紀(jì)偉，蘇文英，劉曉梅，王一璞，任立凱，奚小艷，陳克龍

（1連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇連云港 222000；2青海師范大學(xué)，西寧 810000）

0 引言

靈芝(Ganodermalingzhi)在中國有著悠久的食藥用歷史，屬于大型可食用真菌[1]，近年來，靈芝產(chǎn)業(yè)在中國鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮著重要的作用，靈芝產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展也將有力助推“健康中國”戰(zhàn)略的實(shí)施。研究表明，靈芝含有豐富的藥理成分，主要包括靈芝多糖、多糖肽、三萜、甾醇、生物堿和核苷等[2-4]，在鎮(zhèn)痛、解毒、降血糖、抗輻射、提高免疫力、治療哮喘和抗腫瘤等方面有著極高的藥用價(jià)值[5-7]。靈芝還擁有極高的文化觀賞價(jià)值[8]，自古被視為吉祥、富貴之物，靈芝造型各異，可塑性強(qiáng)，在生長期通過控制光照方向、空氣濕度等環(huán)境因素，可將之培育成外形美觀的觀賞植物[9]。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeats)標(biāo)記技術(shù)最早創(chuàng)建于20世紀(jì)90年代，其原理是根據(jù)基因組中存在著廣泛的微衛(wèi)星序列，通過設(shè)計(jì)的通用引物對基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從而檢測基因組中微衛(wèi)星序列的變異，該技術(shù)具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，常被應(yīng)用在生物種質(zhì)資源、遺傳多樣性、居群遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究[10-12]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在食用菌的聚類分析方面已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，陳小敏等[13]發(fā)現(xiàn)野生靈芝菌株的ISSR電泳圖譜具有明顯的差異性，聚類分析顯示出相似系數(shù)小于0.52時(shí)，供試菌株聚為一類，相似系數(shù)為0.54 時(shí)，聚類成兩大類群，說明供試12 株靈芝菌株間表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性；肖自添等[14]應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對24個(gè)靈芝菌株進(jìn)行了遺傳多樣性研究，從43 個(gè)引物中選出10 個(gè)ISSR 引物擴(kuò)增得到110 個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，大小分布在500～2000 bp，并利用NTSYS.PC2.0分析軟件對這些供試菌株的遺傳差異性進(jìn)行聚類分析，研究結(jié)果表明相似水平在71%左右時(shí)24個(gè)菌株分為4 個(gè)組群。陸歡等[15]經(jīng)非加權(quán)算數(shù)平均配對法(Unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA)聚類分析，24 個(gè)金頂側(cè)耳菌株被分為7 個(gè)大類，并發(fā)現(xiàn)野生和栽培菌株聚類均比較集中。

目前靈芝的ISSR 遺傳多樣性分析主要集中在通過遺傳相似系數(shù)對所研究區(qū)域靈芝進(jìn)行分類，而有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei's遺傳多樣性(He)和Shannon信息指數(shù)(I)等指標(biāo)還未見有公開報(bào)道，連云港地區(qū)野生靈芝資源豐富[16]，但研究甚少。本研究以連云港地區(qū)采集的15 株野生靈芝為研究材料，通過ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei's 遺傳多樣性(He)和Shannon 信息指數(shù)(I)等指標(biāo)，并根據(jù)ISSR 分子標(biāo)記的遺傳聚類圖進(jìn)行分類，確定連云港地區(qū)野生靈芝種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為靈芝資源保護(hù)和品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 野生靈芝采集

本項(xiàng)目組于2022年6月至2022年9月在連云港市范圍內(nèi)采集獲得野生靈芝標(biāo)本，根據(jù)形態(tài)特征和生境特點(diǎn)選取具有代表性的標(biāo)本15個(gè)，野生靈芝標(biāo)本信息如表1所示。將采集的野生靈芝進(jìn)行組織分離得到菌株，保存于連云港市農(nóng)科院食用菌菌種庫。

表1 野生靈芝標(biāo)本信息

1.2 靈芝菌株基因組提取及ISSR-PCR擴(kuò)增

采用真菌基因組DNA 快速提取試劑盒提取基因組DNA，試劑盒為生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，退火溫度根據(jù)各引物梯度試驗(yàn)篩選出的最佳退火溫度（UBC807 為48℃、UBC809 為45℃、UBC811 為51℃、UBC836 為54℃、UBC840 為42℃、UBC841 為48℃、UBC842 為42℃、UBC880 為45℃、UBC881 為48℃和UBC888 為42℃），退火30 s，72℃延伸2 min，45 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

采用Photoshop 軟件處理圖片，利用DPS 軟件繪制遺傳關(guān)系聚類圖，采用Popgen 32軟件計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)，ISSR-PCR電泳圖，以Marker 2000作為參考。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

選取10 條ISSR 引物，引物編號分別為UBC807、UBC809、UBC811、UBC836、UBC840、UBC841、UBC842、UBC880、UBC881和UBC888，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。對上述合成的10 條ISSR 引物的退火溫度開展梯度試驗(yàn)，經(jīng)PCR 擴(kuò)增，篩選出擴(kuò)增條帶清晰明亮對應(yīng)的退火溫度，即為最佳退火溫度，如表2所示。篩選出多態(tài)性好的ISSR引物一條，為引物UBC888，如圖1所示，電泳圖清晰明亮。

表2 10條ISSR引物及退火溫度

2.2 基于ISSR 分子標(biāo)記的連云港野生靈芝遺傳多樣性分析

通過選取的10 條引物對15 株野生靈芝進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出40條多態(tài)性條帶，如表3所示，條帶大小在250～2000 bp 之間；平均等位基因位點(diǎn)1.8 個(gè)，平均有效等位基因數(shù)1.2454，平均Nei's 遺傳多樣性0.1742，平均Shannon 信息指數(shù)0.2925；有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍為1.0000～1.6423，其中引物UBC807 和UBC842 對應(yīng)的Ne最高，引物UBC841 對應(yīng)的Ne最低；Nei's 遺傳多樣性(He)的變化范圍為0.1031～0.3911，其中引物UBC807 和UBC842 對應(yīng)的He最高，引物UBC841 和UBC881 對對應(yīng)的He最低；Shannon 信息指數(shù)(I)的變化范圍為0.2235～0.5799，其中引物UBC807 和UBC842 對應(yīng)的I最高，引物UBC841對應(yīng)的I最低。

表3 基于10條ISSR引物標(biāo)記的靈芝遺傳多樣性數(shù)據(jù)

2.3 連云港野生靈芝聚類分析

基于遺傳關(guān)系聚類圖，如圖2 所示，相似系數(shù)為0.63時(shí)，將15株野生靈芝分為4組，第1組有3株靈芝，分別為靈芝GL01、GL10 和GL03，其中靈芝GL01 和GL10距離更近；第2組有4株靈芝，分別為靈芝GL02、GL06、GL11 和GL12，其中靈芝GL06、GL11 和GL12距離較近；第3 組有7 株靈芝，分別為靈芝GL04、GL05、GL15、GL13、GL14、GL07 和GL09，其中靈芝GL04、GL05 和GL15 距離較近，靈芝GL13 和GL14 距離較近，靈芝GL07和GL09距離較近；第4組有1株靈芝，為靈芝GL08。

圖2 基于ISSR分子標(biāo)記的靈芝遺傳關(guān)系聚類圖

本研究采集的野生靈芝生境植被為麻櫟、板栗等闊葉樹種，如圖3所示，其中GL02為白肉靈芝，雖然上述將靈芝GL02、GL06、GL11 和GL12 聚為一類，但靈芝GL02 與其他3 株靈芝距離更遠(yuǎn)，靈芝GL06、GL11和GL12 三個(gè)靈芝均處于子實(shí)體的幼嫩階段，其子實(shí)體外觀都比較規(guī)則，邊緣均呈現(xiàn)淡黃色至黃色，符合形態(tài)學(xué)特征；靈芝GL04、GL05、GL15、GL13、GL14、GL07 和GL09，該組靈芝的特點(diǎn)非常明顯，都具有菌柄，菌蓋顏色均為紅褐色，是典型的赤芝，上述聚類分析也分別將其聚為一組；GL08 為典型的樹舌靈芝，上述將靈芝GL08單獨(dú)聚為一組，符合形態(tài)學(xué)特征；上述聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)特征分類結(jié)果相近，說明上述聚類結(jié)果具有很高的可信度。

圖3 野生靈芝子實(shí)體

2.4 連云港野生靈芝遺傳相似系數(shù)分析

15株野生靈芝的遺傳相似系數(shù)，如表4所示，相似系數(shù)在0.415～0.866 之間，平均相似系數(shù)為0.624，有7.62%的菌株間相似系數(shù)大于0.8，有19.05%的菌株間相似系數(shù)介于0.7～0.8之間，有73.33%的菌株間相似系數(shù)小于0.7，說明菌株間遺傳差異較大，親緣關(guān)系最近的為菌株GL13 和GL14，相似系數(shù)為0.866，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的為菌株GL06和GL08，相似系數(shù)為0.415。

表4 靈芝的遺傳相似系數(shù)

3 討論

3.1 ISSR引物最佳退火溫度

野生靈芝因所處的生境、溫度、濕度和基質(zhì)養(yǎng)分等自然因素差異的影響，其子實(shí)體外觀形態(tài)差異較大，僅僅從外觀形態(tài)對靈芝進(jìn)行分類，并不能科學(xué)準(zhǔn)確的反映其遺傳距離[17]。ISSR 分子標(biāo)記可以從DNA 分子水平上來檢測基因組DNA的多態(tài)性，不受繁育階段的氣候環(huán)境因素影響，可快速、準(zhǔn)確和穩(wěn)定的將菌株進(jìn)行分類[14]。本研究使用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對連云港地區(qū)15 株野生靈芝的遺傳多樣性進(jìn)行分析。首先對篩選的10 條ISSR 引物最佳退火溫度進(jìn)行梯度篩選試驗(yàn)，在PCR試驗(yàn)中，引物的退火溫度過低或過高都會影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，溫度過低會導(dǎo)致特異性擴(kuò)增條帶增多，而溫度過高，則會抑制引物與DNA的結(jié)合，擴(kuò)增出的條帶會出現(xiàn)彌散情況，本研究經(jīng)梯度試驗(yàn)最終篩選到各引物的最佳退火溫度，UBC807 為48℃、UBC809 為45℃、UBC811 為51℃、UBC836 為54℃、UBC840 為42℃、UBC841 為48℃、UBC842 為42℃、UBC880 為45℃、UBC881 為48℃和UBC888 為42℃，篩選出多態(tài)性好的引物一條，為UBC888。

3.2 野生靈芝之間遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析

本研究使用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)從15株野生靈芝中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶40 條，片段大小在250～2000 bp之間，這與肖自添等[14]研究結(jié)果較為相近，平均等位基因位點(diǎn)1.8 個(gè)，平均有效等位基因數(shù)1.2454，平均Nei's遺傳多樣性0.1742，平均Shannon 信息指數(shù)0.2925，有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍為1.0000～1.6423，Nei's遺傳多樣性(He)的變化范圍為0.1031～0.3911，Shannon信息指數(shù)(I)的變化范圍為0.2235～0.5799，從分析結(jié)果看連云港地區(qū)采集的這15 株野生靈芝存在著一定的遺傳差異，具有很好的遺傳多樣性。

根據(jù)ISSR 分子標(biāo)記的遺傳聚類圖可有效進(jìn)行分類，劉小英等[18]使用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對20份龍眼材料進(jìn)行分析，在遺傳相似系數(shù)0.734 0時(shí)，可將20份龍眼材料分4 類；裴云霞等[19]使用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對楓香進(jìn)行分析，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.94時(shí)，可將7個(gè)群體分為4個(gè)大類。本研究的15株靈芝相似系數(shù)范圍在0.415～0.866 之間，相似系數(shù)為0.63 時(shí)，可以將15 株野生靈芝分為四組，這與張彬彬等[20]對30株野生靈芝的分類結(jié)果相近，該分類和野生靈芝的外觀形態(tài)有一定的對應(yīng)關(guān)系，第1 組有3 株靈芝，分別為靈芝GL01、GL10 和GL03，該組靈芝中GL01 和GL03 均為子實(shí)體的幼嫩階段，菌蓋均呈紅褐色，邊緣肥厚呈淡黃色，都有輪紋，非常接近，而與GL10 外觀差異較大，這可能因GL10受外界因素影響和生理階段已經(jīng)處于老化階段所致；第2 組有4 株靈芝，分別為靈芝GL02、GL06、GL11 和GL12，其中靈芝GL06、GL11 和GL12 距離較近，GL02 為白肉靈芝，外觀形態(tài)明顯區(qū)別與其他3 株靈芝，這與聚類分析中GL02與其他3株靈芝遺傳距離更遠(yuǎn)的結(jié)果對應(yīng)，而GL06、GL11 和GL12 三個(gè)靈芝菌株均處于幼嫩發(fā)育階段，其子實(shí)體外觀都比較規(guī)則，邊緣均呈現(xiàn)淡黃色至黃色；第3組有7株靈芝，分別為靈芝GL04、GL05、GL15、GL13、GL14、GL07 和GL09，該組靈芝的特點(diǎn)非常明顯，都具有菌柄，菌蓋顏色均為紅褐色，是典型的赤芝；第4組有1株靈芝，為靈芝GL08，是典型的樹舌靈芝。上述聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)特征分類結(jié)果基本一致，說明上述聚類結(jié)果具有很高的可信度。

4 結(jié)論

本研究采用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對連云港地區(qū)的15株野生靈芝進(jìn)行分析，并構(gòu)建聚類圖譜。15株野生靈芝中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶為40 條，片段大小在250～2000 bp之間，平均等位基因位點(diǎn)1.8個(gè)，平均有效等位基因數(shù)1.2454，平均Nei's 遺傳多樣性0.1742，平均Shannon信息指數(shù)0.2925，有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍為1.0000～1.6423，Nei's 遺傳多樣性(He)的變化范圍為0.1031～0.3911，Shannon 信息指數(shù)(I)的變化范圍為0.2235～0.5799，根據(jù)ISSR 分子標(biāo)記的遺傳聚類圖，15株靈芝相似系數(shù)范圍在0.415～0.866之間，相似系數(shù)為0.63時(shí)，可以將15株野生靈芝分為4組，聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)特征結(jié)果基本一致。

ISSR 分子標(biāo)記用于遺傳多樣性分析有著操作簡單、快速和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但在PCR 擴(kuò)增時(shí)需要一定的時(shí)間摸索最適反應(yīng)條件，對于顯性遺傳標(biāo)記，將無法區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型[21]，作者認(rèn)為本研究仍需進(jìn)一步深化，擴(kuò)大樣品量，選取更多類型的野生靈芝材料，并結(jié)合全基因組重測序進(jìn)行分析，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，更好為連云港地區(qū)靈芝資源分類、保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)制提供優(yōu)質(zhì)材料。