劉洪瑞,王 濤,孫家塍,張曉月,孫金生,左志晗
(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,天津 300387;2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室,天津 300387)
近年來,由于高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展,片面追求高生長速度而過度投餌或大量使用高能量高蛋白餌料,加劇了養(yǎng)殖魚類如草魚、鯽魚、鯉魚等脂肪肝病的發(fā)生.為了防治這一疾病,急需找到安全有效的解決辦法,目前通常是采用調(diào)節(jié)飲食的方式改善肝臟脂代謝異常.益生菌因其安全有效的特點廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中,益生菌可以增強(qiáng)水產(chǎn)動物抗病能力,促進(jìn)生長發(fā)育,改善水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境,提高養(yǎng)殖的產(chǎn)量和質(zhì)量[1],但采用益生菌調(diào)節(jié)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的脂代謝、防治脂肪肝方面的研究及應(yīng)用目前尚不足.現(xiàn)已有少量關(guān)于乳酸菌降低動物肝臟脂肪沉積、改善肝臟脂質(zhì)代謝的研究報道.如丁淑娟[2]通過測定體外清除膽固醇能力、產(chǎn)膽鹽水解酶活性以及胃腸液耐受能力對34株供試菌進(jìn)行篩選,最終得到了2 株降脂乳酸菌,它們可顯著降低高脂血癥大鼠的體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、血脂以及糞便脂質(zhì)含量.Hou 等[3]研究發(fā)現(xiàn),乳桿菌Lactobacillus delbrueckii 具有良好的腸道存活和定植能力,在豬日糧中添加該菌可以降低豬血清中的膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯.田佳鑫[4]用干酪乳桿菌(L.casei)、植物乳桿菌(L.plantaraum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)包被高脂飼料并將其飼喂給烏鱧,能夠緩解由高脂飼料導(dǎo)致的烏鱧脂肪肝.
益生菌因其高效、成本低、環(huán)境友好等特點被水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)廣泛應(yīng)用,但非魚源性益生菌很難在水產(chǎn)養(yǎng)殖中高效發(fā)揮作用,因此理想的益生菌應(yīng)該來自于魚類腸道[5].B?ckhed[6]第一次提出了“腸道菌群可作為一種環(huán)境因子來調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪的儲存”的觀點.本研究以從半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Gunther)腸道中分離出來的13 株益生菌為實驗菌株,通過對其體外產(chǎn)膽鹽水解酶(bile salt hydrolase,BSH)能力和體外降膽固醇能力的測定與比較,初步篩選出具有降脂作用的益生菌,進(jìn)一步通過高脂斑馬魚的飼喂實驗,驗證其在水產(chǎn)動物體內(nèi)的降脂作用效果.研究旨在為緩解魚類肝臟脂肪堆積篩選有效的益生菌菌株,進(jìn)而為解決水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中魚類脂肪肝的問題提供參考.
本研究所用的13 株菌均為實驗室前期從半滑舌鰨腸道中分離獲得,菌株編號分別為SC-01、SC-02、SC-03、SC-04、YZ-01、YZ-02、YZ-03、ND-1、U2、U3、SH-1、M4、YA6.
BSH 篩選培養(yǎng)基:MRS 液體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂、0.3%牛膽鹽、0.2%巰基乙酸鈉、0.37 g/L 氯化鈣.MRSTHIO-OX-CHOL 培養(yǎng)基:MRS 液體培養(yǎng)基中添加0.3%牛膽鹽、0.2%巰基乙酸鈉、0.1 mg/mL 膽固醇溶液.
膽固醇溶液:取膽固醇粉末0.5 g,用無水乙醇加熱溶解并定容至50 mL,獲得10.0 mg/mL 的膽固醇溶液,用0.45 μm 的微孔濾膜除菌,按1%的量加入到無菌MRS 液體培養(yǎng)基中,獲得0.1 mg/mL 的膽固醇溶液.鄰苯二甲醛工作液:稱取鄰苯二甲醛50 mg,用無水乙醇定容到50 mL,獲得1 mg/mL 的鄰苯二甲醛工作液,冷藏備用.混合酸∶冰乙酸與濃硫酸按照體積比為1 ∶1 的比例混勻.
將滅菌的BSH 篩選培養(yǎng)基倒入無菌平板中,待培養(yǎng)基凝固后將直徑4 mm 的無菌濾紙片均勻放置在培養(yǎng)基上.將活化好的待測菌液10 μL 緩慢加在無菌濾紙片上,待菌液完全吸收后,37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h,觀察濾紙片周圍是否出現(xiàn)白色沉淀物,有白色沉淀即可初步判定該菌株產(chǎn)生了BSH.
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取5 支試管按照1—5 編號,按順序分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL 的膽固醇溶液,再按照順序分別加入冰醋酸0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mL,每支試管再分別加入鄰苯二甲醛試劑,振蕩混勻.靜置10 min 后分別加入混合酸4.0 mL,混合均勻,在室溫下靜置10 min.將反應(yīng)液置入96 孔板中,以膽固醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),OD550值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.
樣品OD 值的測定:將菌株的菌懸液按照3%的接種量添加到10 mL 的MRS-THIO-OX-CHOL 培養(yǎng)基中,37°C 培養(yǎng)24 h.將剛接種菌的培養(yǎng)基在9 000 r/min條件下離心10 min,取上清液0.25 mL,加入鄰苯二甲醛工作液0.1 mL,充分振蕩后靜置10 min.加入混合酸溶液2.0 mL,室溫下靜置10 min,將反應(yīng)液置入96 孔板中,測定其OD550.分別于6、12 和24 h 時取樣,按照上述鄰苯二甲醛法測定發(fā)酵液OD 值.根據(jù)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程確定發(fā)酵液中膽固醇的含量,膽固醇脫除率的計算公式為
式中:A 為菌株發(fā)酵后上清液中的膽固醇含量;B 為菌株發(fā)酵前上清液中的膽固醇含量.
1.5.1 斑馬魚高脂飼料的制備
100 g 基礎(chǔ)飼料中包含:酪蛋白40 g、明膠10 g、糊精35 g、豆油6 g、賴氨酸0.33 g、VC 磷酸酯0.1 g、多維0.2 g、多礦0.2 g、磷酸二氫鈣2 g、氯化膽堿0.2 g、海藻酸鈉2 g、微晶纖維素3.97 g.粗蛋白總量為42.19 g,粗脂肪總量為6.09 g,每克飼料能量為18.55 kJ.
100 g 高脂飼料中包含:酪蛋白40 g、明膠10 g、糊精25g、豬油8g、豆油8g、賴氨酸0.33g、VC 磷酸酯0.1 g、多維0.2 g、多礦0.2 g、磷酸二氫鈣2 g、氯化膽堿0.2 g、海藻酸鈉2 g、微晶纖維素3.97 g.粗蛋白總量為42.19 g,粗脂肪總量為15.77 g,每克飼料能量為20.85 kJ.
1.5.2 斑馬魚養(yǎng)殖及分組
將斑馬魚分成15 組(每組設(shè)置3 個平行),每組150 條,分別設(shè)置空白組(control)、高脂組(HF)和實驗組.實驗組飼喂高脂加菌飼料(進(jìn)行13 株候選菌的飼喂及浸浴,濃度為3×105cfu/mL),空白組飼喂基礎(chǔ)飼料且不浸浴益生菌,高脂組飼喂高脂飼料且不浸浴益生菌.從早上九點和晚上九點進(jìn)行飼喂,周期為30 d.由于養(yǎng)殖系統(tǒng)的水會自動持續(xù)更新流出,所以實驗組每隔2 h 向水中補(bǔ)充1 次益生菌.
浸浴菌泥的制備:將13 株菌分別活化至1×105cuf/mL,取10 mL 活化菌液于15 mL 離心管中,5 000 r/min、4 ℃下離心10 min,棄去上清,放置于4 ℃冰箱中備用,時間不超過48 h.
飼喂飼料的制備:將13 株菌分別活化添加到飼料中,使飼料中的菌含量達(dá)到1×107cfu/g,靜置使飼料表面干燥松散后噴入10%的海藻酸鈉溶液,充分?jǐn)嚢瑁购T逅徕c包裹在飼料表面,防止飼料在水中快速溶解.配制好的飼料置于4 ℃冰箱備用,放置時間不能超過48 h,最好現(xiàn)配現(xiàn)用.
斑馬魚飼喂養(yǎng)殖30 d 后,對各組斑馬魚肝臟樣品進(jìn)行采集,過程如下:用無菌解剖刀,在無菌狀態(tài)下取出整個肝臟,裝入2.0 mL 無酶凍存管中,放置于冰上.將取下的肝組織放入加入了4%多聚甲醛的無酶15 mL離心管中固定,將分裝好的樣品立即放入-80 ℃低溫保存,使用多聚甲醛固定的肝組織常溫保存,委托武漢塞維爾公司制做油紅O 染色石蠟包埋冷凍切片.
DNA 模板的制備:將待測菌株在固體培養(yǎng)基上多次劃線純化后,接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中,置于搖床上180 r/min 培養(yǎng)24 h.在超凈工作臺中取培養(yǎng)后的1 mL 菌液于滅菌離心管中,8 000 r/min 離心3 min;在超凈工作臺中倒去上清,加入0.1 mL 無菌水,振蕩搖勻后,100 ℃水浴10 min;于12 000 r/min 離心10 min,上清液即為DNA 模板,-20 ℃保存.
用細(xì)菌鑒定通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增待鑒定菌株的16S rDNA 片段,引物27F 的序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R 的序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.
選擇50 μL 反應(yīng)體系,包含25 μL 的2×Taq Mix、19 μL 的ddH2O、2 μL 的27F、2 μL 的1492R、2 μL 的DNA.PCR 反應(yīng)程序:以提取的DNA 為模板,按照PCR 反應(yīng)體系將試劑依次添加至200 μL 的PCR 管中,渦旋儀振蕩混勻.PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃,4 min;變性94 ℃,30s;退火55 ℃,1 min;延伸72 ℃,90 s;延伸72 ℃,10 min.變性、退火、延伸設(shè)置為35個循環(huán).
配制1%的瓊脂糖電泳凝膠進(jìn)行PCR 產(chǎn)物檢測.于100 mL 錐形瓶中加入600 μL 的50×TAE、30 mL 蒸餾水和0.3 g 瓊脂糖,微波爐加熱完全溶解,降至室溫后,加入1 μL 的EB 混勻,將膠小心倒入事先插好梳子的制膠板中,避免起泡,室溫靜置,待其凝固,拔出梳子,將膠移入電泳槽緩沖液內(nèi).第一個膠孔加5 μL的Marker,后面分別加5 μL 的PCR 產(chǎn)物,連接電源,設(shè)置電壓95 V,時間30~40 min.電泳結(jié)束后,將膠取出置于紫外凝膠成像儀下觀察.
序列測定比對:將擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物委托北京金唯智公司進(jìn)行雙向測序,引物為27F 和1492R.測得序列在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行blast序列比對分析,確定菌株所在菌屬,并用MEGA 7 構(gòu)建菌種進(jìn)化樹.
2.1.1 菌株產(chǎn)膽鹽水解酶的能力
膽鹽水解酶可以水解膽鹽,在益生菌降膽固醇機(jī)制中發(fā)揮重要作用[7].將菌株點種在含膽鹽及無水氯化鈣的培養(yǎng)基上,根據(jù)產(chǎn)生白色沉淀圈的大小可以初步判斷益生菌產(chǎn)BSH 能力,結(jié)果如圖1 所示.由圖1可以看出,13 株菌中,菌株ND-1 和U3 產(chǎn)BSH 能力最強(qiáng),沉淀圈大小為1.3 cm;其次是菌株SC-03,沉淀圈大小為1.1 cm,YZ-01 沉淀圈大小為0.9 cm.
圖1 13 個菌株的產(chǎn)膽鹽水解酶能力Fig.1 Production capacity of BSH of the 13 strains
2.1.2 菌株降解膽固醇的能力
對13 株菌降解膽固醇的能力進(jìn)行測定,各菌株在不同時間的膽固醇去除率如圖2 所示.由圖2 可以看出,菌株YA6 在6 h 的降脂效果最顯著,其膽固醇去除率為91.43%;其次為菌株ND-1,24 h 的膽固醇去除率為89.76%;菌株M4 在6 h 的膽固醇去除率為80.77%,菌株U3 在24 h 的膽固醇去除率為76.67%.
圖2 菌株體外膽固醇去除率Fig.2 In vitro cholesterol removal rate of the 13 strains
2.2.1 菌株對斑馬魚體質(zhì)量的影響
為了探究13 株菌的體內(nèi)降脂能力,建立高脂飲食斑馬魚模型,分析13 株菌對斑馬魚脂代謝水平的影響,結(jié)果如圖3 所示.由圖3 可以看出,用不同菌株干預(yù)30 d 后,與高脂組相比,添加了菌株U2、SC-04、YZ-02、ND-1 的實驗組中斑馬魚的體質(zhì)量均顯著降低(P <0.000 1);其次是菌株U3 的降體質(zhì)量效果也較顯著.U2 組的體質(zhì)量降低率最高,為48.18%;SC-04 組、ND-1 組和YZ-02 組的體質(zhì)量降低率分別為32.97%、31.05%和21.63%.以上結(jié)果初步說明這4 株菌對斑馬魚機(jī)體的脂代謝存在影響.
圖3 斑馬魚體質(zhì)量Fig.3 Body mass of zebrafish
2.2.2 菌株對斑馬魚肝臟甘油三酯含量的影響
肝臟是脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)控的重要組織器官,基于益生菌對正常飲食和高脂飲食斑馬魚體質(zhì)量的影響,對斑馬魚肝臟中甘油三酯的濃度進(jìn)行評估,結(jié)果如圖4 所示.由圖4 可以看出,與高脂組相比,添加了菌株SC-01、YZ-02、U3 和SH-1 的實驗組中斑馬魚肝臟的甘油三酯濃度顯著降低.YZ-02 組降低效果最明顯,甘油三酯同高脂組相比降低了81.25%;SH-1 組、U3 組、SC-01 組、ND-1 組分別降低了53.68%、49.33%、47.56%、41.88%(P<0.000 1).
圖4 斑馬魚肝臟甘油三酯含量Fig.4 Liver triglyceride content of zebrafish
2.2.3 斑馬魚肝臟油紅O 染色切片
為了進(jìn)一步檢測13 株菌改善斑馬魚肝臟脂滴沉積作用的效果,取斑馬魚肝臟組織進(jìn)行油紅O 染色、石蠟固定和冰凍切片,鏡下觀察結(jié)果如圖5 所示.
圖5 斑馬魚肝臟油紅O 染色切片F(xiàn)ig.5 Oil red O-stained sections of zebrafish liver
由圖5 可以看出,添加菌株YZ-01、ND-1、U3 的3個實驗組中,肝臟脂滴數(shù)量及大小明顯低于高脂組的數(shù)值,說明菌株YZ-01、ND-1、U3 可以有效緩解脂肪在肝臟中的沉積.
針對降脂效果明顯的菌株U3 和ND-1,使用試劑盒提取基因組DNA 片段,以其為模板擴(kuò)增16S rDNA基因序列,將擴(kuò)增產(chǎn)物滴加于1%的瓊脂糖凝膠樣品孔中進(jìn)行電泳檢測,獲得了大約1 500 bp、較為均一的片段.將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行送測,所得測序結(jié)構(gòu)在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性序列比對,根據(jù)比對結(jié)果可知,菌株U3 與鼠李糖乳酸桿菌(Lacticaseibacillus rhamnosus strain 5681,MT463591)的相似度為98%,菌株ND-1 與馬胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum strain Y15,JX134628)的相似度為100%.
對菌株U3 和ND-1 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,以16S rDNA 基因序列為遺傳標(biāo)記構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果如圖6 所示.由圖6 可以看出,菌株U3 與鼠李糖乳酸桿菌聚為一支,置信度為98%;菌株ND-1 與馬胃葡萄球菌聚為一支,置信度為100%.
圖6 菌株進(jìn)化樹Fig.6 Strain evolutionary tree
魚類脂肪肝疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見的營養(yǎng)性疾病,肝臟脂肪沉積是誘導(dǎo)脂肪肝發(fā)病的主要原因[8].本研究對前期從半滑舌鰨中分離獲得的水生動物腸道菌株進(jìn)行篩選,初步獲得了安全有效的具有降脂作用的益生菌菌株.首先考察候選菌株的體外產(chǎn)膽鹽水解酶的能力,膽鹽水解酶屬于N 端親水水解酶超家族,在N 端半胱氨酸殘基催化核心部位具有αββα 結(jié)構(gòu)[9],能夠降解膽汁酸,對膽固醇的消化吸收及體內(nèi)的膽固醇消耗具有一定的作用,已被認(rèn)定是潛在的肥胖治療靶點[10].因此,本研究以菌株高產(chǎn)膽鹽水解酶作為體外篩選具有降脂作用菌株的首要指標(biāo)對菌株進(jìn)行測試,結(jié)果顯示菌株ND-1 和U3 產(chǎn)膽鹽水解酶的能力最強(qiáng),證明這2 株菌可能通過產(chǎn)生膽鹽水解酶這個靶點降低魚體的膽固醇沉積.Michael 等[11]研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌Lab4 和CUL66 具有產(chǎn)膽鹽水解酶的能力,將其飼喂給小鼠后小鼠的糞便中膽汁酸的含量增加,由此推測2 株菌通過在宿主腸道中產(chǎn)生的膽鹽水解酶介導(dǎo)了膽汁酸的凈化,從而增加膽汁酸從頭合成,最終使膽汁酸含量增加.劉煜珺[8]研究發(fā)現(xiàn),將具有產(chǎn)膽鹽水解酶能力的植物乳桿菌Y44 飼喂給高脂膳食小鼠能夠顯著降低小鼠血清膽固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白,并可以緩解小鼠肝臟脂肪空泡的產(chǎn)生.Ma 等[12]研究發(fā)現(xiàn),高產(chǎn)膽鹽水解酶的乳酸菌可以通過加強(qiáng)宿主消化系統(tǒng)結(jié)合態(tài)膽汁酸的分解,抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),降低宿主飲食中膽固醇等脂類物質(zhì)的吸收,與本實驗結(jié)果較為相似.
目前,有多項研究證實了益生菌對非酒精性脂肪肝(NAFLD)具有積極作用[13].如曹少鋒等[14]研究發(fā)現(xiàn),在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 模型中,與對照組(給予生理鹽水灌胃)相比,實驗組小鼠(給予鼠李糖乳桿菌DM9054 聯(lián)合植物乳桿菌86066 灌胃)的體質(zhì)量減輕,血清TG、TC、LDL-C 水平降低,肝臟脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象顯著減少.水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中對于益生菌緩解魚類脂肪肝有少量研究報道,如張震[15]研究發(fā)現(xiàn),將經(jīng)典益生菌(鼠李糖乳桿菌LGG 和干酪乳桿菌BL23)添加進(jìn)飼料,益生菌可以通過維護(hù)腸道菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定來緩解高脂飲食誘導(dǎo)的魚類脂肪肝.本研究從半滑舌鰨腸道中分離得到的13 株益生菌中,菌株YZ-02、U2、SC-04 和ND-1 可以減輕斑馬魚的體質(zhì)量,菌株SC-01、YZ-02、U3 和SH-1 可以降低斑馬魚肝臟中的甘油三酯含量,菌株YZ-01、ND-1 和U3 可有效緩解斑馬魚中脂滴的沉積.綜合來看,菌株U3 和ND-1 對斑馬魚肝臟脂肪肝的降脂效果最好,16S rDNA 測序比對以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示,菌株U3 與鼠李糖乳酸桿菌聚為一支,菌株ND-1 與馬胃葡萄球菌聚為一支.上述研究表明,采用益生菌緩解動物體內(nèi)尤其是肝臟中脂肪的積累具有明顯效果.