楊敏，周陳平，李慶萌，鄺瑞彬，吳夏明，魏岳榮

（廣東省農業(yè)科學院果樹研究所/農業(yè)農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

番木瓜(CaricapapayaL.)是世界上種植和消費最廣的熱帶水果之一，也是中國嶺南特色水果，具有很高的營養(yǎng)和藥用價值，被世界衛(wèi)生組織列為最有價值的十大水果之首，有“百益果王”之美譽[1-3]。據《OECDFAO農業(yè)展望報告2020—2029》預測，在未來十年內，世界番木瓜產量將以每年2.1%的速度增長，到2029年可達1660萬t，發(fā)展前景廣闊。然而，番木瓜屬于典型的呼吸躍變型果實，采后常溫貯藏2～4 d，即可迅速達到生理成熟，之后果實腐爛，嚴重影響果實品質和貨架期[4-7]。番木瓜采后貯藏已成為影響番木瓜產業(yè)發(fā)展的重要因素。針對這一問題，人們開發(fā)出很多理化技術以延長番木瓜貯藏時間。物理保鮮技術主要包括：熱處理[8-10]、低溫保鮮[8,11]、輻射處理[12-14]和氣調保鮮技術[15-16]。化學保鮮技術主要包括：1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理[17-18]、涂膜保鮮[19-22]、熏蒸保鮮[23-24]、鈣處理[25]、植物生長調節(jié)劑處理[26-27]和防腐殺菌劑處理[28]技術。鑒于番木瓜是典型的呼吸躍變型水果，具有成熟過程伴隨乙烯產生高峰，果實硬度急劇下降，從而使果實成熟[29]的特點，1-MCP 作為一種新型的高效乙烯抑制劑而備受關注。1-MCP可通過阻礙乙烯與受體結合，抑制果實生理生化反應，從而達到延緩果實成熟衰老的目的。但長期施用1-MCP 或處理不當可導致番木瓜果實成熟障礙，即果實雖能正常黃變，但不能正常軟化，出現果實橡膠化、可食性差等弊端[18,30-31]。因此，產業(yè)急需自然延長貯藏時間的新品種/系。通常，在果實成熟過程中伴隨著果實硬度的降低，而果實硬度與果實開裂、失水和病害防御密切相關，對果實的運輸性、貯藏性和貨架期有著重要影響[32]，通常果實硬度較高的品種會有更長的貯藏期。且已有研究表明果實硬度與乙烯信號途徑中的乙烯響應因子(ERF)和轉錄因子(ETN3)密切相關[32-35]。因此，以延長采后貯藏時間為目標，利用現有番木瓜資源選育硬度高且品質優(yōu)良的番木瓜品種，并進行相關的機理研究具有重要意義。本團隊前期利用‘泰國紅’和‘GZ201301301’番木瓜為親本進行雜交，在F1代中篩選到‘黃花佑’和‘金錘’兩個優(yōu)系，兩者在果實硬度上差異顯著。為理清2 個遺傳背景完全一致的番木瓜優(yōu)系果實硬度差異的原因、果實硬度對番木瓜貯藏是否存在正面影響等科學問題，本研究對‘黃花佑’和‘金錘’采后果實進行了貯藏試驗，測定、統計和分析了2個優(yōu)系在貯藏期的果實失水率、可溶性固形物含量、果實硬度、乙烯含量等指標，并對2個優(yōu)系不同貯藏期的果實材料進行轉錄組測序和分析，初步明確了‘黃花佑’和‘金錘’果實硬度差異形成的原因及果實硬度對采后貯藏時間的影響，為番木瓜采后貯藏、品種選育和品質調控提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜為廣東省農業(yè)科學院果樹研究所以‘泰國紅’和‘GZ201301301’為親本，通過雜交育種獲得的兩個F1代優(yōu)系，‘黃花佑’和‘金錘’都已申報國家植物新品種權，申請?zhí)柗謩e為：20211000173，20221007022?！S花佑’具有品質優(yōu)、豐產的特性，‘金錘’則具有果形好、硬度高、耐貯運的特性，兩者在采后果實硬度上差異顯著。‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜果實于商業(yè)成熟度（‘三線黃’）時采自廣東省廣州市白云區(qū)人和實驗基地，隨即運回廣東省農業(yè)科學院果樹研究所，用75%乙醇清洗，之后用ddH2O沖洗干凈，晾干后置于25℃室內貯藏，并用于后續(xù)實驗。

1.2 方法

1.2.1 果實硬度測試使用艾德堡數顯水果硬度計GY-4。從2個優(yōu)系中，分別挑選15個完好無損傷的果實進行編號，之后在不同貯藏時間測定果實硬度，實驗重復3次。

1.2.2 果實失水率測定采用稱重法。從2 個優(yōu)系中，分別挑選15個完好無損傷的果實進行編號，之后稱首重，在采后第1、4、7、10、12 d分別再次稱重，實驗重復3次。失水率的計算見公式(1)。

1.2.3 果實可溶性固形物含量測定使用日本ATAGO PAL-1 數顯糖度計測定。每次測定10 個成熟度一致的果實，實驗重復3次。

1.2.4 乙烯含量測定采用便攜式乙烯氣體分析儀-F-900測定。每個優(yōu)系每次取30個果實測定，實驗重復3次。計算見公式(2)。

1.2.5 石蠟切片制備和觀察取采后0、4、7、10 d的2個優(yōu)系果實，切取果實赤道部橫切面，用FAA 固定液固定。石蠟切片樣品制備及觀察參考梁社堅等[36]的方法進行。

1.2.6 乙烯利處理于商業(yè)熟度‘三線黃’時采摘‘金錘’果實，用75%乙醇清洗，之后用ddH2O沖洗干凈，晾干；配置乙烯利溶液，將果實浸泡3 min后取出，放入袋子中密封24 h后取出，室溫保存，之后觀察和統計果實軟化情況。對照果實不用乙烯利浸泡，每個處理選取10個果實，實驗重復3次。

1.3 轉錄組測序與分析

以采后0、4、7、10 d的‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜果實為材料，委托美吉生物科技有限公司進行高通量轉錄組測序，測序平臺為Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000，每個樣品設置3 個重復。測序所得數據經質控后，使用Tophat2 軟件，與番木瓜參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Carica papaya)進行比對分析。以|log2 fold change|≧1、p-adjust<0.05為標準篩選差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)。對獲得的差異基因分別用Goatools(https://github.com/tanghaibao/Goatools) 和 KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do) (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)進行KEGG富集通路分析，富集通路選擇前20條進行展示。

1.4 乙烯途徑相關基因定量分析

使用與轉錄組實驗相同的RNA，利用DNase I 去除基因組DNA，根據試劑盒說明，用反轉錄酶將1 μg RNA 反轉錄成cDNA。以cDNA 為模板，用Applied Biosystems 7500 實時定量PCR 儀進行qRT-PCR 試驗。以真核翻譯起始因子4A(EIF4A)為內參基因，對3個乙烯合成及信號相關的基因（CpACO、CpCTR1和CpETR1）進行qRT-PCR檢測。利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1）。實驗重復3次，利用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

表1 實驗所用引物

1.5 數據分析與圖像處理

利用Excel 2007 軟件對實驗數據進行統計分析，利用Photoshop CS2軟件進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 ‘金錘’和‘黃花佑’番木瓜貯藏過程中的果實形態(tài)及內部結構變化

貯藏過程中，兩個番木瓜優(yōu)系在果實外觀形態(tài)和內部結構上都發(fā)生了一系列的變化。在剛采收時，‘黃花佑’和‘金錘’果實顏色較青、硬度較大，不適合食用（圖1-A，表2）。隨著貯藏時間的延長，到第4天時，果實轉色，在貯藏第7 天時，‘黃花佑’果實幾乎全部轉黃，‘金錘’果實大部分轉黃，到貯藏第10 天時，‘黃花佑’果實全部轉黃且顏色加深，開始出現皺縮，而‘金錘’表面仍然光滑，到貯藏第12 天時，相較‘金錘’，‘黃花佑’出現明顯皺縮（圖1-A）。失水率實驗結果顯示‘黃花佑’失水率比‘金錘’高，尤其在第7、10、12天更為明顯（圖1-B），與圖1-A 結果一致。從果肉切片結構來看，在采后的0和第4天，‘黃花佑’和‘金錘’的果肉細胞排列緊密，大小均勻，在第7 天時，‘黃花佑’果肉細胞開始膨大，果實已經變軟，而‘金錘’果肉細胞依然比較緊密，到第10 天時，‘黃花佑’果肉細胞破損，而‘金錘’果肉細胞依然完好（圖1-C）。

圖1 兩個番木瓜優(yōu)系貯藏期間果實形態(tài)(A)、失水率(B)及內部結構的變化(C)

表2 ‘金錘’和‘黃花佑’貯藏期間的果實硬度和可溶性固形物含量比較

綜上，在采后貯藏尤其是貯藏后期，‘黃花佑’失水率高于‘金錘’番木瓜，出現皺皮的時間也比‘金錘’早，且‘金錘’的果肉細胞結構在貯藏后期比‘黃花佑’致密。說明番木瓜果實硬度與果肉細胞結構密切相關。

2.2 ‘金錘’和‘黃花佑’貯藏過程中的果實硬度及品質變化

在整個貯藏過程中，‘金錘’和‘黃花佑’果實的硬度是持續(xù)下降的。但相較‘黃花佑’，‘金錘’在采后始終保持較高的硬度。結果如表2所示，‘金錘’和‘黃花佑’剛采摘下來時的硬度基本一致，約為41 N，果實硬度大，沒有測定可溶性固形物含量。在貯藏第4天時，‘金錘’硬度為34.03 N，而‘黃花佑’硬度僅有其一半，為15.54 N，此時‘金錘’的可溶性固形物含量為9.35%，而‘黃花佑’的可溶性固形物含量達到12.10%，‘黃花佑’處于食用較佳時期。在貯藏第7天時，‘金錘’硬度為22.89 N，可溶性固形物含量為11.70%，而‘黃花佑’此時硬度為9.21 N，果實處于較軟狀態(tài)，可溶性固形物含量為12.80%，‘黃花佑’仍然處于較好的食用時期。到貯藏第10天時，‘金錘’硬度為16.13 N，可溶性固形物含量隨著果實變軟增加到12.14%，比較適合食用。而‘黃花佑’此時硬度只有3.26 N，可溶性固形物只有10.55%，果實過熟，已不太適合食用。到貯藏第12天時，‘金錘’硬度為10.03 N，可溶性固形物含量增加到12.15%，適合食用。而‘黃花佑’此時硬度只有2.12 N，可溶性固形物含量只有9.86%，過熟不適合食用。這一結果與果肉切片觀察到的果實細胞結構變化結果是一致的（圖1-C）。綜上，‘金錘’在采后貯藏12 d內的任何時間點硬度都比‘黃花佑’高，分別高出2～5倍，在采后貯藏時間上有明顯優(yōu)勢。

同時，由表2可知，‘黃花佑’果實可溶性固形物在采后第4天即達到較高水平，在貯藏第7天達到峰值，而‘金錘’果實可溶性固形物在采后第10～12天達到峰值，且兩者的可溶性固形物含量都能達到12.0%以上，因此本研究認為‘金錘’和‘黃花佑’都具有較好的果實品質。

2.3 不同貯藏時期番木瓜果實的轉錄組測序分析

根據‘金錘’和‘黃花佑’采后果實貯藏特點，本研究在‘金錘’和‘黃花佑’采后貯藏0、4、7、10 d果實的相同部位取樣進行轉錄組測序，測序數據經過濾后得到162.25 G 的純凈數據，各樣品Clean Data 均達到6.01 Gb 以上，Q30 堿基百分比在92.58%以上，數據質量符合轉錄組分析的基本要求。通過分析，發(fā)現‘金錘’和‘黃花佑’相比，在采后0 d時，共有4163個差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，其中1518 個上調表達，2645 個下調表達，在采后貯藏4 d 時，共有4977 個DEGs，其中2026 個上調表達，2951 個下調表達，在貯藏7 d時，共有2896個DEGs，其中925個上調表達，1971 個下調表達，在貯藏10 d 時，共有5795 個DEGs，其中3021個上調表達，2774個下調表達（表3）。

進一步對DEGs進行KEGG通路分析，結果顯示，‘金錘’和‘黃花佑’果實的大量差異表達基因在植物激素信號轉導途徑顯著富集，尤其是在貯藏的第4天（圖2）。乙烯是植物中最重要的激素之一，它推動果實成熟，因此，應重點關注和分析乙烯信號途徑。分析結果如圖3所示：在貯藏0 d時，相較‘金錘’，‘黃花佑’中協同負調控乙烯反應的乙烯受體基因ETR(Ethylene receptor)和蛋白激酶基因CTR1(Constitutive triple response 1)的表達量要低，在貯藏第4 天時，除ETR和CTR1基因外，‘黃花佑’中負調控乙烯下游途徑關鍵因子EIN3(Ethylene insensitive 3) 穩(wěn)定性的EBF1/2(EIN3-binding F box protein 1/2)基因的表達量也比‘金錘’低，而‘黃花佑’中乙烯響應因子ERF/2的表達量高于‘金錘’，暗示‘黃花佑’在貯藏4 d時可能已經啟動了乙烯反應，而‘金錘’中的乙烯信號被抑制。當貯藏時間為7 d時，‘黃花佑’中ETR基因的表達依然低于‘金錘’，而ERF2的表達量高于‘金錘’，乙烯信號依然處于激活狀態(tài)。這一結果與‘黃花佑’果實硬度和可食用時間在貯藏的第4～7天是一致的。而當貯藏時間延長到10 d時，相較‘黃花佑’，‘金錘’中的ETR和CTR1表達量變低，EBF1/2表達量升高，乙烯信號下游基因ERF1/2表達量上調，暗示此時‘金錘’的乙烯信號通路打開，果實成熟，這與‘金錘’硬度和最佳食用時間在貯藏第10～12天也是相符的（圖3）。

圖2 ‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜采后貯藏4 d時果實差異表達基因的KEGG富集分析

圖3 ‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜采后果實乙烯信號途徑相關基因的表達差異

同時，本研究對‘黃花佑’和‘金錘’中與乙烯合成及信號途徑相關的關鍵基因進行聚類熱圖分析，結果如圖4 所示，‘黃花佑’和‘金錘’在不同貯藏時間點的ETR1、CTR1、EBF1/2和ERF2表達情況與KEGG 分析結果完全一致。已有研究表明：番木瓜果實成熟時，乙烯合成關鍵基因1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)合酶ACS1基因和ACC氧化酶ACO1基因表達上調，觸發(fā)乙烯生物合成，乙烯爆發(fā)發(fā)生在收獲后的3～4 d，并誘導果膠酶表達[7]。因此，本研究也對‘黃花佑’和‘金錘’果實中的ACO和ACS進行了聚類熱圖分析，結果顯示其中一個ACO基因(gene 4917)在‘黃花佑’貯藏第4天時高表達，之后下降，而該基因在‘金錘’貯藏第7天時才高表達，之后下降。另一個ACO1(gene 19882)基因在‘黃花佑’貯藏第4天時高表達，之后下降，在‘金錘’貯藏的第4 天該基因的表達量也升高，但是表達強度低于‘黃花佑’。ACS基因在‘黃花佑’貯藏的0 d 時就高表達，之后下降，而‘金錘’在貯藏的第10 天該基因才高表達。以上結果暗示‘黃花佑’番木瓜采后果實乙烯的合成早于‘金錘’，呼吸躍變及信號的啟動也早于‘金錘’，這可能是兩者硬度、貯藏時間差異的主要原因。

圖4 ‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜采后果實乙烯合成及信號途徑差異表達基因的聚類熱圖分析

2.4 ‘黃花佑’和‘金錘’中乙烯信號途徑關鍵基因的表達情況及乙烯含量的測定分析

為了驗證轉錄組數據的可靠性，本研究利用qRTPCR 檢測了乙烯合成和信號途徑中的3 個關鍵基因，ACO1、CTR1和ETR1在兩個番木瓜優(yōu)系貯藏期間的表達量變化（圖5），結果與轉錄組結果（圖3、圖4）一致，說明轉錄組結果是可靠的，同時也說明‘金錘’番木瓜乙烯合成及信號啟動的時間要比‘黃花佑’晚。

圖5 qRT-PCR檢測乙烯合成和信號途徑3個關鍵基因在‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜中的表達情況

為了進一步確定以上結果，對采后不同貯藏時間點的‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜進行了乙烯含量測定，結果如圖6所示，‘黃花佑’在采后貯藏第4天時乙烯釋放量達到峰值，之后開始迅速下降；而‘金錘’在采后貯藏第8天時乙烯釋放量達到峰值，第10天略有下降，但仍然保持較高水平。這一結果與筆者檢測的乙烯相關基因的表達模式基本一致。

2.5 乙烯對‘金錘’番木瓜果實硬度的影響

為了進一步明確乙烯的釋放影響了‘金錘’的果實硬度和貯藏時間，對采后‘金錘’果實進行乙烯利處理，結果發(fā)現乙烯利處理4 d時，‘金錘’果實硬度可由剛采摘下時的40.34 N 降低到11.32 N，此時‘金錘’的可溶性固形物含量也有10.80，而未經乙烯處理的‘金錘’此時硬度為36.18 N（圖7，表2）。這一結果表明，人為添加乙烯利可以顯著降低‘金錘’的果實硬度，促進其成熟達到可食程度。

圖7 乙烯利處理對‘金錘’果實硬度的影響

3 討論

果實硬度在果實開裂、失水和病害中起著重要作用，對果實的運輸性、貯藏性和貨架期有著強烈的影響[32]。通常果實硬度較高的品種會有更長的貯藏期。本團隊前期通過雜交育種，選育出2 個品質較好的番木瓜優(yōu)系：‘黃花佑’和‘金錘’。值得一提的是，‘金錘’在采后成熟過程中硬度較大、貯藏期長，是實現番木瓜長距離運輸的潛力品種。

明確同一遺傳背景下兩個番木瓜優(yōu)系果實硬度差異的原因，可為其在生產上更好的應用提供數據支持。因此，本研究對‘黃花佑’和‘金錘’貯藏期的品質、貯藏特性和轉錄組測序數據分別進行了觀察、統計和分析。結果發(fā)現，在采后貯藏尤其是貯藏后期，‘黃花佑’失水率高于‘金錘’，出現皺皮的時間也比‘金錘’早?！疱N’番木瓜果肉細胞比‘黃花佑’更加致密。之前有研究利用2 個不同硬度的蘋果品種，進行果皮電鏡結構掃描分析，發(fā)現細胞結構規(guī)則、排列致密、完整性好的品種，果實硬度更高[37]。另外也有研究用采后緩慢軟化和快速軟化的蘋果品種進行果肉細胞電鏡掃描分析，也得到類似結果[38]。本研究與前人的這兩個研究結果一致，同時也說明番木瓜果實硬度與果肉細胞結構密切相關。

‘黃花佑’和‘金錘’采后果實轉錄組數據分析顯示，2 個優(yōu)系在乙烯信號途徑存在明顯差異。乙烯是植物中最重要的激素之一，它推動果實成熟。呼吸躍變型果實的成熟過程伴隨著乙烯峰值的生成，從而導致果實硬度降低，果實軟化成熟[29]。已有研究表明果實硬度與乙烯信號途徑中的乙烯響應因子(ERF1)和轉錄因子(ETN3)密切相關[32-35]。番木瓜作為一種典型的呼吸躍變型水果，它快速成熟也是由乙烯生物合成觸發(fā)的。有研究表明，番木瓜果實成熟時，乙烯合成關鍵基因ACS1和ACO1表達上調，觸發(fā)乙烯生物合成。乙烯爆發(fā)發(fā)生在收獲后3～4 d，并誘導果膠酶表達[7]。本研究利用聚類熱圖分析了ACO基因的表達情況，發(fā)現‘黃花佑’中ACO表達的峰值出現在采后貯藏第4 天，且此時的‘黃花佑’果實也達到了可食程度，與前人的研究結果一致。而在果實軟化緩慢的‘金錘’番木瓜中，ACO基因的表達峰值在貯藏后第7天，說明‘金錘’乙烯釋放的峰值要晚于‘黃花佑’，呼吸躍變的時間也相應的推遲。而ACS基因在‘黃花佑’貯藏的0 d 就高表達，之后下降，而在‘金錘’貯藏的第10 天才高表達，雖然這與之前報道的乙烯爆發(fā)發(fā)生在收獲后3～4 d 不一致，但這可能與番木瓜品種、采收時的成熟度、貯藏條件等因素差異有關。同時，從表達模式上看，‘金錘’ACS基因高表達的時間晚于‘黃花佑’，乙烯達到峰值的時間也就晚于‘黃花佑’，這與‘黃花佑’成熟快，‘金錘’軟化慢也是相吻合的。另外，本研究還利用qRT-PCR 檢測了乙烯途徑中另外兩個重要的負調控因子CTR1和ETR1基因的表達情況，結果顯示在采后貯藏4 d時，‘黃花佑’中這兩個基因的表達量要低于‘金錘’，說明‘黃花佑’中此時可能已啟動乙烯反應。進一步的乙烯含量檢測結果也顯示‘金錘’番木瓜采后果實乙烯釋放量達到峰值的時間比‘黃花佑’延后，驗證了上述結果。綜上結果表明：‘金錘’果實硬度高，軟化慢的原因與乙烯信號途徑直接相關。

同時，為了驗證上述結果，本研究利用乙烯利處理‘金錘’采后果實，處理4 d后，‘金錘’的果實軟化，可溶性固形物含量升高，達到可食狀態(tài)，說明‘金錘’的果實硬度直接與乙烯相關。綜合以上結果，筆者認為：‘黃花佑’鮮果宜在采后一周內完成銷售，‘金錘’可延長至12 d 以上。有意思的是，‘金錘’番木瓜可通過施用乙烯利人為控制成熟時間，具有更好的利用價值和市場潛力，同時也可作為品種改良的重要親本資源。在本研究中，使用的貯藏條件為常溫，并沒有設置溫度梯度、濕度等更多的影響因素，后續(xù)將對這些條件進行細化，并明確這些條件對‘黃花佑’和‘金錘’品質和貯藏時間的影響，同時進行更為深入的機理研究，為在生產上更好的利用這些優(yōu)系提供更多的數據支持，為番木瓜采后品質調控、貯藏和保鮮提供新思路。

4 結論

本實驗得出，‘黃花佑’和‘金錘’果實可溶性固形物含量都可以達到12.0以上，兩者均具有較好的果實品質。與‘黃花佑’相比，‘金錘’在貯藏期間果實硬度高、失水率低、果實軟化慢、在使用乙烯利處理后能迅速軟化，且品質基本不變。‘黃花佑’和‘金錘’番木瓜果實硬度的差異與乙烯合成及信號途徑密切相關，‘黃花佑’采后果實乙烯的合成及信號啟動都早于‘金錘’，促使‘黃花佑’果實軟化、成熟?！S花佑’鮮果宜在采后一周內完成銷售，‘金錘’可延長至采后12 d以上。