馬竹芳,龐林元,陳保銀,徐菁

胰腺癌是極具侵襲性的惡性腫瘤,全球每年新發(fā)44.1萬(wàn)例[1]。胰腺癌早期階段臨床表現(xiàn)不典型,診斷和治療往往延誤,預(yù)后較差[2]。E3泛素連接酶Cullin 4B (CUL4B)作為支架蛋白構(gòu)成Cullin-Ring復(fù)合物,參與細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)及DNA損傷修復(fù)等過(guò)程[3]。研究表明,膀胱癌、乳腺癌中CUL4B表達(dá)上調(diào),能激活磷脂酰肌醇3激酶,促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和干細(xì)胞特性形成[4-5]。人瞬時(shí)受體電位M2(transient receptor potential cation channel subfamily M member 2,TRPM2)是一種瞬時(shí)受體電位通道,參與調(diào)控鈣離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、多聚ADP核糖的降解過(guò)程,與炎性反應(yīng)、自身免疫疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病關(guān)系密切[6]。研究表明,TRPM2在乳腺癌、前列腺癌中表達(dá)上調(diào),磷酸化富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶,促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[7]。目前胰腺癌中CUL4B、TRPM2表達(dá)及臨床意義尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)胰腺癌中CUL4B、TRPM2的表達(dá),分析兩者與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年3月—2020年3月西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院接受手術(shù)治療胰腺癌患者86例的癌組織和癌旁組織。其中男46例,女40例;年齡37～68(55.29±6.26)歲;腫瘤最大徑:<4 cm 52例,≥4 cm 34例;腫瘤TNM分期:Ⅰ～ⅡA 期45例,ⅡB～Ⅲ 期41例;腫瘤分化程度:高中分化50例,低分化36例;腫瘤位置:胰頭部56例,胰體尾部30例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫審〔2019〕022號(hào)),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)組織病理檢查明確為胰腺導(dǎo)管腺癌,符合《胰腺癌綜合診治指南(2018版)》胰腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];②入院前無(wú)放化療治療;③臨床資料齊全。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并嚴(yán)重心肺功能障礙;②合并胰腺外原發(fā)惡性腫瘤或術(shù)后證實(shí)腫瘤非胰腺來(lái)源,如十二指腸、膽管下段及壺腹下段;③圍手術(shù)期死亡或術(shù)后30 d內(nèi)死亡;④不能配合隨訪者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 組織CUL4B、TRPM2蛋白檢測(cè):將術(shù)中獲取的胰腺癌組織和癌旁組織浸泡于10%組織固定液中12 h,石蠟包埋切片。免疫組化染色的具體實(shí)驗(yàn)步驟按照免疫組化試劑盒(購(gòu)自北京中杉金橋生物科技公司,貨號(hào)PV6000)說(shuō)明進(jìn)行操作。簡(jiǎn)要步驟:烘箱中60℃ 1 h,二甲苯脫蠟后一次放入100%至75%的梯度乙醇中水化,3%過(guò)氧化氫浸泡10 min,枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液中煮沸,冷卻后10%羊血清37℃封閉30 min,滴加一抗4℃ 16 h,兔抗人CUL4B、TRPM2單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司,貨號(hào)ab247477,ab11168。二抗37℃ 30 min,DAB顯色5 min,蘇木素染色2 min,分化液分化后清水清洗,返藍(lán)液中靜置5 min,依次脫水、透明和封片。利用日本Olympus公司的DX31顯微鏡觀察染色情況,染色深度評(píng)分(無(wú)染色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分)與面積評(píng)分(<25% 1分,25%～<50% 2分,50%～<75% 3分,≥75% 4分)的乘積≥2分為陽(yáng)性,<2分為陰性。

1.3.2 組織CUL4B、TRPM2 mRNA基因表達(dá)檢測(cè):取胰腺癌和癌旁組織約50 mg,剪碎后加入Trizol后研磨,離心留取上清采用RNA提取試劑盒(RNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司,貨號(hào)R1200)提取組織總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)(SYBR Green試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司,貨號(hào)SY1020)。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。CUL4B上游:5’-TTCGTGGATTCCTGAAAACATCA-3’,下游:5’-CCAGCATCAGACAGTTTGGAAC-3’;TRPM2上游:5’-GAGATGCCAACCGATGCCTTT-3’,下游:5’-GGAGACTCGGACGTACTTTTTCA-3’;內(nèi)參GAPDH上游:5’-TCCCCGCCGAGTACATACTG-3’,下游:5’-GTCTGCTCCGATATGAACTTCTC-3’。反應(yīng)條件:94℃ 5 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s,共35個(gè)循環(huán)。體系:SYBR Green 5 μl,正反向引物各0.5 μl,cDNA 1 μl和雙蒸水3 μl。結(jié)果采用2-△△Ct法表示CUL4B、TRPM2 mRNA基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 隨訪及預(yù)后:胰腺癌患者自出院后開(kāi)始隨訪,隨訪間隔為3～6個(gè)月1次,隨訪時(shí)限為3年,隨訪以門(mén)診方式進(jìn)行;隨訪內(nèi)容為常規(guī)體格檢查、腹盆腔CT或MR等,了解隨訪中腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展及患者生存情況。隨訪終止時(shí)間為2023年4月。隨訪終點(diǎn)為患者發(fā)生腫瘤相關(guān)死亡或到達(dá)隨訪終止時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1 組織中CUL4B、TRPM2蛋白表達(dá)比較 癌組織中CUL4B、TRPM2蛋白陽(yáng)性染色均位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,其陽(yáng)性率分別為72.09%(62/86)、69.77%(60/86),高于癌旁組織的9.30%(8/86)、11.63%(10/86),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=70.245、60.224,P均<0.001),見(jiàn)圖1。

圖1 胰腺癌及癌旁組織中CUL4B、TRPM2蛋白表達(dá)比較(免疫組化染色,×200)Fig.1 Comparison of CUL4B and TRPM2 protein expression in pancreatic cancer and paracancer tissues (immunohistochemical staining, ×200)

2.2 胰腺癌組織CUL4B與TRPM2蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,胰腺癌組織中CUL4B與TRPM2蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.720,P<0.001)。

2.3 組織CUL4B、TRPM2 mRNA基因表達(dá)比較 癌組織CUL4B、TRPM2 mRNA基因表達(dá)為(4.82±0.66)、(3.65±0.69),高于癌旁組織(3.51±0.40)、(2.56±0.61),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.741、10.976,P均<0.001)。

2.4 不同臨床病理特征胰腺癌組織CUL4B、TRPM2蛋白表達(dá)比較 TNM分期ⅡB～Ⅲ期、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺癌中CUL4B、TRPM2蛋白陽(yáng)性率高于Ⅰ～ⅡA期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理特征胰腺癌組織中CUL4B、TRPM2蛋白表達(dá)比較 [例(%)]

2.5 CUL4B、TRPM2表達(dá)與胰腺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系 胰腺癌患者隨訪結(jié)束時(shí),共死亡70例(81.40%),無(wú)失訪病例;3年總生存率18.60%(16/86)。CUL4B陽(yáng)性組和陰性組3年總生存率分別為9.68%(6/62)、41.67%(10/24),TRPM2陽(yáng)性組和陰性組3年總生存率分別為8.33%(5/60)、42.31%(11/26)。

CUL4B陽(yáng)性組、TRPM2陽(yáng)性組患者3年累積生存率低于CUL4B陰性組、TRPM2陰性組患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rankχ2/P=9.933/0.002、11.102/0.001),見(jiàn)圖2。

圖2 CUL4B、TRPM2表達(dá)對(duì)胰腺癌患者生存預(yù)后的影響

2.6 影響胰腺癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 以胰腺癌患者生存預(yù)后為因變量(1=死亡,0=存活),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示:TNM分期ⅡB～Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CUL4B陽(yáng)性、TRPM2陽(yáng)性是影響胰腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.01),見(jiàn)表2。

表2 影響胰腺癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

胰腺癌是嚴(yán)重的消化道惡性腫瘤,起病隱匿,預(yù)后極差。我國(guó)居民胰腺癌標(biāo)化發(fā)病率為5.78/10萬(wàn),病死率為5.99/10萬(wàn)[9]。雖然手術(shù)、化療等綜合治療是胰腺癌的主要臨床治療方案,但胰腺癌預(yù)后整體較差,5年總體生存率僅9%[9]。目前主要根據(jù)腫瘤TNM分期、病理分級(jí)等臨床病理特征評(píng)估胰腺癌患者的預(yù)后,但不同患者存在較大的腫瘤異質(zhì)性,相同分期及相同治療方案的胰腺癌患者疾病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)存在較大差異。因此,有必要對(duì)影響胰腺癌預(yù)后的因素進(jìn)行深入研究,并尋找有效評(píng)估患者臨床預(yù)后的標(biāo)志物。

CUL4B是Cullin 4B-Ring E3泛素連接酶復(fù)合物的支架蛋白,通過(guò)多泛素化或單泛素化作用催化底物蛋白,參與肥胖、胰島素抵抗及病毒感染等病理生理學(xué)過(guò)程[10]。研究發(fā)現(xiàn),CUL4B在肺癌、膠質(zhì)瘤等多種類(lèi)型癌癥中過(guò)表達(dá),其通過(guò)表觀遺傳學(xué)修飾在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲行為[11-12]。本研究中,胰腺癌組織中CUL4B mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高,這與既往在胰腺癌細(xì)胞及組織中研究結(jié)果一致[13],但該研究?jī)H對(duì)人類(lèi)癌癥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中CUL4B在mRNA基因表達(dá)的水平進(jìn)行驗(yàn)證,而不同mRNA的轉(zhuǎn)錄本的基因表達(dá)存在一定差異,本研究在蛋白水平對(duì)CUL4B進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果更為準(zhǔn)確。胰腺癌中CUL4B表達(dá)受微小RNA-300表達(dá)的調(diào)節(jié)。研究表明,胰腺癌中微小RNA-300表達(dá)下調(diào),導(dǎo)致CUL4B mRNA穩(wěn)定性增加,CUL4B激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路,β-連環(huán)蛋白入核后上調(diào)波形蛋白及N鈣黏素的表達(dá),腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)[14]。本研究中,CUL4B表達(dá)與患者不良臨床病理特征有關(guān),提示CUL4B促進(jìn)胰腺癌的惡性進(jìn)展。研究表明,CUL4B與組蛋白去乙?；?結(jié)合形成CRL4B復(fù)合物,該復(fù)合物促進(jìn)組蛋白H2AK119位點(diǎn)的單泛素化,上調(diào)果蠅頭狀因子3和叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型3的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、自噬、侵襲及干細(xì)胞樣特性形成[13]。另外,CUL4B能夠與DNA損傷結(jié)合蛋白1及組成型光形態(tài)發(fā)生蛋白1結(jié)合形成復(fù)合物,介導(dǎo)H3K27me2/3組蛋白去甲基化酶UTX的泛素化降解,促進(jìn)了結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展[15]。本研究中,CUL4B陽(yáng)性胰腺癌患者預(yù)后較差,表明CUL4B有助于評(píng)估胰腺癌患者預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn),胰腺內(nèi)分泌瘤中CUL4B與CUL4相關(guān)因子7結(jié)合,催化腫瘤抑制基因MEN1的泛素化降解,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖及對(duì)依維莫司治療耐藥性的形成,導(dǎo)致患者不良預(yù)后[16]。

TRPM2屬于瞬時(shí)受體電位超家族成員,是可通過(guò)鈣離子的非選擇性陽(yáng)離子通道,能夠感受活性氧簇,參與機(jī)體氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及細(xì)胞死亡等多種病理生理過(guò)程[17]。研究表明,TRPM2可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中免疫抑制細(xì)胞浸潤(rùn),并通過(guò)促進(jìn)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的腫瘤進(jìn)展,是潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[18]。本研究中,胰腺癌組織中TRPM2 mRNA和蛋白表達(dá)升高,提示TRPM2參與促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生。這與既往Lin等[19]學(xué)者研究結(jié)果相似,但該研究?jī)H納入64例胰腺癌患者,以中晚期患者為主(Ⅰ期患者僅6例),在反映不同分期胰腺癌患者TRPM2表達(dá)中代表性較差。胰腺癌中TRPM2表達(dá)升高的機(jī)制與缺氧微環(huán)境調(diào)控有關(guān)。研究表明,胰腺癌腫瘤微環(huán)境處于缺氧狀態(tài),缺氧通過(guò)促進(jìn)鈣離子內(nèi)流誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中線粒體游離活性氧的產(chǎn)生,上調(diào)并激活TRPM2的表達(dá),促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[20-21]。本研究中,TRPM2與胰腺癌不良臨床病理特征有關(guān),提示TRPM2促進(jìn)胰腺癌的腫瘤進(jìn)展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),胰腺癌患者中TRPM2的過(guò)表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,直接激活蛋白激酶Cα,活化下游絲裂原活化蛋白激酶/絲裂原細(xì)胞外激酶通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,導(dǎo)致腫瘤分期升高[21]。本研究中,TRPM2陽(yáng)性胰腺癌患者預(yù)后較差,表明TRPM2可能是新的評(píng)估胰腺癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。分析其原因,TRPM2的表達(dá)通過(guò)增加缺氧誘導(dǎo)因子1A和核因子E2相關(guān)因子2蛋白的穩(wěn)定性,上調(diào)多藥耐藥基因等的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤對(duì)化療藥的敏感性降低及患者不良生存預(yù)后[22]。另有研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用TRPM2的特異性抑制劑如鄰氨基苯甲酸等能夠抑制腫瘤內(nèi)鈣離子依賴(lài)的線粒體來(lái)源的活性氧產(chǎn)生,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥治療的敏感性,是潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[23]。

本研究中,胰腺癌組織中CUL4B與TRPM2表達(dá)呈正相關(guān),提示兩者在胰腺癌中可能存在相互作用關(guān)系。筆者分析,可能與兩者受缺氧調(diào)控有關(guān)。研究表明,缺氧條件下腫瘤細(xì)胞中TRPM2表達(dá)上調(diào)能夠增加缺氧誘導(dǎo)因子1A蛋白穩(wěn)定性,而缺氧誘導(dǎo)因子1A能夠在轉(zhuǎn)錄水平直接激活CUL4B的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為的發(fā)生[24]。但胰腺癌中兩者具體作用仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述, 胰腺癌組織中CUL4B、TRPM2在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均顯著升高,與患者不良臨床病理特征有關(guān),均參與促進(jìn)胰腺癌的腫瘤進(jìn)展。CUL4B、TRPM2是影響胰腺癌不良生存預(yù)后的獨(dú)立因素,可能協(xié)助臨床醫(yī)生評(píng)估胰腺癌患者的臨床預(yù)后,進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療。但本研究在數(shù)據(jù)收集和樣本量等方面尚存在局限,即隨訪時(shí)間相對(duì)較短、樣本量較小,有待今后擴(kuò)大樣本量,延長(zhǎng)隨訪時(shí)間,進(jìn)一步研究CUL4B、TRPM2的臨床應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

馬竹芳:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě);龐林元:提出研究方向,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;陳保銀:實(shí)施研究過(guò)程,數(shù)據(jù)收集,分析整理,論文修改;徐菁:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析