劉莉娟,儲(chǔ)雯雯,王 夢,閆 濤,龔 真,周 強(qiáng),劉 周

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,安徽 合肥 230601)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, KP)是引起醫(yī)院感染常見的革蘭陰性桿菌[1]。隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應(yīng)用,臨床出現(xiàn)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)播散流行[2]。VI型分泌系統(tǒng)(type VI secretion system, T6SS)是一種新的毒力因子,在KP中可通過分泌效應(yīng)蛋白實(shí)現(xiàn)抗菌和抗宿主功能,與醫(yī)院環(huán)境適應(yīng)性、生物膜形成及宿主內(nèi)定植能力密切相關(guān),并能促進(jìn)基因水平轉(zhuǎn)移,以及毒力因子和耐藥基因的傳播[3-4]。

T6SS組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜,包含多種蛋白,其中內(nèi)管蛋白Hcp和刺突蛋白VgrG是T6SS向靶細(xì)胞釋放效應(yīng)蛋白的關(guān)鍵成分,同時(shí)也是T6SS的關(guān)鍵分泌蛋白。IcmF是具有ATP酶活性的膜間蛋白,是T6SS的必要成分,參與效應(yīng)蛋白進(jìn)入靶細(xì)胞[5-7]。研究[7-9]證明這三種蛋白在T6SS發(fā)揮生理學(xué)功能中的重要性,并將編碼此三種蛋白的基因同時(shí)陽性認(rèn)定為T6SS陽性。

盡管T6SS在血流感染KP中的檢出率已有相關(guān)報(bào)道[10],但其在CRKP中的檢出率,及其和毒力基因、耐藥基因之間的關(guān)系研究較少。因此,本研究回顧性分析安徽地區(qū)某省級綜合性三級甲等醫(yī)院2019年1月—2022年12月CRKP臨床分離株的感染特征,檢測T6SS在CRKP中的檢出率,以及T6SS陽性CRKP毒力基因、耐藥基因的檢出率和生物膜形成能力,以期為CRKP的臨床防控和治療提供相關(guān)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2019年1月—2022年12月安徽地區(qū)某省級綜合性三級甲等醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)CRKP菌株。判定標(biāo)準(zhǔn)為對至少一種碳青霉烯類抗生素耐藥或攜帶碳青霉烯酶耐藥基因的KP。同時(shí)收集CRKP來源患者的性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、抗菌藥物使用情況和臨床轉(zhuǎn)歸等臨床資料。本研究經(jīng)該院倫理委員會(huì)審查同意(批準(zhǔn)號(hào):PJ-YX2022-083)。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥物敏感性(藥敏)試驗(yàn) 血瓊脂平板培養(yǎng)細(xì)菌并分離純化,應(yīng)用Microflex-LT/SH型質(zhì)譜分析儀(德國BRUKER公司)進(jìn)行細(xì)菌鑒定,應(yīng)用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀(法國BioMérieux公司)檢測CRKP抗菌藥物耐藥性,結(jié)果判定參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2020年版標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.2.2 T6SS基因、毒力基因檢測 采用煮沸法提取菌株DNA模板,PCR檢測T6SS關(guān)鍵基因hcp、icmF、vgrG,擴(kuò)增條件及方法參見文獻(xiàn)[5]。上述三個(gè)關(guān)鍵基因均陽性判定為T6SS陽性[5],并根據(jù)該結(jié)果將菌株分為T6SS陽性組和T6SS陰性組。同時(shí)采用PCR法檢測毒力基因,包括iucA、allS、iroB、mrkD、rmpA、rmpA2、entB、wabG、fimH、peg344和ybtS,擴(kuò)增條件及方法參見文獻(xiàn)[12]。

1.2.3 分子分型、莢膜血清分型和耐藥基因檢測 采用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST)檢測CRKP序列分型(sequence typing, ST),PCR法檢測管家基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB,將序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫,最終確定ST型[13]。采用PCR法聯(lián)合測序技術(shù)檢測CRKP菌株莢膜wzi分型[14]。采用PCR法檢測blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaNDM和blaOXA-485種耐藥基因,將序列提交至BLAST網(wǎng)站進(jìn)行比對,最終確定碳青霉烯酶耐藥基因分型。擴(kuò)增條件及方法參見文獻(xiàn)[15]。

1.2.4 生物膜形成試驗(yàn) 采用96孔板結(jié)晶紫染色法評估生物膜形成能力[7]。隨機(jī)選取T6SS陽性、陰性菌株各10株,制備成0.5麥?zhǔn)媳葷釂挝?McF)菌懸液,每孔中加入10 μL菌懸液和190 μL MHB肉湯,每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔,36℃培養(yǎng)48 h后棄去所有菌液并使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍。干燥后采用200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色30 min,PBS洗凈多余染料后干燥。每孔加入無水乙醇后,采用酶標(biāo)儀測量570 nm處吸光度,得出相對于對照的生物膜測量值。每板最后3個(gè)孔加入200 μL MHB肉湯作為陰性對照。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用WHONET 2021軟件分析菌株對抗菌藥物的耐藥率,應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件作圖,其他統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 21.0軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)和Fisher確切概率法,計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn),以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株情況及臨床患者感染特征 共納入非重復(fù)菌株160株。其中T6SS陽性菌株129株(80.6%),T6SS陰性菌株31株(19.4%)。標(biāo)本來源為痰(75株,46.9%)、血(42株,26.3%)、尿(15株,9.4%)、膿及分泌物(14株,8.7%)、腹腔積液及關(guān)節(jié)腔液(8例,5.0%)、膽汁(3株,1.9%)、穿刺液(2株,1.3%)、尖端引流管(1株,0.6%)。T6SS陽性組與陰性組患者在性別、年齡、標(biāo)本來源等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。T6SS陽性組患者患慢性肺部疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病比例均高于陰性組,其預(yù)后較T6SS陰性組患者差(均P<0.05)。見表1。

表1 T6SS陽性組與陰性組患者臨床特征比較[例(%)]

2.2 體外藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,CRKP對多黏菌素B、替加環(huán)素、頭孢他啶/阿維巴坦耐藥率分別為3.1%、8.1%、25.6%,對其余藥物耐藥率均較高。T6SS陽性組和陰性組菌株對不同抗菌藥物耐藥率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖1。

注:FEP為頭孢吡肟,CAZ為頭孢他啶,CRO為頭孢曲松,TZP為哌拉西林/他唑巴坦,ETP為厄他培南,IMP為亞胺培南,MEM為美羅培南,SCF為頭孢哌酮/舒巴坦,LEV為左氧氟沙星,AK為阿米卡星,CZA為頭孢他啶/阿維巴坦,TGC為替加環(huán)素,PB為多黏菌素B。

PCR法檢測碳青霉烯類耐藥基因,blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48在CRKP中的檢出率分別為80.6%、1.9%、17.5%、2.5%,未檢測出blaVIM。檢測出的blaKPC基因型均為KPC-2,blaNDM中檢測出NDM-1、NDM-4、NDM-5、NDM-7。blaKPC、blaIMP、blaNDM檢出率在T6SS陽性組和T6SS陰性組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),blaOXA-48在T6SS陰性組的檢出率高于T6SS陽性組(P<0.05)。見表2。

表2 T6SS陽性組和T6SS陰性組耐藥基因分析[株(%)]

2.3 分子分型及毒力基因檢測結(jié)果 MLST結(jié)果顯示,CRKP中以ST11型(68.8%)為主,其次為ST15型(6.3%)。T6SS陽性組中ST11型CRKP的占比高于T6SS陰性組(P<0.05)。見表3。

表3 T6SS陽性組和T6SS陰性組分子分型分析[株(%)]

莢膜血清分型顯示,CRKP中以K64、K47型為主,二者序列分型均為ST11型,且在ST11型CRKP中占比分別為70.9%、25.5%,K64-ST11型CRKP占比高于K47-ST11型(P<0.05)。根據(jù)T6SS是否陽性分組,比較CRKP莢膜血清分型差異。T6SS陽性組中K64型70株(54.3%),K47型20株(15.5%),K19型6株(4.6%)。T6SS陰性組中K64型、K47型各8株(25.8%),K19型2株(6.5%)。T6SS陽性組K64型CRKP占比高于T6SS陰性組(P=0.004)。毒力因子檢測結(jié)果顯示,T6SS陽性組中iucA、mrkD、rmpA2、peg344、wabG、fimH檢出率均高于T6SS陰性組(均P<0.05)。見表4。

表4 T6SS陽性組和T6SS陰性組莢膜分型及毒力因子分析[株(%)]Table 4 Capsular serotype and virulence factors of T6SS-positive group and T6SS-negative group (No. of isolates [%])

2.4 生物膜形成能力分析 隨機(jī)選取T6SS陽性、陰性菌株各10株進(jìn)行生物膜形成定量檢測,結(jié)果顯示相應(yīng)生物膜形成量分別為0.082±0.015、0.044±0.008,陰性對照生物膜形成量為0.037±0.001。T6SS陽性組生物膜形成量高于T6SS陰性組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討論

近年來,CRKP的檢出率逐漸上升,并由于其多重耐藥性迅速傳播。CRKP獲取毒力質(zhì)粒后可轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨玖δ吞记嗝瓜╊惙窝卓死撞?carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae, CR-hvKP),嚴(yán)重影響KP相關(guān)感染患者的預(yù)后。T6SS能促進(jìn)毒力基因和耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移,因此,本研究探索T6SS陽性CRKP臨床感染特征,及其與毒力、耐藥基因和生物膜形成之間的關(guān)系。

T6SS和毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)CRKP中T6SS檢出率高達(dá)80.6%。T6SS陽性菌株iucA、mrkD、rmpA2、peg344、wabG、fimH檢出率均高于T6SS陰性菌株(均P<0.05),而這些基因與菌毛、莢膜、鐵載體和脂多糖等常見的毒力因子密切相關(guān)。iucA編碼鐵載體氣桿菌素,目前在大多數(shù)高毒力KP中存在;rmpA2是黏液表型調(diào)節(jié)因子,其表達(dá)會(huì)上調(diào)莢膜產(chǎn)生;fimH和mrkD分別參與編碼1型和3型菌毛;wabG編碼脂多糖產(chǎn)生的相關(guān)基因[16];peg344編碼未知功能的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在高毒力KP中廣泛流行,利用peg344陽性檢測高毒力KP具有高靈敏度、特異度[17]。毒力基因檢測結(jié)果提示T6SS陽性CRKP菌株攜帶更多的毒力基因,T6SS陽性CRKP可能擁有更強(qiáng)的毒力。

生物膜是細(xì)胞外基質(zhì)包裹的細(xì)菌菌群,包括KP在內(nèi)的多種微生物均具有生物膜形成能力。生物膜的形成可使KP免受免疫系統(tǒng)和抗菌藥物對其的殺傷作用,且有多種毒力基因參與生物膜的形成[18]。因此,本研究對比T6SS陽性、陰性CRKP生物膜形成量,發(fā)現(xiàn)T6SS陽性組生物膜形成能力強(qiáng)于T6SS陰性組,提示T6SS有可能參與生物膜的形成,導(dǎo)致細(xì)菌在人體內(nèi)定植,造成慢性感染。同時(shí),臨床資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,T6SS陽性組患者患慢性肺部疾病與心臟疾病的比例均高于T6SS陰性組(均P<0.05),且預(yù)后更差,這表明T6SS陽性菌株可能具有更強(qiáng)的毒力。綜合分析毒力基因、生物膜形成能力及患者預(yù)后等情況,T6SS陽性CRKP菌株可能在具備多重耐藥特點(diǎn)的同時(shí)具有更強(qiáng)的毒力,因此,臨床醫(yī)務(wù)人員應(yīng)加強(qiáng)對T6SS陽性CRKP的感染防控意識(shí)。

本研究對CRKP進(jìn)行了ST型和莢膜血清分型檢測,ST11型CRKP占比68.8%,且T6SS陽性CRKP中ST11型檢出率高于T6SS陰性CRKP。根據(jù)莢膜血清分型將ST11型分為K64-ST11型和K47-ST11型,K64-ST11型檢出率為70.9%,高于K47-ST11型(25.5%),且K64-ST11型在T6SS陽性組檢出率高于T6SS陰性組(P<0.05)。有研究[19]報(bào)道K64-ST11型菌株的毒力較K47-ST11型高,且K64-ST11型檢出率逐漸增高,高于K47-ST11型,進(jìn)一步證明了T6SS陽性菌株可能與高毒力有關(guān)。

隨著抗菌藥物的廣泛、甚至是不規(guī)范使用,耐碳青霉烯類腸桿菌(CRE)的檢出率逐漸上升。CRKP耐藥機(jī)制中最主要的是攜帶碳青霉烯酶類耐藥基因,其可以使β-內(nèi)酰胺類抗生素失活,導(dǎo)致對絕大多數(shù)此類抗生素耐藥[20]。常見的碳青霉烯酶分型包括A類絲氨酸酶(KPC型最常見),B類金屬酶(NDM型、VIM型、IMP型等),D類絲氨酸酶(OXA型常見)。本研究結(jié)果顯示,CRKP中最常見的碳青霉烯酶基因型為KPC,其次是NDM,而VIM、IMP、OXA-48較少見,其中以KPC-2最多,其次是NDM-1、NDM-5。T6SS陽性組和陰性組碳青霉烯類耐藥基因和抗菌藥物耐藥率比較無明顯差異,這與其他研究結(jié)果不同,可能因?yàn)楸狙芯縏6SS陽性組和陰性組均以ST11型CRKP為主,其缺乏R-M系統(tǒng)和CRISPR-Cas系統(tǒng),更容易獲得耐藥性。

綜上所述,本研究對于該地區(qū)T6SS在CRKP中的分布、相關(guān)感染特征、毒力基因、耐藥基因、生物膜形成能力進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)T6SS在CRKP中的檢出率較高,且攜帶T6SS的CRKP毒力基因檢出率更高,被認(rèn)為與高毒力相關(guān)的基因iucA、rmpA、rmpA2、peg344在CRKP中的檢出率也較高,CR-hvKP檢出率的增加可能使臨床治療更加困難。但目前回顧性研究樣本量不夠,存在一定局限性,后續(xù)可以檢測患者感染普通KP至CRKP過程中,T6SS的攜帶情況及表達(dá)量的變化,更客觀地反映菌株產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)其毒力如何變化,為臨床防治CRKP感染提供依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。