祁 峰,孫玉琳,劉佳琦,郭正光,劉曉燕,孫海丹,何成彥,趙曉航,孫 偉*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理系,北京100005;2.國家癌癥中心·國家癌癥臨床研究中心·中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院癌癥醫(yī)院 分子腫瘤國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100021;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林 長春130033)

結(jié)直腸癌(CRC)是世界上癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1],CRC的臨床分期是與生存直接相關(guān)的預(yù)后因素,早期(Ⅰ/Ⅱ期)CRC患者的5年生存率約為90%,轉(zhuǎn)移性(Ⅳ期)CRC患者的5年生存率僅為20%[2-3]。早期診斷對于結(jié)直腸癌的治療有著重要的意義。結(jié)直腸鏡檢查是結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但檢查過程痛苦,患者依從性低;糞便潛血檢測存在假陽性率較高的問題;癌胚抗原檢測的個(gè)體差異性較大且靈敏度較低;糞便DNA甲基化檢測的成本較高;所以需要一種成本低廉且高靈敏度高特異性的診斷方法[4-5]。

代謝組學(xué)能夠快速準(zhǔn)確地表征生物體及其代謝途徑的變化,且具有高通量的優(yōu)勢[6]。因?yàn)槟蛞簶颖揪哂幸撰@得,收集非侵入性,代謝物含量豐富的特點(diǎn),早在2009年,尿液代謝組研究發(fā)現(xiàn)CRC患者與健康人有明顯差異[7]。后續(xù)多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)谷氨酸,組氨酸,色氨酸等常見氨基酸在CRC患者中表達(dá)異常[8-10]。本研究分析了20種常見氨基酸在CRC患者不同階段的變化,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

113例入組病例來自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院2017年1月至2019年10月期間的CRC患者,Ⅰ期27例,Ⅱ期28例,Ⅲ期34例,Ⅳ期24例。所有患者均由兩位資深病理醫(yī)生進(jìn)行病理診斷。手術(shù)前或化療/放療前隨機(jī)采集晨起中段尿液樣品。健康對照組100例,其入選標(biāo)準(zhǔn)為:(1)無良惡性腫瘤;(2)體檢合格,無重要器官功能障礙;(3)腎功能正常,無蛋白尿。健康對照組為年齡和性別匹配的志愿者,無癌癥病史或胃腸道癥狀。所有受試者均簽署了知情同意書,該研究通過了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所機(jī)構(gòu)評審委員會的倫理審查和批準(zhǔn)。

1.2 材料

色譜級甲酸、乙腈(Thermo Fisher);乙酸銨(Sigma-Aldrich公司);20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海甄準(zhǔn)生物有限公司);10 kDa超速離心濾器(美國PALL);300 μl上樣瓶(Waters公司)。

1.3 方法

1.3.1代謝物提取 尿樣制備基于以前文獻(xiàn)報(bào)道的方法[11]。在200 μL尿樣中加入200 μL乙腈,渦旋混勻,在-40℃下冷凍30 min。將混合物以14 000×g的速度離心10 min。上清液在真空下冷凍抽干。在進(jìn)行LC-MS分析之前,用400 μL 50%的乙腈復(fù)溶,用10 kDa截留分子量的超速離心濾器(美國PALL)進(jìn)一步過濾尿代謝物,取30 μL樣本加入30 μL 50%的乙腈和140 μL純乙腈混勻用于質(zhì)譜檢測。

1.3.2高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析 使用Waters ACQUITY H-Class LC系統(tǒng)(Waters,美國)與 SCIEX Triple Quad 6500質(zhì)譜儀(SCIEX,美國)相結(jié)合進(jìn)行靶向UPLC-MS分析。采用BEH HILIC色譜柱(2.1×100 mm,1.7 μm),流速0.3 mL/min,梯度洗脫。流動相A為0.1%甲酸水溶液,10 mM乙酸銨,85%乙腈溶液。流動相B為0.1%甲酸水溶液,10 mM乙酸銨,100%水。梯度為0～0.5 min,0溶劑B;0.5～3.5 min,0～4%溶劑B;3.5～5 min,4%～20%溶劑B;5～6 min,20%～38%溶劑B;6～8.5 min,38%～45%溶劑B;8.5～11 min,45%～100%溶劑B。柱溫40℃;毛細(xì)管電壓為4 500 V,碰撞氣為高純N2,壓力 0.72 MPa。霧化氣和干燥氣均為氮?dú)?霧化氣壓力為20 psi,霧化溫度為450℃,干燥氣流速為 14 L/min。

1.3.3方法學(xué)評估 吸取 20種氨基酸儲備溶液配置混合溶液,其中精氨酸,組氨酸,異亮氨酸,亮氨酸,賴氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,纈氨酸的濃度為50 μM,谷氨酰胺,谷氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,酪氨酸的濃度為100 μM,丙氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,甘氨酸,絲氨酸,蘇氨酸的濃度為1 000 μM。1倍梯度4倍稀釋9次到16 000倍,64倍標(biāo)準(zhǔn)品混合樣本作為質(zhì)控。

CRC患者以及各階段結(jié)直腸癌與健康對照兩兩間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用prism(版本9.0)繪制散點(diǎn)圖。

使用MetaboAnalyst(版本6.0)構(gòu)建了基于Logistic回歸模型的診斷標(biāo)志物組合。繪制受試者工作特征曲線(ROC),用曲線下面積(AUC)評估診斷CRC的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評估與質(zhì)量控制

經(jīng)靶向檢測方法確定各個(gè)氨基酸的檢測范圍如下:精氨酸,組氨酸,異亮氨酸,亮氨酸,賴氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,纈氨酸的濃度范圍為0.003～50 μM,谷氨酰胺,谷氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,酪氨酸的濃度范圍為0.006～100 μM,丙氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,甘氨酸,絲氨酸,蘇氨酸的濃度范圍為0.061～1000 μM。根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本質(zhì)譜信號檢測值計(jì)算,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.992,標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)良好。檢測限根據(jù)信噪比(S∶N=3)確定,定量限根據(jù)信噪比(S∶N=10)確定,質(zhì)譜響應(yīng)良好,符合方法學(xué)要求。

使用標(biāo)準(zhǔn)品混合液稀釋64倍的溶液(64×)作為質(zhì)量穩(wěn)定性控制,連續(xù)跑3針評估檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性,液相色譜峰保留時(shí)間相差不超0.05 min,且各氨基酸之間沒有相互影響,可以實(shí)現(xiàn)基線分離。在樣本中間隨機(jī)插入64×質(zhì)控樣本,20種氨基酸的變異系數(shù)(CV)均小于30%,酪氨酸最低9%,組氨酸最高23%,說明檢測系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。

氨基酸的保留時(shí)間,回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量下限、檢測限及CV結(jié)果見表1。

表1 20種氨基酸定量曲線結(jié)果

2.2 CRC患者和健康對照分析結(jié)果

入組的113例CRC患者與100例健康對照相比,年齡性別分布無差異。根據(jù)上述檢測曲線,定量20種氨基酸濃度,通過與肌酐校正后,統(tǒng)計(jì)分析在兩組間差異結(jié)果如下:精氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,谷氨酰胺,谷氨酸,甘氨酸,異亮氨酸,亮氨酸,賴氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,蘇氨酸,色氨酸,纈氨酸15種氨基酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),組氨酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。丙氨酸,苯丙氨酸,絲氨酸,酪氨酸四種氨基酸差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。在CRC患者中,賴氨酸,組氨酸,纈氨酸,異亮氨酸含量增高(圖1A)。

圖1 代表性氨基酸(賴氨酸,組氨酸,纈氨酸,異亮氨酸)在兩組中比較結(jié)果(1A)和用于CRC診斷的氨基酸組合ROC結(jié)果(1B)

表2 CRC患者與健康對照尿液20種氨基酸的定量比較結(jié)果

為確定可用于CRC診斷的氨基酸,對20種氨基酸的ROC結(jié)果進(jìn)行了分析,其ROC結(jié)果為0.5～0.75(表3),單個(gè)氨基酸不能很好的區(qū)分CRC與健康對照。為優(yōu)化氨基酸組合,將213例樣本隨機(jī)分為發(fā)現(xiàn)組(n=142)與驗(yàn)證組(n=71),使用Logistic回歸算法構(gòu)建CRC診斷模型,異亮氨酸,天冬酰胺,脯氨酸,組氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸6種氨基酸的組合在發(fā)現(xiàn)組/驗(yàn)證組的AUC分別為0.857/0.851,靈敏度為0.802/0.702,特異性為0.803/0.823(表3,圖1B),組合有良好的診斷效果,優(yōu)于單個(gè)氨基酸的診斷效果。

表3 氨基酸組合用于CRC診斷的結(jié)果

2.3 CRC各階段和健康對照分析結(jié)果

Ⅰ期CRC與健康對照相比,精氨酸,谷氨酸,亮氨酸,賴氨酸,苯丙氨酸,纈氨酸6種氨基酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),半胱氨酸,異亮氨酸,酪氨酸3種氨基酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Ⅱ期CRC與健康對照相比,天冬氨酸,谷氨酰胺,組氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,蘇氨酸,色氨酸7種氨基酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),精氨酸,天冬酰胺,半胱氨酸,谷氨酸,異亮氨酸,亮氨酸,賴氨酸,纈氨酸8種氨基酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。34例Ⅲ期CRC與健康對照相比,異亮氨酸,蛋氨酸,谷氨酰胺,天冬氨酸4種氨基酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),精氨酸,天冬酰胺,半胱氨酸,谷氨酸,甘氨酸,亮氨酸,賴氨酸,蘇氨酸,色氨酸,纈氨酸10種氨基酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Ⅳ期CRC與健康對照相比,丙氨酸,精氨酸,組氨酸,賴氨酸,絲氨酸,色氨酸6種氨基酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),天冬酰胺,半胱氨酸,谷氨酰胺,谷氨酸,甘氨酸,異亮氨酸,亮氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,蘇氨酸,纈氨酸11種氨基酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表2)。

在上述結(jié)果中,谷氨酰胺,蛋氨酸,在Ⅰ期CRC癌患者與健康對照相比雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但隨著疾病進(jìn)展有明顯升高,含量有線性增長趨勢。谷氨酸在Ⅲ期CRC患者中含量下降,色氨酸在IV期CRC患者中下降(圖2)。

圖2 代表性氨基酸(谷氨酰胺,谷氨酸,蛋氨酸,色氨酸)在CRC分期的比較結(jié)果

將上述異亮氨酸,天冬酰胺,脯氨酸,組氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸6種氨基酸組成的組合用于Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ期CRC的診斷,其AUC值分別為0.847,0.843,0.897,0.896。使用10倍交叉驗(yàn)證模型,AUC值分別為0.785,0.796,0.849,0.828,均具有良好的診斷效果(表3,圖3)。

圖3 氨基酸組合在不同CRC分期的ROC結(jié)果

3 討論

本研究通過靶向分析發(fā)現(xiàn)健康人群與CRC患者尿中20種氨基酸表達(dá)水平有明顯差異。氨基酸對于癌癥維持其增殖驅(qū)動力有重要作用,除了作為蛋白質(zhì)合成底物的直接作用外,它們還可以在能量產(chǎn)生、驅(qū)動核苷的合成和維持細(xì)胞氧化還原同質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用。

支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)是癌細(xì)胞中的氮供體,可以作為替代來源為三羧酸循環(huán)提供燃料,促進(jìn)生物能量途徑。腫瘤細(xì)胞的增殖和生長需要從腫瘤微環(huán)境中獲取必需的營養(yǎng)物質(zhì)。即使在營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)不足的情況下,腫瘤細(xì)胞也可以利用它們來維持生存,促進(jìn)生物能量途徑,介導(dǎo)脂肪生成,并調(diào)節(jié)核苷酸合成[12]。亮氨酸和異亮氨酸是癌癥代謝中的重要“模塊”,可以用于谷氨酸的合成,從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展中的生物合成[13]。研究表明,胰腺癌患者血漿中總支鏈氨基酸升高,可以轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A并進(jìn)入三羧酸循環(huán)[14]。

賴氨酸在肌肉組織中大量存在,可刺激鈣的吸收、肉堿合成以及肌肉組織的生長和修復(fù)。既往研究發(fā)現(xiàn)L-賴氨酸與糖尿病和心血管疾病有關(guān),在CRC患者尿液中下調(diào)[15]。肉堿系統(tǒng)是癌癥代謝可塑性的關(guān)鍵介質(zhì),交織著關(guān)鍵途徑、因子和代謝物,為癌細(xì)胞提供能量和生物合成需求[16]。

在本研究中發(fā)現(xiàn),與健康對照相比,CRC的色氨酸代謝顯著增加。在一項(xiàng)結(jié)腸癌血清代謝組的研究中,色氨酸、酪氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸在CRC早期有變化[17],另一項(xiàng)結(jié)腸癌血清代謝組研究也發(fā)現(xiàn)CRC早期患者血漿中色氨酸水平較低,但隨著CRC進(jìn)展升高[18]。色氨酸代謝在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起著重要作用,可通過犬尿氨酸途徑的分解代謝抑制T細(xì)胞增殖[19]。

蛋氨酸是蛋白質(zhì)合成中的一種必需氨基酸,蛋氨酸代謝與癌癥發(fā)生機(jī)制有關(guān),包括甲基化反應(yīng)、氧化還原維持、多胺合成和葉酸代謝偶聯(lián)以協(xié)調(diào)核苷酸和氧化還原狀態(tài),葉酸分布和蛋氨酸水平被發(fā)現(xiàn)是決定結(jié)腸癌細(xì)胞在CRC發(fā)育中分期的關(guān)鍵。蛋氨酸通過減少炎癥誘導(dǎo)的結(jié)腸癌和抑制結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)鍵通路,與CRC風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。蛋氨酸是 S-腺苷甲硫氨酸的前體,S-腺苷甲硫氨酸是甲基轉(zhuǎn)移酶的底物,S-腺苷甲硫氨酸的減少會誘導(dǎo)異常的 DNA 甲基化,進(jìn)而導(dǎo)致早期 CRC 發(fā)展[20]。CRC組織水平的研究證明,CRC患者的蛋氨酸含量低于健康人[18]。在本研究中,隨著CRC的進(jìn)展,蛋氨酸有線性的增長趨勢,在CRC晚期與健康人相比有更明顯的差異。

組氨酸、精氨酸雖然體內(nèi)可以自主合成,但合成的量不足以支持每日生命活動所需,也需要從外界獲取。組氨酸代謝在腫瘤遷移、侵襲和不良預(yù)后中起重要作用。磷酸組氨酸磷酸酶1可能與肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組有關(guān),從而影響肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[21]。此前報(bào)道CRC患者的尿液中組氨酸濃度顯著降低[22]。

谷氨酰胺是人體內(nèi)重要的非必需氨基酸,在體內(nèi)參與氮循環(huán)、細(xì)胞增殖、激活自噬等生物過程,在體內(nèi)可以由谷氨酸與氨經(jīng)谷氨酰胺合成酶催化而成。谷氨酰胺的碳骨架在癌細(xì)胞中被氧化,促進(jìn)了能量的產(chǎn)生和物質(zhì)的積累。這種機(jī)制是癌細(xì)胞的主要能量來源。在癌組織中,谷氨酰胺需求不能通過細(xì)胞水平的巨胞飲作用和(或)自噬消化來滿足。因此,許多組織上調(diào)谷氨酰胺合成酶以增加谷氨酰胺合成[23-24]。在本研究中發(fā)現(xiàn),隨著CRC的進(jìn)展,谷氨酰胺有著線性的增長趨勢。另一項(xiàng)關(guān)于CRC血清代謝組的研究發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺濃度變化可能反映了早期癌性病變。此外,觀察到谷氨酸與CRC風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[25]。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)CRC尿液中的氨基酸水平與正常人相比有明顯差異,尤其是在Ⅰ,Ⅱ期患者中,可以為CRC的早期診斷提供了新的線索,但本研究是一個(gè)單中心研究,本文的結(jié)論還有待于多中心樣本驗(yàn)證。