220、CSA007728、CSA017295、CSA020372），占總背景基因數(shù)18858個的0.23%。其中，CSA031162、CSA013361、CSA011221、CSA034509、novel.20473等五個基因為核心基因，在該通路中起到較大的作用，貢獻較大（表2）。同時從GSEA富集分析結果圖6中可以看出B在折線圖中的折線和X坐標軸形成的面積相較于A更大。綜上所述，A相比于B在維生素B6代謝KEGG通路中，整體上A受到了抑制，B得到了激活，B在該通路中更為活躍。

表2 維生素B6代謝通路的GSEA富集分析表y

圖4 維生素B6代謝通路的背景基因聚類熱圖

圖5 維生素B6代謝通路的GSEA富集分析結果圖

3 討論

維生素B6是一種低分子有機化合物，在促進動物健康生長發(fā)育和維持正常生理功能上發(fā)揮著重要作用。維生素B6可作為輔酶參與氨基酸、碳水化合物、脂類及核酸代謝等140多種生化反應。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，維生素B6還具有調節(jié)氧化應激和炎癥反應的作用。維生素B6缺乏與多種炎癥性疾病的患病風險增加有著密切聯(lián)系[18]。Mei M等[19]研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌在VB6代謝過程中，醛氧化酶、磷酸絲氨酸轉氨酶和吡哆胺5'-磷酸氧化酶的表達減少，其合成產(chǎn)物吡哆醛（VB6主要成分之一）和4-吡哆酸的表達減少，最終證明了VB6可改善慢性肝損傷的炎癥細胞侵襲、肝細胞水腫和變性。本研究中“凌云白毫茶”相比于“桂熱2號”的通路中的吡哆胺5'-磷酸氧化酶呈現(xiàn)下調表達，共有2個上調基因，4個下調基因，且通過GSEA富集分析可以看出B在該通路中更為活躍。所以從維生素B6對茶葉的影響來看，推測出用“桂熱2號”制茶在藥用及保健功能上更有效果。

4 結論

本研究對兩個茶樹品種的維生素B6代謝通路進行轉錄組分析，結果表明，“凌云白毫茶”與“桂熱2號”相比，有2219個差異基因被注釋到了138條通路中，這些通路主要包括類胡蘿卜素生物合成、植物-病原相互作用、核黃素代謝、單萜生物合成、D-氨基酸代謝等途徑。在維生素B6代謝KEGG通路（ko00750）分析中，共有4個酶和6個差異基因參與此通路（2個上調基因，4個下調基因）。通過GSEA分析，發(fā)現(xiàn)維生素B6代謝KEGG通路的ES值為0.27，NES值為1.16，NOM p-val值為0.22，F(xiàn)DR q-val值為0.44，F(xiàn)WER p-val值為1。該通路43個背景基因中的CSA031162、CSA013361、CSA011221、CSA034509、novel.20473等五個基因為核心基因，且“桂熱2號”在該通路中顯得更為活躍。