胡曉菡,周強,孫武,陳靜,沈瀚,李強

宮頸癌是女性生殖道常見惡性腫瘤,每年新發(fā)60.4萬例[1]。宮頸癌治療以手術(shù)、放化療為主,但仍有部分患者出現(xiàn)腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)是蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶成員,調(diào)控DNA修復(fù)、mRNA剪接和信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程[3]。研究表明,PRMT5在胃癌、乳腺癌等許多惡性腫瘤中過表達[4-5],能夠轉(zhuǎn)錄激活A(yù)KT等癌基因的表達,促進癌細胞增殖、侵襲和遷移。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B,CDKN2B)屬于CDKN2B/p20家族,能夠結(jié)合并抑制細胞周期素依賴激酶4/6的活性,負調(diào)控細胞周期素D1,抑制細胞增殖,在胃癌、甲狀腺癌等多種人類惡性腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制的作用[6-7]。宮頸癌中PRMT5、CDKN2B的表達及臨床意義尚不明確。本研究分析宮頸癌中PRMT5、CDKN2B表達與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,探討兩者的臨床意義,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年3月—2020年3月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科診治宮頸癌患者88例,年齡29～79(58.67±8.36)歲,病程3～21(8.12±2.37)d;基礎(chǔ)病:高血壓20例,糖尿病7例,高血脂12例;病理類型:宮頸鱗癌55例,宮頸腺癌33例;參照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn)(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO分期)進行宮頸癌臨床分期[8],ⅠA～ⅠB1期61例,ⅠB2～ⅡA期27例;腫瘤大小:<4 cm者62例,≥4 cm者26例;腫瘤浸潤深度:<1/2全層者60例,≥1/2全層者28例;腫瘤分化程度:低分化30例,高中分化58例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者64例。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(M20220119),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①均接受根治性手術(shù)治療,術(shù)后病理證實為宮頸癌;②病例資料完整;③原發(fā)性腫瘤且為首次診治。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前有新輔助放化療;②未能達到根治性手術(shù)標(biāo)準(zhǔn);③伴其他惡性腫瘤;④不能配合隨訪。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 PRMT5、CDKN2B檢測:取宮頸癌及癌旁組織(距腫瘤邊緣>2 cm),10%中性甲醛固定12 h,常規(guī)石蠟包埋切片,60℃烤片1 h,二甲苯透明化,梯度酒精脫水,檸檬酸鹽抗原熱修復(fù),100 ℃ 10 min,3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,3%羊血清封閉,PRMT5、CDKN2B抗體4℃孵育過夜(兔單克隆PRMT5、CDKN2B抗體購自美國Abcam公司,貨號ab151321,ab81278,稀釋比均為1∶200),二抗室溫孵育1 h,DAB顯色4 min,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,中性樹脂封片,顯微鏡下(DX31,日本奧林巴斯公司)觀察。染色面積評分:陽性面積≤5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,≥76%為4分。染色強度評分:無陽性染色(0分),淡黃色(1分),棕黃色(2分)。免疫組化評分為染色面積評分乘以染色強度評分,0～2分為陰性,>2分為陽性。

1.3.2 隨訪:所有患者自治療結(jié)束后以電話及門診復(fù)查方式進行隨訪。隨訪時間:治療結(jié)束后2年內(nèi)3～6個月隨訪1次,第3年每6～12個月隨訪1次。復(fù)查內(nèi)容根據(jù)患者實際情況選擇腹盆腔CT或MR等影像學(xué)檢查和血常規(guī)、肝腎功能等實驗室檢查。記錄患者隨訪期內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況,患者生存情況等。隨訪截止時間為2023年4月1日。無進展生存時間定義為自宮頸癌確診到術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者腫瘤相關(guān)死亡的時間。隨訪終點為患者出現(xiàn)腫瘤進展或隨訪時間結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示,組間比較采用卡方檢驗。Spearman秩相關(guān)分析宮頸癌組織中PRMT5與CDKN2B表達的相關(guān)性。繪制Kaplan-Meier生存曲線,生存曲線比較采用Log-Rank法。多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響宮頸癌無進展生存預(yù)后的因素。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PRMT5、CDKN2B在宮頸癌及癌旁組織表達的比較 PRMT5棕黃色陽性染色位于細胞漿和細胞膜,CDKN2B棕黃色陽性染色位于細胞核,見圖1。癌組織中PRMT5陽性率70.45%(62/88),高于癌旁組織6.82%(6/88)(χ2=75.155,P<0.001)。癌組織中CDKN2B陽性率22.73%(20/88),低于癌旁組織79.55%(71/88)(χ2=75.336,P<0.001)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),宮頸癌中PRMT5與CDKN2B表達呈顯著負相關(guān)(r=-0.734,P<0.001)。

圖1 宮頸癌及癌旁組織中PRMT5及CDKN2B蛋白表達(免疫組化染色,×200)Fig.1 Expression of PRMT5 and CDKN2B in cervical cancer and paracancer tissues (immunohistochemical staining, ×200)

2.2 PRMT5、CDKN2B表達在不同臨床病理特征中差異比較 FIGO分期ⅠB2～ⅡA期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者癌組織中PRMT5陽性率分別高于FIGO分期ⅠB2～ⅡA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P均<0.05)。FIGO分期ⅠB2～ⅡA期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者癌組織中CDKN2B陽性率分別低于FIGO分期ⅠB2～ⅡA期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P均<0.05),見表1。

表1 不同臨床病理特征患者PRMT5、CDKN2B表達比較 [例(%)]

2.3 宮頸癌中PRMT5、CDKN2B表達與預(yù)后的關(guān)系 88例宮頸癌患者隨訪中,出現(xiàn)腫瘤進展18例,3年無進展生存率為79.55%(70/88)。PRMT5陽性和陰性組3年無進展生存率分別為74.19%(46/62)和92.31%(24/26),PRMT5陽性組3年累積無進展生存率低于PRMT5陰性組(Log-Rankχ2=4.386,P=0.017)。CDKN2B陽性及陰性組3年無進展生存率分別為95.00%(19/20)和75.00%(51/68),CDKN2B陰性組3年累積無進展生存率低于CDKN2B陽性組(Log-Rankχ2=4.423,P=0.012),見圖2。

2.4 多因素Cox回歸分析宮頸癌無進展生存預(yù)后影響因素 以是否發(fā)生腫瘤進展為因變量(0=無,1=有),以上述結(jié)果中P<0.05項目為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:FIGO分期ⅠB2～ⅡA期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PRMT5陽性、CDKN2B陰性是影響宮頸癌患者無進展生存預(yù)后的獨立危險因素,見表2。

表2 多因素Cox回歸分析宮頸癌預(yù)后影響因素

3 討 論

宮頸癌是我國女性常見的惡性生殖系統(tǒng)腫瘤,每年新發(fā)病例達10.9萬例,約占全球新發(fā)病例數(shù)的1/6[9]。近年來隨著宮頸癌早期篩查的普及,宮頸癌的發(fā)病人數(shù)逐漸增多。宮頸癌的治療包括根治性子宮切除術(shù)加盆腔淋巴結(jié)清掃,但術(shù)后仍有20%～30%的患者3年內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,且出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后治療手段有限,患者預(yù)后較差[10]。研究宮頸癌的疾病機制,尋找能夠評估患者臨床預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物,對于術(shù)后高危進展患者的術(shù)后輔助治療方式的選擇具有重要意義。

PRMT5屬于蛋白質(zhì)精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶家族的9個成員之一,通過甲基化蛋白精氨酸殘基,調(diào)控如RNA剪接、細胞周期、細胞死亡和代謝信號等通路。研究表明,子宮內(nèi)膜癌中PRMT5能與雌激素受體α及類固醇受體共激活因子-1相互作用,促進細胞周期蛋白D1、c-Myc的蛋白表達,增強癌細胞的增殖和遷移能力,并抑制其凋亡[11]。本研究中,宮頸癌組織PRMT5表達升高,與既往學(xué)者在宮頸癌組織芯片中報道的結(jié)果一致[12],但該研究選取的患者以高分期和高分級的患者為主,研究群體的代表性存在一定的局限。宮頸癌中PRMT5的表達上調(diào)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控失常有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌中轉(zhuǎn)錄因子Snail能夠結(jié)合PRMT5基因上調(diào)PRMT5的表達,進而形成MTA1轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物,催化組蛋白二甲基化和脫乙?；?抑制E-鈣黏蛋白的表達,促進腫瘤上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。另外,PRMT5表達與不良臨床病理特征有關(guān),提示PRMT5促進宮頸癌的腫瘤進展。研究表明,PRMT5通過組蛋白H3R2的對稱二甲基化,增強信號轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄活化因子1的轉(zhuǎn)錄,促進宮頸癌細胞中程序性死亡因子配體1的表達,抑制T細胞中干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α和顆粒酶B的分泌,促進腫瘤免疫逃逸及腫瘤惡性進展[13]。亦有研究報道,PRMT5還能抑制E3泛素連接酶含F(xiàn)-box/WD重復(fù)序列的蛋白7的表達,增加c-Myc蛋白的穩(wěn)定性,促進胰腺癌的無氧糖酵解,導(dǎo)致腫瘤的過度增殖[14]。本研究中,PRMT5陽性宮頸癌患者無進展生存預(yù)后較差,表明PRMT5是新的評估宮頸癌患者無進展生存預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。筆者分析,PRMT5陽性的宮頸癌患者腫瘤往往合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高的FIGO分期等高危復(fù)發(fā)進展的因素,導(dǎo)致術(shù)后治療進展風(fēng)險增加。另外,PRMT5還能促進腫瘤耐藥性形成,降低術(shù)后輔助治療療效,導(dǎo)致患者不良預(yù)后。Mueller等[15]研究表明,PRMT5的表達能夠促進微管調(diào)節(jié)蛋白2的表達,導(dǎo)致肺癌腫瘤細胞對紫杉醇等化療藥物的獲得性耐藥性的形成[13]。

CDKN2B又稱為INK4B,該基因編碼蛋白作為細胞周期依賴激酶抑制劑,能與細胞周期蛋白依賴激酶4或6結(jié)合形成復(fù)合物,抑制細胞周期依賴激酶的激活,在控制細胞周期G1期進展中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺癌中CDKN2B表達缺失,導(dǎo)致細胞周期依賴性蛋白絲/蘇氨酸激酶的激活,促進腫瘤細胞的過度增殖[16]。本研究中,宮頸癌組織CDKN2B表達下調(diào),這與既往學(xué)者利用甲基化特異PCR在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)CKDN2B基因的高甲基化沉默的研究結(jié)果一致[17],但該研究樣本量較小,僅納入20例宮頸癌患者,結(jié)果可能存在偏倚。宮頸癌中CDKN2B的表達與表觀遺傳學(xué)修飾有關(guān)。研究表明,CDKN2B基因的異常甲基化導(dǎo)致CDKN2B表達缺失,增加宮頸癌、卵巢癌等惡性腫瘤發(fā)生的易感性[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌中CDKN2B表達與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),表明CKDN2B促進宮頸癌的惡性進展。Xu等[19]報道,胃癌中E2F轉(zhuǎn)錄因子1的表達能夠通過誘導(dǎo)組織分化誘導(dǎo)非蛋白質(zhì)編碼RNA的轉(zhuǎn)錄,促進其與STAU1蛋白的結(jié)合,降低CDKN2B mRNA的穩(wěn)定性,抑制CDKN2B的蛋白表達,導(dǎo)致腫瘤細胞過度增殖。本研究中,CDKN2B陰性的宮頸癌患者無進展生存預(yù)后較差,提示CDKN2B是新的評估患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。筆者分析,CDKN2B陰性的宮頸癌腫瘤增殖能力強,FIGO分期較高,腫瘤容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險較高。另外,CDKN2B陰性的宮頸癌對化療及靶向治療存在耐藥性,降低術(shù)后輔助治療的有效性,導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究表明,人白血病細胞KG1a中miR-4755-5p通過靶向抑制CDKN2B基因的表達,增強癌細胞對地西他濱等化療藥物治療的耐藥性[20]。另外,有研究報道,在吉非替尼獲得性耐藥的肺癌患者中CDKN2B表達存在明顯的缺失型突變,檢測CDKN2B基因表達情況有助于評估靶向藥物治療敏感性[21]。因此,宮頸癌中CDKN2B的表達下調(diào)促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,是新的評估宮頸癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。本研究中,宮頸癌組織PRMT5與CDKN2B表達呈負相關(guān),提示兩者在宮頸癌中存在相互作用的關(guān)系。分析其原因,PRMT5的表達上調(diào)能夠與果蠅Zeste基因增強子2相互作用,促進組蛋白H4R3me2和H3R8me2表達,增加CDKN2B基因的啟動子區(qū)CpG的甲基化水平,沉默CDKN2B的表達,誘導(dǎo)腫瘤細胞過度增殖[22-24]。

綜上所述,宮頸癌中PRMT5表達升高,CDKN2B表達降低,均與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。FIGO分期ⅠB2～ⅡA期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PRMT5陽性、CDKN2B陰性是影響宮頸癌患者無進展生存預(yù)后的獨立危險因素。臨床醫(yī)師可根據(jù)癌組織中PRMT5、CDKN2B表達,同時結(jié)合傳統(tǒng)的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征,對宮頸癌患者的預(yù)后進行評估,對于高危復(fù)發(fā)進展的患者積極診治和隨訪,以改善臨床預(yù)后。本研究也存在局限性,樣本量較小,隨訪時間較短,有待今后設(shè)計多中心大樣本前瞻性的臨床試驗進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

胡曉菡:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;周強:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;孫武:實施研究過程,資料搜集整理;陳靜:實施研究過程,資料搜集整理;沈瀚:進行統(tǒng)計學(xué)分析;李強:論文修改