金遼，劉銀松，林建楓，張文偉，顧鋼，魏恕文，汪睿琪，謝小芳,4，張炳輝

（1福建省煙草公司南平市公司，福建延平 353000；2福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；3福建省煙草專賣局煙草科學(xué)研究所，福州 350003；4福建省作物設(shè)計育種重點實驗室，福州 350002）

0 引言

烘烤是煙葉感官和品質(zhì)形成的關(guān)鍵階段。目前煙葉生產(chǎn)主要以三段式烘烤為主，即變黃、定色、干筋。其中，變黃階段主要使煙葉變黃變軟，包含了一系列物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，如淀粉、蛋白質(zhì)水解，可溶性糖、有機酸增多，以及氨雜味散失，煙堿含量降低等；定色階段使煙葉干燥，固定并保持已形成的色澤和品質(zhì)；干筋階段則是使整個葉片及主脈干燥。在烘烤過程中，煙葉經(jīng)歷了一系列復(fù)雜的物質(zhì)代謝變化，其代謝產(chǎn)物隨烘烤溫度和時間的動態(tài)變化組成了煙葉特有的內(nèi)含物質(zhì)，形成了特色的香氣和風(fēng)味。

煙草中含有各種多酚類物質(zhì)及其相關(guān)化合物，包括綠原酸、香豆素類、黃酮類等[1-2]。多酚類物質(zhì)在煙草的調(diào)制特性，色澤和等級，以及煙氣香味等各個方面起著重要作用[3-4]。烘烤過程中的酶促棕色化反應(yīng)是酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要途徑，適當(dāng)?shù)淖厣磻?yīng)能夠使酚類物質(zhì)有效轉(zhuǎn)換，是生產(chǎn)高品質(zhì)煙葉產(chǎn)品的關(guān)鍵工藝。以往對酶促棕色化反應(yīng)的研究多集中在PPO 活性變化[5]、單一或幾種化學(xué)成分，如多酚類物質(zhì)、萜類、生物堿等含量[6-8]，忽視了對代謝產(chǎn)物的整體探究，特別是烘烤過程的棕色化反應(yīng)過程中多酚代謝途徑的整體變化，以及多酚類物質(zhì)降解產(chǎn)物等方面還有眾多問題尚不清楚。

代謝組學(xué)(Metabolomics)利用高通量檢測與數(shù)據(jù)處理，以信息建模和系統(tǒng)整合為目標(biāo)，研究特定時期和特定環(huán)境中生物體或某一器官組織中全部小分子的代謝產(chǎn)物整體變化規(guī)律和機制，包括次生代謝組，揮發(fā)性代謝組，以及糖醇類化合物、氨基酸、有機酸類、脂類等物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析[9]，闡明代謝途徑中關(guān)鍵的酶和底物與中間產(chǎn)物的相互作用情況，為構(gòu)建新的代謝通路提供依據(jù)[10]。在煙草烘烤過程中，利用代謝組學(xué)方法分析煙葉品質(zhì)形成的各類代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化及其之間的相互作用關(guān)系，可以從整體上探究物質(zhì)的代謝變化，揭示煙草品質(zhì)形成的代謝物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。福建省煙區(qū)特色品種翠碧一號(CB-1)煙葉具有較高的內(nèi)在品質(zhì)，在卷煙工業(yè)的煙葉配方中的使用性較高[12]，但是其煙葉較難烘烤，常常發(fā)生過度的棕色化反應(yīng)而產(chǎn)生較高比例的掛灰煙，影響了經(jīng)濟效益[13-14]。本研究擬以CB-1為材料，利用代謝組學(xué)技術(shù)方法從全局上分析煙葉烘烤過程中的代謝物變化，系統(tǒng)探究烘烤過程中多酚類物質(zhì)代謝及其相關(guān)代謝通路，以期從整體上解析烘烤過程中多酚類代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化，為揭示煙草品質(zhì)形成的代謝物質(zhì)基礎(chǔ)和棕色化反應(yīng)調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以福建省南平市延平區(qū)巨口鄉(xiāng)栽種的烤煙品種翠碧一號(CB-1)上部葉（13～15 葉位）為實驗材料。依據(jù)當(dāng)?shù)睾婵竟に?，選取烘烤過程中5 個關(guān)鍵節(jié)點的煙葉樣品，包括變黃前期(40℃)和變黃后期(41℃)、以及定色前期(43℃)、定色期(45℃)和46℃（定色小卷筒期）等，分別記為T1、T2、T3、T4和T5。每6 片煙葉作為一個樣品，3個生物學(xué)重復(fù)，共15份樣品，剪去葉片前后1/4部分后，沿主脈兩側(cè)打孔取樣，錫紙包裹后做好標(biāo)記，置于液氮中，隨后放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品處理

將采集的樣品放置于凍干機中進(jìn)行真空冷凍干燥，進(jìn)一步利用研磨儀將樣品研磨至粉末狀，稱取50 mg 的粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中，充分渦旋和離心后，吸取上清，用微孔濾膜（型號為0.22 μm pore size）過濾，并將樣品置于進(jìn)樣瓶中，用于代謝物分析。

1.3 儀器分析

利用超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測分析烘烤過程中5個關(guān)鍵節(jié)點的樣品代謝物。主要儀器為超高液相色譜(UPLC，ExionLC?AD)，串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry， MS/MS， Applied Biosystems 6500 QTRAP)，色譜柱(Agilent SB-C18，1.8 μm，2.1 mm×10 mm)。試驗所用的試劑均為色譜純，主要包括甲醇、甲酸和乙腈。具體的檢測由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成(www.metware.cn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于邁特維爾生物科技有限公司的自建MWDB V2.0數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性。利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式對不同烘烤溫度節(jié)點樣品的代謝物進(jìn)行定量分析，獲得各樣品的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，進(jìn)一步對所有物質(zhì)色譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正[15]。通過混合樣本提取物制備質(zhì)控樣本，用于監(jiān)測和校正代謝物提取和檢測的重復(fù)性和可靠性。采用軟件Analyst 1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。利用R 語言(www.r-project.org)進(jìn)行主成分分析(PCA)，顯示樣品組內(nèi)和組間的差異。以|Log2FC|≥1，VIP≥1，P<0.05為閾值篩選差異代謝物。對鑒定的差異代謝物的相對含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用K均值進(jìn)行聚類分析。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對代謝物進(jìn)行注釋[16]，分析樣品間差異代謝物的KEGG 代謝通路(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本主成分分析

15份樣本和QC樣本的主成分分析(PCA)顯示（圖1A），QC 樣本點聚集在中心區(qū)域，說明這些樣本分析方法穩(wěn)定，數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。從15 份樣本的PCA 圖（圖1B）發(fā)現(xiàn)，第1 成分(PC1)對樣本的貢獻(xiàn)率達(dá)43.98%，第2成分(PC2)對樣本的貢獻(xiàn)率為8.48%。每個處理內(nèi)部的樣本點分布相對集中，表明組內(nèi)樣本的重復(fù)性較好，代謝物較一致。此外，變黃前期(40℃)和變黃后期(41℃)的樣本與其他樣本的分布明顯分離，但是43℃、45℃和46℃等3 個溫度節(jié)點樣本分布較為集中，說明從變黃前期(40℃)至定色前期(43℃)，煙葉的物質(zhì)代謝明顯，代謝物之間存在較大差異，而定色期(43℃)之后，葉片的物質(zhì)代謝較為緩慢，樣本間的差異較小。

圖1 樣本代謝組的主成分分析

2.2 不同溫度節(jié)點樣本差異代謝物

為了揭示烘烤過程中物質(zhì)代謝變化，對40℃、41℃、43℃、45℃和46℃（即T1～T5）等5 個溫度節(jié)點的代謝物進(jìn)行檢測分析。在5組樣本中共鑒定了1069種代謝物，主要為黃酮類、酚酸類，脂質(zhì)、生物堿、氨基酸及其衍生物、有機酸、核苷酸及其衍生物、木脂素和香豆素、萜類等物質(zhì)，其中黃酮類和酚酸類等多酚類物質(zhì)為374 種，達(dá)總數(shù)的34.99%。通過兩兩比較發(fā)現(xiàn)（圖2），烘烤過程中的T1和T2節(jié)點與其他溫度節(jié)點的差異代謝物較多，并且主要以上調(diào)為主。其中，以T1為對照的4 組比較組（T1VS T2，T1VS T3，T1VS T4，T1VS T5）的差異代謝物分別為137（上調(diào)130，下調(diào)7）、331（上調(diào)298，下調(diào)33）、339（上調(diào)304，下調(diào)35）、322（上調(diào)294，下調(diào)28），以T2為對照的3 組比較（T2VS T3，T2VS T4，T2VS T5）的差異代謝物分別為262（上調(diào)246，下調(diào)16）、284（上調(diào)261，下調(diào)23）、289（上調(diào)255，下調(diào)34）。同時，T3、T4和T5等3 個溫度點之間的差異代謝物很少，T3VS T4、T3VS T5和T4VS T5等比較組的差異代謝物都僅分別為13，14，19，說明烘烤定色(43℃)之后，煙葉內(nèi)物質(zhì)的代謝速度下降，物質(zhì)含量變化幅度較小。此外，在所有的7個比較組中，多酚類差異代謝物為101種。在T1VS T2、T1VS T3、T1VS T4、T1VS T5等4個比較組多酚類的差異代謝物分別29，72，73和69（圖3），其中有24 種多酚類差異代謝物為這4 個比較組（T1VS T2、T1VS T3、T1VS T4、T1VS T5）所共有，達(dá)總數(shù)的27.59%，有35 種差異代謝物為3 組比較組所共有（T1VS T3，T1VS T4，T1VS T5），達(dá)總數(shù)的40.23%。

圖2 各個比較組中的差異代謝物數(shù)目

圖3 各個比較組中多酚類差異代謝物Venn圖

2.3 多酚類差異代謝物K均值聚類

為探究代謝物在不同樣本組中的相對含量變化趨勢，對多酚類差異代謝物進(jìn)行了K均值(K-Means)聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，101 種差異代謝物聚為8 種類型（圖4），每種模式中的代謝物具有類似的變化趨勢。其中，Class 5 包含的差異代謝物最多，達(dá)39 種，其物質(zhì)累積變化主要發(fā)生在T2～T3階段，即由變黃期至定色期的過度階段，代謝物含量呈現(xiàn)明顯上升，隨后在T3～T5階段趨于穩(wěn)定；class 4和class 7的表達(dá)模式類似，分別包含差異代謝物18和17種，這些代謝物隨著烘烤時間的推移呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)趨勢，隨后在T4～T5階段略微下調(diào)，在T2～T3過度階段上調(diào)最明顯；而class 6包含的代謝物位居第四，達(dá)8 種，代謝物呈現(xiàn)先上調(diào)再下調(diào)，隨后略微上調(diào)的趨勢。Class 3 包含的差異代謝物達(dá)7 種，這些代謝物從T1至T3階段呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢，在T3階段達(dá)到最高，隨后下降。此外，class 1、class 3和class 8模式的差異代謝物較少，僅分別為3，5和4。

圖4 多酚類差異代謝物變化模式聚類分析

2.4 多酚類差異代謝物動態(tài)變化

多酚類物質(zhì)是酶促棕色化反應(yīng)的主要底物，為探究酶促棕色化反應(yīng)的代謝中間產(chǎn)物和代謝通路，進(jìn)一步對鑒定的多酚類差異代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在分析的5 個烘烤節(jié)點中，酚酸類有62 種，主要為苯甲酸、苯乙酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸等；黃酮類38 種，主要包括二氫黃酮、黃酮，黃酮醇、查耳酮等物質(zhì)，圖5和圖6 分別顯示差異倍數(shù)|Log2FC|≥2 的31 種酚酸類物質(zhì)和11種黃酮類物質(zhì)。由圖5可知，隨著烘烤時間的增加，這31種酚酸類物質(zhì)主要以上調(diào)為主。其中分支Ⅰ中的8 種代謝物在T1時期含量很低，除了3-甲氧基苯甲酸(3-Methoxybenzoic acid)和4-甲基苯甲酸(4-Methylbenzoic acid)在T3時期明顯上調(diào)外，其余6 種均在T2時期明顯上升，至T3時期繼續(xù)上調(diào)，隨后基本保持穩(wěn)定；分支Ⅱ中的6 種代謝物在T1和T2時期含量相對較低，至T3明顯上調(diào)，隨后基本保持穩(wěn)定；分支Ⅲ和Ⅳ中的代謝物在T1和T2時期就有相對較高的含量，隨著烘烤時間和溫度的推移表現(xiàn)上調(diào)趨勢，在T3階段之后，含量基本保持穩(wěn)定，并且分支Ⅳ中的6種代謝物在T3、T4和T5時期含量明顯高于其他代謝物。黃酮類代謝物與酚酸類呈現(xiàn)類似的變化趨勢（圖6），其代謝物含量上調(diào)主要發(fā)生在T2～T3階段，大多數(shù)代謝物在T3之后基本保持穩(wěn)定，但是有個別代謝物具有不同的變化趨勢，例如 3- 鄰乙?；倘~松素(3-OAcetylpinobanksin)在T5階段大幅下調(diào)，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷-7-O-葡萄糖苷(Isorhamnetin-3-O-glucoside-7-O-glucoside)在T2～T4表現(xiàn)連續(xù)上調(diào)，T4時期達(dá)到最高，隨后下調(diào)。

圖5 不同烘烤節(jié)點煙葉酚酸類差異代謝物豐度變化

圖6 黃酮類差異代謝物豐度變化

2.5 多酚類代謝物代謝通路

多酚類化合物KEGG 代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，這些代謝物主要富集在4 條代謝通路中，包括酪氨酸代謝(Map 00350)，苯丙氨酸代謝(Map 00360)、苯丙烷類生物合成(Map 00940)和類黃酮生物合成(Map 00941)。根據(jù)KEGG Pathway 的數(shù)據(jù)庫已知的代謝通路，繪制了CB-1 上部葉烘烤過程中主要差異代謝物富集的生物合成代謝通路（圖7），這些代謝通路主要涉及與煙葉風(fēng)味品質(zhì)相關(guān)的氫醌、綠原酸、山奈酚和芥子酸等物質(zhì)的生物合成。研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸代謝通路和酪氨酸代謝途徑均可生成2,5-二羥基苯乙酸，轉(zhuǎn)化形成2,5-二羥基苯甲醛、再轉(zhuǎn)化成2,5-二羥基苯甲酸甲酯，最后形成氫醌（圖7A）。本研究中，合成氫醌通路上的代謝物均在T2～T3階段發(fā)生了明顯的上調(diào)。苯丙烷類生物合成通路中（圖7B），苯丙氨酸合成咖啡酸，轉(zhuǎn)化形成阿魏酸，在酶的作用下轉(zhuǎn)化為芥子酸，這條通路上的代謝物大多在T1～T3階段發(fā)生了上調(diào)。類黃酮生物合成通路中（圖7B），差異代謝物變主要集中在三條途徑，一是由苯丙氨酸合成的肉桂酰-CoA，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化對香豆酸CoA，經(jīng)對香豆?？崴岷铣删G原酸，或者經(jīng)對香豆酰莽草、咖啡酰，最后合成綠原酸；另一條通路上，肉桂酰-CoA經(jīng)柚皮素查爾酮、柚皮素、二氫山奈酚，形成山奈酚；此外，由肉桂酰-CoA，經(jīng)松屬素查爾酮、喬松素、短葉松素，最后形成短葉松素-3-乙酸酯。

圖7 多酚類差異代謝物的代謝網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論與結(jié)論

酚類物質(zhì)在煙葉調(diào)制特性，色澤等級和煙氣香味特征形成中都具有重要作用[2]。多酚化合物不僅能夠賦予煙葉某些特定的香氣，在煙草燃燒時，酚類會產(chǎn)生酸性反應(yīng)，中和煙草制品中的部分堿性，使煙葉的吃味趨于醇和。煙葉陳化過程中，煙葉中多酚類物質(zhì)會發(fā)生棕色化反應(yīng)，使葉片顏色明顯變深，其吃味也會變得更醇。然而，在烘烤過程中，如果多酚類物質(zhì)發(fā)生過度氧化，就容易產(chǎn)生過度棕色化反應(yīng)，造成內(nèi)在化學(xué)成分比例失調(diào)，從而使煙葉顏色和內(nèi)在品質(zhì)變差。一般而言，植物組織的褐變反應(yīng)包括酚類物質(zhì)、酶和氧氣三大要素[17]。多酚氧化酶(PPO)是棕色化反應(yīng)中最主要的酶[18]，以往的研究發(fā)現(xiàn)，PPO 酶在43℃～46℃之間具有較高的活性[2]，說明43℃～46℃區(qū)間是棕色化反應(yīng)的敏感期。本研究中，從烘烤過程重要溫度節(jié)點的代謝組學(xué)分析可以看出，大部分酚類物質(zhì)含量在43℃之后趨于穩(wěn)定（圖5，圖6），表明大部分酚類物質(zhì)沒有被氧化成醌，該烘烤工藝下不會發(fā)生過度棕色化反應(yīng)。其原因可能是定色期后，煙葉水分含量較低，PPO酶缺乏適宜的反應(yīng)場所。前人研究表明，烘烤階段的變黃末期至定色初期是酶促棕色化反應(yīng)敏感期，但是當(dāng)含水量小于原來含水量的50%，酶促棕色化反應(yīng)就較難發(fā)生[19-22]。由此可見，在定色之前，可通過降低煙葉細(xì)胞的含水量抑制PPO 活性，調(diào)控棕色化反應(yīng)的速度，防止煙葉過度褐變。

煙草中的酚類物質(zhì)種類眾多，其中綠原酸和蕓香苷是煙草中最主要的酚類物質(zhì)[23]。本研究的差異代謝物富集在酪氨酸代謝，苯丙氨酸代謝、苯丙烷類生物合成和類黃酮生物合成等4 條通路中，這些通路均與綠原酸和蕓香苷的合成相關(guān)。通常情況下，多酚的物質(zhì)代謝起始于苯丙氨酸和酪氨酸等芳香氨基酸，在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的催化下形成對香豆素，隨后在一系列相關(guān)酶的作用下反應(yīng)形成苯丙烷類和黃酮類物質(zhì)。綠原酸的生物合成屬于苯丙烷類代謝通路的分支，苯丙烷類代謝通路和類黃酮生物合成通路中均可形成綠原酸關(guān)鍵物質(zhì)肉桂酰CoA（圖7B），由此再合成對香豆酸-CoA，然后經(jīng)對香豆?？崴岷铣删G原酸，或者經(jīng)對香豆酰莽草、咖啡酰，最后合成綠原酸；同時，對香豆酸-CoA也可以在CHS酶的作用下合成黃酮類物質(zhì)，最終合成蕓香苷[24]。本研究中，從變黃期至定色期階段，形成綠原酸通路上的代謝物大多發(fā)生了上調(diào)，然而綠原酸的含量并未發(fā)生明顯變化，其原因可能是部分綠原酸發(fā)生了轉(zhuǎn)化。此外，苯丙氨酸代謝通路和酪氨酸代謝通路中，氫醌形成途徑上的代謝物大多出現(xiàn)了上調(diào)（圖7A）。氫醌是抗氧化劑，但是其本身具有光敏性，當(dāng)處于變黃期至定色期的煙葉從烤房中取出時，煙葉表面顏色容易變成深褐色，其原因可能是由于氫醌見光氧化變黑。值得注意的是，類黃酮代謝分支上，山奈酚和芥子酸合成通路上的部分代謝物在烘烤過程中發(fā)生了明顯上調(diào)，這些物質(zhì)的轉(zhuǎn)化對煙葉色澤、香氣和風(fēng)味的形成具有重要作用。在香梨綠原酸合成途徑的研究中，利用不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析，成功鑒定了4 個香梨綠原酸發(fā)育的關(guān)鍵基因[25]?；诒狙芯胯b定的煙葉色澤、香氣和風(fēng)味等關(guān)鍵物質(zhì)的合成通路，利用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析挖掘通路中的關(guān)鍵基因，可為將來的品種改良提供基因資源。

綜上，本研究基于靶向代謝組學(xué)解析了烘烤過程中不同溫度節(jié)點的煙葉代謝組差異，共鑒定出1069種代謝物，其中多酚類物質(zhì)為374 個，達(dá)總數(shù)的34.99%。烘烤過程中變黃期至定色初期是多酚類差異代謝物含量變化的主要時期，差異代謝物富集在氫醌、綠原酸、山奈酚和芥子酸等與煙葉風(fēng)味和品質(zhì)相關(guān)物質(zhì)的生物合成途徑中。本研究結(jié)果為煙草品質(zhì)形成的代謝物質(zhì)基礎(chǔ)剖析提供了信息，為煙葉棕色化反應(yīng)調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。