聶俊偉,周 璐,瞿志鵬,洪 捷,鮑倡俊,談忠鳴

(1. 南京諾唯贊生物科技股份有限公司生命科學事業(yè)部,江蘇 南京 210038; 2. 東南大學生命科學與技術學院,江蘇 南京 210096; 3. 國家衛(wèi)生健康委員會腸道病原微生物重點實驗室江蘇省疾病預防控制中心,江蘇 南京 210009)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一種常見的機會致病性革蘭陰性桿菌[1],廣泛分布在自然界的水、空氣和土壤中,對外界環(huán)境具有非常強的適應能力,可在人、動物和環(huán)境中循環(huán)傳播,不僅影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展,而且可定植在人類的皮膚表面、消化道和呼吸道等部位[2],是醫(yī)院常見的感染病原體,尤其是燒傷、免疫受損患者和嚴重創(chuàng)傷患者感染的重要致病菌。

碳青霉烯類抗生素(carbapenem)、多黏菌素類抗生素(polymyxin)及替加環(huán)素(tigecycline)是臨床最常用的治療嚴重耐藥細菌引起感染的三類抗生素[3],可顯著縮短病程,降低疾病負擔,減少死亡,是抗感染治療的“最后一道防線”。然而近年來隨著碳青霉烯類藥物在臨床的使用量增加,其耐藥性越來越嚴重[4],世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)已將臨床上發(fā)現(xiàn)的多重耐藥(multidrug-resistant)銅綠假單胞菌列為“極為關注”的“重點耐藥病原體”[5]。

細菌耐藥性受自身以及環(huán)境等外界因素影響,極為復雜,傳統(tǒng)藥物敏感性分析方法費時費力,成本高,需要有經驗的工作人員。細菌耐藥基因的表達決定著細菌耐藥表型,而近幾年飛速發(fā)展的全基因組測序技術不但能夠分析已知耐藥機制[6-8],還可以通過計算機技術預測未知的潛在耐藥機制,因此全基因組測序技術將會超越常規(guī)技術成為未來研究細菌耐藥性的首選方法之一,并為監(jiān)測和控制醫(yī)院內菌株感染和傳播提供重要的技術手段。為全面了解我省臨床分離銅綠假單胞菌的耐藥表型及基因分布特征,現(xiàn)對2016—2021年江蘇省臨床患者分離株進行藥物敏感性試驗和二代基因測序分析,評估菌株的耐藥特征、耐藥基因攜帶情況,闡明耐藥與耐藥基因和基因型的相關性,為銅綠假單胞菌感染的預防控制、調查溯源和診斷治療提供科學依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 菌株來源 依托國家致病菌識別網(wǎng)監(jiān)測平臺,在全省13個區(qū)市設立26家致病菌哨點醫(yī)院,2016—2021年收集分離自醫(yī)院臨床患者病原學標本(包括全血、痰、中段尿、膽汁、膿等)的銅綠假單胞菌菌株,剔除同一患者相同部位的重復菌株。銅綠假單胞菌的標準菌株ATCC 27853作為藥物敏感性試驗的質控菌株,購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 試劑與儀器 含5%脫纖維羊血瓊脂平板購自廣州市迪景微生物科技有限公司,細菌核酸提取試劑(FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,革蘭陰性細菌鑒定卡(VITEC-2 GN Test kit)及全自動細菌生化鑒定儀(VETIC-2 System)為法國生物梅里埃公司生產,德國布魯克公司生產的全自動細菌鑒定質譜儀(Microflex LT/SH smart MALDI TOF MS System),銅綠假單胞菌致病菌識別網(wǎng)定制藥敏板(NMIC/ID-4),全自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)(Phoenix M50)為美國BD公司生產,水套式恒溫培養(yǎng)箱(美國熱電公司),BSL-II級生物安全柜(德國Baker公司),高速離心機(德國Eppendorf公司),-80℃冰箱(美國熱電公司)。

1.3 銅綠假單胞菌鑒定 按照國家致病菌識別網(wǎng)技術手冊(2022版)用無菌接種環(huán),四區(qū)劃線法將菌株接種在含5%脫纖維羊血瓊脂培養(yǎng)基上,37℃孵育20～24 h。挑取可疑菌落純化放大后經系統(tǒng)生化鑒定和微生物質譜鑒定為銅綠假單胞菌。

1.5 全基因組測序 核酸提取:1.5 mL無菌EP管中加入200 μL無菌水,接種環(huán)挑取適量新鮮菌苔加入。使用試劑盒提取純化細菌全基因組DNA,按說明書操作步驟進行。分光光度儀檢測細菌dsDNA濃度,瓊脂糖凝膠電泳(1%濃度的瓊脂糖凝膠;150 V電壓電泳40 min)檢查核酸完整性,合格樣品送北京諾禾致源科技股份有限公司進行建庫(≤800 bp常規(guī)文庫)和細菌全基因組重測序,測序平臺為illumina novaseq x plus。

1.6 質控與組裝 利用CLC genomics workbench軟件(Qiagen)對測序數(shù)據(jù)進行質控,并用Microbial Genomics Module模塊對Clean data數(shù)據(jù)進行多個K-mer參數(shù)拼接,得到最優(yōu)的contigs組裝結果,隨后進行局部組裝和優(yōu)化,形成scaffolds。

1.7 耐藥基因預測 所有菌株組裝文件導入CLC軟件Microbial Genomics Module模塊在ResFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)和CARD (https://card.mcmaster.ca/)數(shù)據(jù)庫進行耐藥基因掃描比對。

1.8 多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)分析 MLST的7個等位基因通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對,確定每株菌的基因型(sequence type, ST),并將7個基因數(shù)字作為字符型數(shù)據(jù),運用BioNumerics 8.0(applied maths, belgium)軟件,非加權配伍組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)進行相關ST型的聚類分析。

2 結果

2.1 菌株情況 本實驗室通過致病菌識別網(wǎng)各哨點醫(yī)院在2016—2021年收集醫(yī)院患者分離的疑似銅綠假單胞菌菌株,純化后經生化和MALDI TOF MS鑒定,共101株銅綠假單胞菌。其中2019年南通收集的菌株最多,2021年較少。全省13個地級市,101株菌來源于其中12個地級市。見圖1。

表1 江蘇省臨床分離的101株銅綠假單胞菌對11種抗菌藥物的藥敏結果

2.3 耐藥譜分析 銅綠假單胞菌耐藥模式多樣,見表2,共有35種耐藥表型,其中1株菌對檢測的19種抗菌藥物均耐藥,耐藥譜為8種固有耐藥抗菌藥物的AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-TE-SXT菌株最多,占31.69%(32株)。耐藥情況最嚴重的耐藥物譜分別為19種抗菌藥物(AN-AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT)和18種抗菌藥物(AMC-AM-SAM-ATM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT、AN-AMC-AM-SAM-CZ-FEP-CTX-CAZ-C-CIP-GM-IPM-LVX-MEM-PIP-TZP-TE-SXT,各1株)。

表2 江蘇省101株臨床分離銅綠假單胞菌耐藥譜

2.4 耐藥基因攜帶情況 101株銅綠假單胞菌介導對β-內酰胺類等共9類18種抗菌藥物耐藥相關基因見表3和圖2,分別是β-內酰胺酶基因的blaOXA和blaPAO;氨基糖苷類耐藥基因aac、aad和aph;喹諾酮類相關耐藥基因qnr和crpP;常見的四環(huán)素類耐藥基因如tet;酰胺醇類相關耐藥基因如floR、cmlA和cat;介導磺胺類的耐藥基因如dfrA、qac和sul;針對利福霉素類抗生素的耐藥基因arr;抗生素滅活基因fosA和抗生素外排泵基因qacE。結果顯示所有菌株攜帶aph(3’)-IIb和fosA基因,同時發(fā)現(xiàn)大部分菌株攜帶有β-內酰胺酶相關基因blaOXA(99株,98.02%)和blaPAO(100株,99.01%),氨基糖苷類耐藥基因aac和aad的攜帶率分別為11.88%(12株)和4.95%(5株)。此外,有43株菌株(42.57%)發(fā)現(xiàn)喹諾酮類抗菌藥物耐藥相關的關鍵基因crpP,同時這些菌株對萘啶酸及喹諾酮類藥物均呈現(xiàn)耐藥表型特性,耐藥表型和crpP基因的攜帶情況完全匹配。

表3 銅綠假單胞菌9類18種耐藥基因分布

圖2 江蘇省101株銅綠假單胞臨床分離株MLST聚類樹圖

2.5 MLST分析 NCBI的在線平臺pub-MLST數(shù)據(jù)庫中鑒定每株菌的7個等位基因號和ST型。

結果顯示101株銅綠假單胞菌存在75個ST型,ST 244(5株)、ST 235(4株)、ST 319(3株)、ST 773(3株)和ST 1076(3株)等幾個ST型的菌株最多。聚類圖顯示所有的ST型中,ST 262處于聚類圖的中心點,11個亞型或分支從ST 262擴散,聚類圖顯示各血清型菌株的ST型相對集中。見圖3。

注:IPM+MEM為亞胺培南和美羅培南耐藥;IPM為亞胺培南耐藥;-為亞胺培南和美羅培南非耐藥。

3 討論

醫(yī)院獲得性感染(healthcare-associated infection, HAI)又稱為醫(yī)院感染,是指患者在醫(yī)院住院期間獲得的感染,包括住院期間發(fā)生的感染以及出院后才表現(xiàn)出來的感染。銅綠假單胞菌對環(huán)境具有高度的適應性,同時具備產毒性和侵入性,易引起人體多部位感染,如呼吸道、肺部、尿路感染、燒傷、免疫受損、心臟瓣膜及手術等部位的感染,甚至會通過血液引起全身感染,是導致醫(yī)院感染最重要的條件致病菌之一,已成為醫(yī)院重點防控的病原菌[9]。調查收集的菌株來源于江蘇省13個市中的12個市,具有一定的代表性。

碳青霉烯類抗生素(如亞胺培南、美羅培南、厄他培南等),是70年代研發(fā)的一種新型β-內酰胺類抗生素,通過干擾細胞壁的合成而抑制細菌復制,因具有廣譜、強效和低不良反應,廣泛應用于治療由嚴重耐藥革蘭陰性菌引起的感染。但隨著臨床上的廣泛應用,銅綠假單胞菌對亞胺培南等一線藥物的耐藥性出現(xiàn)上升趨勢[11]。2017年,WHO將耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌列為極其重要的、急需開發(fā)新型藥物和治療手段的細菌之一。本研究發(fā)現(xiàn)對亞胺培南和美羅培南兩種抗生素的耐藥率已分別達45.54%、39.60%,高于國內湖北和廣州醫(yī)院感染分離株的耐藥率。

臨床分離的銅綠假單胞菌多重耐藥嚴重,本研究中收集的分離株全部為多重耐藥菌,耐藥種類在固有耐藥(AMC-AM-SAM-CZ-CTX-C-TE-SXT)的基礎上遞增,甚至出現(xiàn)1株對所有抗菌藥物耐藥的超級耐藥菌株,耐10種抗菌藥物的菌株達63.37%。與國外藥物敏感性監(jiān)測結果[12](歐洲、美國、日本等醫(yī)院菌株)比較,本次分離的菌株耐藥率以及多重耐藥程度較高,提示需密切關注銅綠假單胞菌重點抗菌藥物耐藥性的變化。

銅綠假單胞菌能通過水平基因轉移獲得耐藥基因(antimicrobial resistance gene, ARG),從而產生耐藥性并形成超級耐藥細菌,一旦出現(xiàn)在醫(yī)院中,危害性極大,可導致原來沒有感染的患者因其他疾病住院后反而感染超級耐藥菌,嚴重的可導致患者死亡。本專題研究利用生物信息分析方法,通過測序技術得到菌株基因組信息,再在ResFinder數(shù)據(jù)庫里對已知的耐藥基因全面掃描分析,大大提高了效率,節(jié)約了成本。通過比對發(fā)現(xiàn)了6類共18種介導抗菌藥物耐藥相關的基因。銅綠假單胞菌可攜帶β-內酰胺酶基因(blaOXA和blaPAO)[13],OXA為D類碳青霉烯酶,有多個亞型,能水解多種青霉素類和頭孢菌素類抗生素,一般由質粒介導并擴散。本項研究的結果表明,大多數(shù)菌株攜帶一或兩種此類抗性基因,并且對青霉素類抗生素氨芐西林和碳青霉烯類具有抗性,如對美羅培南具有一定的耐藥性,耐藥基因和耐藥表型結果完全一致。此外43株菌株攜帶crpP基因,并與對喹諾酮類藥物的耐藥性呈現(xiàn)了100%的對應關系。

MLST技術可對細菌進行基因分型及遺傳進化分析,是當前分子流行病研究中常用的工具之一。本研究101株菌被分為75個不同的ST型,表明本地區(qū)ST型豐富,感染來源和途徑多樣化,應加強各環(huán)節(jié)的消毒和感染控制。文獻報道,全球多地的醫(yī)院發(fā)現(xiàn)從患者體內分離泛耐藥(extensively drug resistant, XDR)甚至是全耐藥(pandrug-resistant, PDR)的銅綠假單胞菌[14],這些嚴重耐藥甚至全耐藥的分離株主要集中在幾種特別的MLST型中,如ST 175、ST 235及ST 664等;攜帶這些基因型的菌株在臨床治療上無藥可用,一旦感染極度兇險,這些ST型聚在一起形成的克隆簇常被稱為高?？寺〈亍T 235分布廣泛,本研究中發(fā)現(xiàn)4株ST 235基因型菌株,其中1株耐藥嚴重,同時耐18種抗菌藥物,因此需提高對該型菌株的警惕,如有暴發(fā),周邊醫(yī)院或社區(qū)應提高重視,防范進一步的蔓延。

隨著經濟的發(fā)展,我國全面進入老齡化社會,本研究針對2016—2021年患者臨床分離株進行藥物敏感性試驗和二代測序分析,結果顯示江蘇省臨床分離的銅綠假單胞菌耐藥情況嚴重,并有擴散的趨勢,應引起高度重視。一方面要發(fā)展新的治療手段,如新型抗菌藥物或噬菌體治療等;另一方面如空氣、水龍頭、門把手等醫(yī)院內經常接觸到的重點部位的消毒滅菌需加強,防止泛耐藥銅綠假單胞菌醫(yī)院內擴散感染。由于新型冠狀病毒感染疫情等各種因素影響,不同年份各地區(qū)收集的菌株數(shù)差異較大,對結果分析及特征描述產生一定的影響,下一步將優(yōu)化工作流程,增加相關培訓。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。