章恩華, 邱 宏,*

(1)中國科學(xué)院上海藥物研究所, 上海 201203;2)南京中醫(yī)藥大學(xué)新中藥學(xué)院, 南京 210023)

Capecchi等人在上個(gè)世紀(jì)80年代發(fā)展了基于同源修復(fù)的基因打靶技術(shù),用于基因功能的研究,但是該技術(shù)靶向整合效率低、篩選耗時(shí)費(fèi)力、隨機(jī)突變風(fēng)險(xiǎn)高而且應(yīng)用場(chǎng)景受限[1-3]。學(xué)者們嘗試了不同方法改進(jìn)同源重組的效率,但是并未獲得顯著進(jìn)步。歸巢核酸內(nèi)切酶(meganuclease)的功能研究發(fā)現(xiàn),雙鏈DNA切口(double strand breaks,DSBs)的形成可以顯著提高同源重組修復(fù)效率(50～1 000倍)[4, 5]。這一發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了能夠識(shí)別特異性核酸序列的核酸酶嵌合體的開發(fā)和應(yīng)用[6]。鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)是最早被成功應(yīng)用于基因編輯的核酸酶嵌合體[7, 8],隨后轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALENs)也被成功用于基因編輯[9, 10]。它們主要通過構(gòu)建能特異性識(shí)別基因組DNA序列的核酸內(nèi)切酶FokI嵌合體,在特定位置產(chǎn)生DSB,再通過同源重組(homologous recombination,HR)的方式導(dǎo)入外源基因,或者通過非同源末端修復(fù)(non-homologous end joining,NHEJ)連接斷裂的DNA,利用隨機(jī)插入/刪除(insertion &deletion , indel)引起移碼突變敲除靶基因[11]。但具備DNA序列特異性識(shí)別功能的核酸酶嵌合體的篩選耗時(shí)費(fèi)力,而且特異性不夠,容易導(dǎo)致隨機(jī)突變。2012年前后,可以通過互補(bǔ)RNA導(dǎo)向序列實(shí)現(xiàn)基因組幾乎任意位點(diǎn)的切割的簇集有規(guī)律間隔短回文序列-及其相關(guān)蛋白( clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins, CRISPR-Cas ) 系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn),這一技術(shù)規(guī)避了復(fù)雜的核酸酶嵌合體構(gòu)建,不僅實(shí)現(xiàn)了基因的精準(zhǔn)定位,而且顯著降低了設(shè)計(jì)難度和應(yīng)用成本,該發(fā)現(xiàn)被迅速地應(yīng)用于微生物、植物、動(dòng)物及人類基因的編輯[12, 13](Fig.1)。最近報(bào)道了來源于細(xì)菌的水解型內(nèi)切核酶(hydrolitic endonuleolytic ribozyme, HYER),該核酶及其工程化改造產(chǎn)物均可實(shí)現(xiàn)RNA導(dǎo)向的核酸編輯[14]。

Fig.1 Gene editing tools based on programable nucleases ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9 generate DSBs at specific locations in different mechanisms, and then introduce desired gene modification through HDR or insertions/deletions by NHEJ that leads to gene knockout

本文首先簡(jiǎn)要介紹CRISPR-Cas的組成與分類和工作原理,接著總結(jié)了靶向DNA和靶向RNA的各種基于CRISPR-Cas的基因編輯技術(shù)的特點(diǎn)和應(yīng)用。從遞送角度評(píng)估了細(xì)胞外囊泡作為CRISPR-Cas遞送載體用于疾病治療的可能性。最后,總結(jié)了基因編輯技術(shù)在糖生物學(xué)研究中的應(yīng)用。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的組成與分類

CRISPR-Cas作為原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn),并進(jìn)一步被設(shè)計(jì)為強(qiáng)大基因組編輯工具,離不開對(duì)其獨(dú)特系統(tǒng)組成的研究。而依據(jù)其結(jié)構(gòu)不斷完善的分類體系也為其功能的多樣性開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的組成

CRISPR-Cas系統(tǒng)由CRISPR基因序列(CRISPR array)以及Cas基因(CRISPR associated, Cas)兩部分組成,CRISPR基因轉(zhuǎn)錄的RNA識(shí)別和定位外源基因,而Cas基因編碼的Cas蛋白則在RNA的引導(dǎo)下對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定向編輯。

CRISPR基因序列(CRISPR array)主要由前導(dǎo)序列(leader)、重復(fù)序列(repeat)和間隔序列(spacer)組成。前導(dǎo)序列富含AT堿基(A-腺嘌呤,T-胸腺嘧啶),位于CRISPR基因上游,被認(rèn)為是CRISPR序列的啟動(dòng)子;重復(fù)序列為長(zhǎng)度約20～50 個(gè)堿基且包含5～7 bp回文序列,與間隔序列交替排列,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),發(fā)揮穩(wěn)定RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用;間隔序列是細(xì)菌俘獲的外源DNA序列,用于貯存外源入侵信息,當(dāng)外源遺傳物質(zhì)再次入侵時(shí),細(xì)菌CRISPR-Cas系統(tǒng)會(huì)被激活,調(diào)集RNA引導(dǎo)的Cas核酸酶,序列特異性地沉默噬菌體和質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座子。間隔序列的排列順序可以反映細(xì)菌被外源核酸感染時(shí)間的先后,序列越靠近前導(dǎo)序列端(5′端),感染時(shí)間越靠后。

1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的分類

CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,缺乏統(tǒng)一的分類標(biāo)志物,而且各類新的CRISPR類型不斷涌現(xiàn),CRISPR-Cas的分類體系也在不斷地調(diào)整,這給CRISPR-Cas系統(tǒng)的穩(wěn)定分類帶來巨大挑戰(zhàn)[15]。2011年Makarova等人根據(jù)Cas基因的系統(tǒng)進(jìn)化特征、CRISPR 重復(fù)序列的序列信息和組織特征,以及CRISPR-Cas位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行分類[16],經(jīng)過2015年和2020年的2次更新和完善,目前,將CRISPR系統(tǒng)分為2大類、6個(gè)類型以及30多個(gè)亞型[17-18]。在該分類體系中,2類CRISPR的主要區(qū)別在于Cas蛋白組成及效應(yīng)模塊的差異:第1類由多種Cas蛋白共同組成效應(yīng)模塊,其中部分Cas蛋白與crRNA結(jié)合形成編輯復(fù)合物,參與干擾噬菌體或外源質(zhì)粒的入侵,其他的Cas蛋白作為輔助蛋白質(zhì)協(xié)助調(diào)節(jié)免疫過程,包括I型、Ⅲ型和Ⅳ型;第2類效應(yīng)模塊由單一的多結(jié)構(gòu)域Cas蛋白(如Cas9、Cas12、Cas13)組成,包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型。

基于Cas蛋白功能的異同,可以將CRISPR-Cas系統(tǒng)中的Cas分為4大功能模塊:(1)適應(yīng)模塊:主要作用為識(shí)別外源核酸,從中抓取原間隔子序列、將其加工成間隔序列并將間隔序列整合入CRISPR基因序列,主要包括Cas1與Cas2,Cas1-Cas2聚合物幾乎存在于所有亞型中,在II-A型中主要為Csn2蛋白。(2)表達(dá)處理模塊:主要作用為將Pre-crRNA加工處理成crRNA,在第1類中發(fā)揮主要催化作用的是Cas6蛋白,第2類Type II主要由RNase III負(fù)責(zé),在Type V和Type VI中則由效應(yīng)Cas核酸酶中一個(gè)獨(dú)立于基因編輯活性的催化中心負(fù)責(zé)。(3)干擾模塊(效應(yīng)器模塊):負(fù)責(zé)核酸的靶向識(shí)別和切割,第1類由多種Cas蛋白質(zhì)組成,第二類是單一的大蛋白質(zhì)例如Cas9、Cas12和Cas13。(4)信號(hào)傳導(dǎo)或輔助模塊:包括各種功能已知或未知的輔助蛋白質(zhì)。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)工作機(jī)制

CRISPR-Cas系統(tǒng)通過在CRISPR位點(diǎn)的重復(fù)序列之間整合外源核酸片段,從而可以通過CRISPR-Cas系統(tǒng)抵御外源核酸的再次入侵[19]。其發(fā)揮免疫防御作用的機(jī)制主要分為三個(gè)階段:適應(yīng)階段、表達(dá)階段和干擾階段[18, 20-24]。

2.1 適應(yīng)階段

CRISPR-Cas系統(tǒng)加工得到的Cas蛋白復(fù)合物可以識(shí)別一個(gè)獨(dú)特的原間隔序列鄰近基序(protospacer-adjacent Motif,PAM),該序列具有保守性,長(zhǎng)度一般為2～5堿基。在與其相鄰1～4堿基位置為原間隔序列(protospacer),是噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對(duì)應(yīng)的序列。Cas蛋白通過PAM定位識(shí)別并剪切Protospacer,在CRISPR基因序列的5′端重復(fù)序列復(fù)制完成后,將間隔序列DNA插入到CRISPR基因序列的2個(gè)重復(fù)序列之間,使其成為新間隔序列。也有一些CRISPR-Cas系統(tǒng)采用了另一種適應(yīng)機(jī)制,即通過在CRISPR-Cas位點(diǎn)編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄,從RNA中獲得間隔序列。

2.2 表達(dá)階段

CRISPR先被轉(zhuǎn)錄成Pre-crRNA(crRNA成熟過程的中間物)再被多個(gè)Cas蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物或者單一Cas核酸酶不同功能結(jié)構(gòu)域(也有部分為非Cas核糖核酸酶,例如Type Ⅱ中Cas9與RNase Ⅲ共同參與Pre-crRNA的加工)加工處理為成熟crRNA。Type Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)crRNA需先與tracrRNA(反式激活CRISPR相關(guān)RNA)互補(bǔ)結(jié)合,然后被RNase Ⅲ切割,切割后形成tacrRNA和crRNA末端互補(bǔ)結(jié)合的向?qū)NA,向?qū)NA可與Cas9核酸酶HNH結(jié)構(gòu)域結(jié)合,結(jié)合后形成的復(fù)合物遂行核酸靶序列的識(shí)別和切割功能。

2.3 干擾階段

成熟的crRNA與Cas核酸酶形成復(fù)合物,引導(dǎo)Cas核酸酶識(shí)別入侵病毒或者質(zhì)粒中的protospacer,再被Cas蛋白結(jié)構(gòu)域的功能區(qū)裂解和滅活。以TypeⅡ型為例,crRNA與tracrRNA或者sgRNA和Cas9形成的復(fù)合物通過識(shí)別PAM,精準(zhǔn)定位至靶序列,結(jié)合后,靶序列區(qū)域的DNA雙鏈被解開,形成R-Loop。此時(shí),sgRNA與其中一條DNA鏈形成互補(bǔ)鏈,另一條保持游離態(tài)。Cas9蛋白隨后會(huì)精準(zhǔn)地于PAM上游3個(gè)核苷酸的位置切割核酸,形成平末端產(chǎn)物。Cas9蛋白的HNH結(jié)構(gòu)域識(shí)別并切割與sgRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的外源DNA鏈,RuvC結(jié)構(gòu)域識(shí)別并切割不與sgRNA互補(bǔ)配對(duì)的DNA鏈。CRISPR-Cas系統(tǒng)就是利用這樣的DSB修復(fù)機(jī)制沉默外源核酸,使其滅活(Fig.2)。

Fig.2 The adaptive immune response based on the CRISPR-Cas system The CRISPR Cas system first catch, select, obtain, and integrate protospacer sequences from invading gene elements (adaption). When the cells undergo a second invasion, the cells would express the CRISPR-associated RNA (crRNA) (expression) and the Cas protein like Cas9 would be directed to the specific DNA loci to generate a DSB (interference)

3 CRISPR-Cas的工程化改造和應(yīng)用

成熟crRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與tracrRNA形成RNA二元復(fù)合物,該復(fù)合物能夠引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別并切割與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的靶DNA,產(chǎn)生DSB,這一識(shí)別需要靶DNA上含有PAM序列NGG;將crRNA和tracrRNA二元復(fù)合物改造成單鏈RNA,所得單鏈RNA仍具備導(dǎo)向作用,因而這一RNA稱做單鏈導(dǎo)向RNA(single guide RNA, sgRNA)[25]。2013年,基于這一發(fā)現(xiàn),僅需sgRNA和Cas9兩個(gè)元件的新基因編輯系統(tǒng)被成功開發(fā),并被用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯[26-28]。這一基于CRISPR-Cas的第一代基因編輯系統(tǒng)存在脫靶和難遞送等問題,隨后一直朝著小型化、中靶效率高、傷害與脫靶最小化和組織靶向遞送等目標(biāo)進(jìn)行工程化改造,產(chǎn)生了CRISPRi、CRISPRa、堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器等不同工具,不僅提高了基因編輯的精準(zhǔn)度和特異性,同時(shí)也將CRISPR-Cas9的應(yīng)用從基因編輯拓展到了基因表達(dá)調(diào)控、成像和檢測(cè)與表觀遺傳修飾等領(lǐng)域(Fig.3)。

Fig.3 The gene editors based on CRISPR-Cas (A) The CRISPR-Cas9 system introduces indels through DSBs and different cellular DSB repair pathways.(B) CBE and ABE directly generate C-to-T and /or A-to-G transitions without producing DSBs. (C) PE enables insertion, knockout, and substitution of arbitrary small fragments of DNA sequences and significantly reduces off-target rates. (D) The RNA editing system. Cas9 relies on PAMmer for targeted cleavage; the Cas13 system specifically recognizes and targets ssRNAs, and in addition to cleaving paired ssRNAs, it will lead to collateral cleavage on ssRNAs nearby

3.1 基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)錄編輯器

2013年2月斯坦福大學(xué)亓磊團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)化膿鏈球菌Cas9 ( spCas9 ) 的一種缺乏內(nèi)切酶活性的Cas9(dead Cas9, dCas9)在與gRNA共表達(dá)時(shí),產(chǎn)生一種DNA識(shí)別復(fù)合物,該復(fù)合物與DNA靶序列結(jié)合后,可以阻斷RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,干擾轉(zhuǎn)錄延伸,將Cas9從RNA引導(dǎo)的核酸酶轉(zhuǎn)化為RNA引導(dǎo)的核酸結(jié)合蛋白質(zhì)[28]?；赿Cas9這一特性,亓磊團(tuán)隊(duì)開發(fā)了基因表達(dá)調(diào)控工具CRISPRa(CRISPR activation, CRISPRa)和CRISPRi(CRISPR interference, CRISPRi)[29, 30](Fig.4)。

Fig.4 Gene expression regulation based on the CRISPR-dCas9 system (A) Point mutations at both the RuvC domain (D10A) and the HNH domain (H840A) leads to loss of endonuclease activity. The mutated Cas9 was named as dCas9. (B) CRISPRi: The complex formed by dCas9 or dCas9 fused with different transcriptional repression domains with sgRNA downregulates gene transcription by blocking the RNA polymerase from reading through gene sequences or directly inhibiting the expression; CRISPRa: dCas9 is fused to a transcriptional activator domain to activate gene transcription. (C) Three CRISPRa modalities based on different mechanisms: Tandemly fuse different transcriptional activators to dCas9 (dCas9-VRP); fuse a scaffold protein with dCas9 for multiple transcriptional activators binding ( dCas9-SunTag ); simultaneous construction of transcriptional activators fused with dCas9 and sgRNA contains aptamer recognizeing MS2, which can simultaneously bind multiple transcriptional activators (SAM)

3.1.1 CRISPRi系統(tǒng) 在大腸桿菌中,利用一個(gè)帶有基因靶向序列、Cas9蛋白結(jié)合序列和轉(zhuǎn)錄終止序列的sgRNA,將dCas9靶向基因的編碼序列或其啟動(dòng)子,發(fā)現(xiàn)dCas9與sgRNA形成的復(fù)合物能以空間位阻的形式阻斷RNA聚合酶通讀基因序列,直接阻斷蛋白質(zhì)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的延伸,從而抑制基因轉(zhuǎn)錄,這個(gè)過程叫做CRISPRi。與RNAi的基因沉默不同,CRISPRi系統(tǒng)不需要破壞轉(zhuǎn)錄的mRNA[30]。該系統(tǒng)主要通過2種方式抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄:(1)阻止RNA聚合酶與目標(biāo)基因的啟動(dòng)子結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄;(2)與開放閱讀框靶向結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)錄延伸(相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄終止子)。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,上述CRISPRi復(fù)合物僅有微弱的基因表達(dá)抑制作用[29]。為了提高轉(zhuǎn)錄抑制強(qiáng)度,研究者將dCas9與不同轉(zhuǎn)錄抑制子融合表達(dá),經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn),dCas9-KRAB融合蛋白具有較高的抑制效率[30]。KRAB(Krüppel-associated box)結(jié)構(gòu)域是鋅指蛋白(zinc finger proteins,ZNFs)中的一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域,長(zhǎng)約75個(gè)氨基酸,據(jù)預(yù)測(cè)它們可以形成兩個(gè)雙親性的α-螺旋,目前,大多數(shù)CRISPRi研究使用來自KOX1(ZNF 10)蛋白的KRAB,這一結(jié)構(gòu)域也被用于TALEs介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制[31]。這些KRAB結(jié)構(gòu)域與輔抑制蛋白KAP1(KRAB-associated protein 1, KAP1)結(jié)合,而KAP1反過來招募組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1(SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1),促進(jìn)組蛋白H3K9(H3 lysine 9)的三甲基化,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制[32]。最近研究發(fā)現(xiàn),ZIM3 KRAB的基因表達(dá)抑制作用強(qiáng)于KOX1 KREB[33]。

3.1.2 CRISPRa系統(tǒng) 通過dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控因子相連構(gòu)建CRISPR抑制的(CRISPRi)基因表達(dá)抑制系統(tǒng),抑制靶向基因的表達(dá);相應(yīng)地,將dCas9與轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控因子相連,則能生成一個(gè)被稱為CRISPRa的轉(zhuǎn)錄上調(diào)系統(tǒng)。目前的CRISPRa系統(tǒng)可以分為三類[34]:一類是將單個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子與dCas9串聯(lián)構(gòu)建融合蛋白質(zhì);第二種是構(gòu)建dCas9與腳手架蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì),用以結(jié)合多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子;第三種是同時(shí)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄激活因子與dCas9的融合蛋白質(zhì)和含有MS2適配體(MS2噬菌體的19核苷酸 RNA 發(fā)夾結(jié)構(gòu))序列的sgRNA(用于招募與MS2融合的轉(zhuǎn)錄激活因子復(fù)合物),這樣可以同時(shí)結(jié)合多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子,增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)(Fig.4)。3種CRISPRa系統(tǒng)元件均包含dCas9融合蛋白質(zhì)和sgRNA,區(qū)別在于dCas9融合蛋白質(zhì)和sgRNA的構(gòu)建方式不同:(1)dCas9融合蛋白質(zhì)包括①直接融合單個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子,例如將dCas9的C末端與1個(gè)由4個(gè)VP16結(jié)構(gòu)域組成的激活結(jié)構(gòu)域VP64融合,在HEK293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)時(shí),能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄上調(diào)[35, 36];②串聯(lián)融合多個(gè)同種或/和異種轉(zhuǎn)錄激活因子;例如篩選發(fā)現(xiàn)三元轉(zhuǎn)錄激活因子VPR(VP64-p65-Rta)與dCas9的C端融合而得的dCas9-VP64-p65-Rta(dCas9-VPR),激活能力顯著增強(qiáng),其中VP64是單純皰疹蛋白16的TAD四聚體,p65則是核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB) 蛋白質(zhì)家族中的成員,轉(zhuǎn)錄激活蛋白(replication and transcription activator, Rta)是Y皰疹病毒中具有序列保守性的一個(gè)蛋白分子[37]。和③通過串聯(lián)融合與轉(zhuǎn)錄激活因子融合蛋白特異性結(jié)合的多肽陣列腳手架,例如Sun-Tag[38]。(2)sgRNA包括①原型sgRNA;②可與特定蛋白質(zhì)標(biāo)簽結(jié)合的工程化sgRNA,例如,由dCas9-轉(zhuǎn)錄激活因子融合蛋白質(zhì)、含有與MS2結(jié)合的核酸適配體序列的sgRNA和MS2-轉(zhuǎn)錄激活因子融合蛋白質(zhì)三種元件構(gòu)成的CRISPR-SAM系統(tǒng)(synergistic activation mediator,SAM),能夠特異性激活多數(shù)細(xì)胞內(nèi)源基因[39]。在SAM系統(tǒng)中,sgRNA含有與MS2結(jié)合的適配體序列,可與MS2、p65和HSF1三元融合蛋白質(zhì)結(jié)合,增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活作用,而且啟動(dòng)子區(qū)單一位點(diǎn)sgRNA導(dǎo)向的SAM轉(zhuǎn)錄激活效果遠(yuǎn)高于多位點(diǎn)dCas9-VP64的轉(zhuǎn)錄激活效果[39]。

3.2 表觀基因組編輯器

許多表觀遺傳修飾因子與dCas9蛋白融合后可在DNA或染色質(zhì)水平上進(jìn)行化學(xué)修飾,例如通過在DNA上靶向添加甲基或在組蛋白殘基上插入乙?；?以及甲基的表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)基因表達(dá),這些修飾作用持久并且可遺傳[40-43]。構(gòu)建dCas9表觀遺傳編輯系統(tǒng)的常用方式是將dCas9與表觀遺傳修飾酶融合在一起,通過核酸酶靶向結(jié)合目標(biāo)DNA的特性實(shí)現(xiàn)特定基因組位點(diǎn)上表觀基因組的編輯。

將DNMT3a(DNA methyltransferase 3 alpha),一種能夠在體內(nèi)甲基化CpG位點(diǎn)的活性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)的DNA甲基化結(jié)構(gòu)域與dCas9結(jié)合,使靶向啟動(dòng)子上的DNA瞬時(shí)甲基化,可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的基因沉默[44-46]。例如,用dCas-DNMT3a融合蛋白靶向SNCA(synuclein alpha)內(nèi)含子1,能在攜帶SNCA的人iPSC來源的多巴胺能神經(jīng)元中產(chǎn)生DNA高甲基化,在體外研究中證實(shí)了其可用于治療帕金森病[47]。而將甲基胞嘧啶雙加氧酶1(Ten-eleven translocation 1,TET1)催化結(jié)構(gòu)域與dCas9融合,可快速實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子的去甲基化,并誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)上調(diào),從而驅(qū)動(dòng)各種類型的細(xì)胞中靶基因的轉(zhuǎn)錄激活[48]。dCas9-TET的融合蛋白被用于治療癌癥[49]并減輕體內(nèi)腎纖維化[50]。這些DNA甲基化調(diào)控都是持久、可逆和可遺傳的。

除了DNA的甲基化修飾可以實(shí)現(xiàn)基因的沉默和激活,組蛋白的修飾也可以實(shí)現(xiàn)類似的基因調(diào)控效果。將p300催化結(jié)構(gòu)域與dCas9組成融合蛋白,該蛋白質(zhì)在靶向增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域時(shí)能實(shí)現(xiàn)組蛋白瞬時(shí)和高效的乙?；?進(jìn)而增強(qiáng)基因的表達(dá)[51]。當(dāng)dCas9與組蛋白去乙酰化酶1(Histone deacetylase 1,HDAC1)融合時(shí),可以去除乙?；?將其靶向KRAS可以抑制癌癥的生長(zhǎng)[52]。

最近,一種全新的基于CRISPR的表觀遺傳編輯技術(shù)CRISPRoff被報(bào)道[53]。研究者將KRAB和D3A-D3L分別融合于dCas9的N-/C-末端,構(gòu)建出新的表觀遺傳編輯器CRISPRoff-V1和CRISPRoff-V2,發(fā)現(xiàn)CRISPRoff特別是CRISPRoff-V2能持久抑制GFP(Green fluorescent protein)報(bào)告基因的表達(dá):CRISPRoff-V2短時(shí)表達(dá)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制效果至少可持續(xù)50 d。隨后研究者還設(shè)計(jì)出了CRISPRon,其有效逆轉(zhuǎn)CRISPRoff介導(dǎo)的DNA甲基化修飾和轉(zhuǎn)錄抑制。CRISPRoff/on系統(tǒng)為控制基因表達(dá)、靶向增強(qiáng)子和探索表觀遺傳的原理提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具。

3.3 堿基編輯器

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,CRISPR-Cas系統(tǒng)通過精確剪切目標(biāo)基因形成DSB,隨后依靠細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)雙鏈斷裂,從而實(shí)現(xiàn)DNA序列的改變。DNA修復(fù)采用2種相互競(jìng)爭(zhēng)的機(jī)制即HR和NHEJ[26]。借助同源修復(fù)模板,HDR可以實(shí)現(xiàn)精確可控的編輯,但是它的效率相較于NHEJ修復(fù)更低;NHEJ修復(fù)不依賴修復(fù)模板,直接將2個(gè)DNA末端拼接,但在拼接的過程中會(huì)產(chǎn)生堿基的缺失突變(indel),無法實(shí)現(xiàn)基因的精確編輯,大規(guī)模的DSBs也很容易引發(fā)副作用。也就是說,DSB引發(fā)的DNA修復(fù)很難實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定的單堿基突變[54]。然而,許多致病性遺傳變異是由單核苷酸變異(single-nucleotide variants, SNVs)引起的[55]。因此,僅僅通過簡(jiǎn)單的基因敲除與插入不能實(shí)現(xiàn)這些疾病的有效治療,需要開發(fā)能夠高效糾正SNV的方法和工具,這也要求更加精密的基因編輯技術(shù)[13, 56]。因此,先后開發(fā)出了基于CRISPR-Cas9的堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器。這些工具不再依賴于DSB造成的DNA剪切,顯著降低了錯(cuò)誤修復(fù)造成的毒性,這使得CRISPR-Cas系統(tǒng)得到了更廣泛的應(yīng)用[57, 58]。

堿基編輯器(base editor,BE)是一類在單堿基水平實(shí)現(xiàn)特定堿基類型高效精準(zhǔn)編輯的工具。BE能夠以可編程的方式實(shí)現(xiàn)DNA堿基的轉(zhuǎn)換,不需要切割DNA產(chǎn)生DSBs或同源供體模板。目前,廣泛使用的DNA堿基編輯器主要是將可編程的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)與堿基脫氨酶整合在一起組成融合蛋白質(zhì)。主要有2種類型:胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor,ABE),分別可以實(shí)現(xiàn)C-to-T和A-to-G此類堿基之間的轉(zhuǎn)變[59]。

CBE的核心元件是由dCas9 或 nCas9蛋白(Cas9 Nickase,單鏈切割活性的Cas9蛋白)與胞嘧啶脫氨酶組成的融合蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)在sgRNA引導(dǎo)下到達(dá)靶序列部位,與sgRNA非配對(duì)的ssDNA結(jié)合,將該ssDNA上一定范圍內(nèi)(Cas9原間隔序列5個(gè)堿基范圍內(nèi))的胞嘧啶脫氨變成尿嘧啶,進(jìn)而通過DNA復(fù)制或修復(fù)將尿嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?最終實(shí)現(xiàn)C-G堿基對(duì)于T-A堿基對(duì)的直接替換[59]。在肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥小鼠模型中,SpCas9-CBE被用來在SOD1(super oxide dismutase 1,SOD1)中創(chuàng)建一個(gè)過早的終止密碼子,從而減少肌肉萎縮,改善神經(jīng)肌肉功能[60]。

與CBE相似,ABE的核心元件是nCas與人工定向進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶組成的融合蛋白質(zhì),在sgRNA的引導(dǎo)下靶向目標(biāo)DNA序列,在Cas9與靶序列結(jié)合形成R-環(huán)之后,腺嘌呤脫氨酶與跟sgRNA非配對(duì)的ssDNA結(jié)合,促使一定范圍內(nèi)的腺嘌呤脫氨變成肌苷,肌苷以鳥嘌呤的形式進(jìn)行讀碼與復(fù)制,最終實(shí)現(xiàn)A-T堿基對(duì)于G-C堿基對(duì)的替換[61]。將ABE遞送到鐮狀細(xì)胞病患者的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPCs)中,可以將SCD(sickle cell disease,SCD)的致病基因HBBS(β-globin gene,HBB)轉(zhuǎn)化為非致病的HBBG(makassar β-globin),這種轉(zhuǎn)變是持久的,可以最大限度減少DSB的不良后果[62]。ABE也可以用來糾正Hutchinson-Gilford早衰綜合征(HGPS),將LMNA(lamin A/C gene)中的致病性突變逆轉(zhuǎn),根本性的治療了HGPS,并且防止了外膜纖維化[63]。這些發(fā)現(xiàn)證明了ABE在遺傳學(xué)疾病治療上的無限潛力。

3.4 先導(dǎo)編輯器

CBE和ABE組合能夠?qū)崿F(xiàn)的堿基編輯仍然是有限的,為了實(shí)現(xiàn)12種堿基的全互換,David Liu團(tuán)隊(duì)開發(fā)出了能實(shí)現(xiàn)全堿基轉(zhuǎn)化與多堿基精確缺失突變的先導(dǎo)編輯器(prime editor, PE)[64]。PE在CRISPR-Cas9的基礎(chǔ)上:(1)在sgRNA的3′末端增加一段逆轉(zhuǎn)錄酶的帶有基因編輯序列的RNA引物,組成pegRNA(the engineered guide RNA),pegRNA中包含單導(dǎo)向RNAs(single guide RNAs,sgRNAs),在其3′-端還有一段引物結(jié)合序列(primer binding site,PBS)和轉(zhuǎn)錄模板序列(RT template);(2)將dCas9與逆轉(zhuǎn)錄酶融合,dCas9在pegRNA上的sgRNA序列指引下,切割DNA單鏈,pegRNA 3′-端的PBS(引物結(jié)合序列)可以與切割斷點(diǎn)前的互補(bǔ)序列識(shí)別配對(duì),逆轉(zhuǎn)錄酶以pegRNA上PBS序列后的模板序列為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,將目標(biāo)序列直接聚合到切口的DNA鏈上[61]。實(shí)現(xiàn)任意小片段序列的插入、敲除和替換,且顯著地降低脫靶率。PE的強(qiáng)大編輯功能使其具有巨大的治療潛力。在α1-抗胰蛋白酶缺乏(Alpha-1 antitrypsin deficiency,AATD)的小鼠模型中,PE通過創(chuàng)建A-to-G編輯來去除SERPINA1(serpin family A member 1)中的致病性E342K突變[65]。PE還可以通過創(chuàng)建G-to-T編輯來糾正小鼠視網(wǎng)膜中的Dnmt1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)突變,這些都是其他編輯器無法替代的。

盡管BE和PE相對(duì)于傳統(tǒng)的CRISPR-Cas方法能夠脫離DSB提供更加精確的基因編輯,但是它們?nèi)匀辉谝欢ǔ潭壬险T導(dǎo)有害的轉(zhuǎn)錄反應(yīng),其中CBE的毒性最強(qiáng)[66]。因此,在推進(jìn)堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器的臨床應(yīng)用上,應(yīng)對(duì)其安全性展開進(jìn)一步評(píng)估。

3.5 靶向RNA編輯的CRISPR-Cas系統(tǒng)

靶向DNA的基因編輯由于其變化是永久性的,一旦發(fā)生脫靶編輯會(huì)造成不可逆轉(zhuǎn)的巨大傷害,而RNA靶向的CRISPR-Cas系統(tǒng)(RCas)則不存在這類問題。因此,越來越多研究者開始投入到RCas系統(tǒng)的發(fā)掘與改造,從而推動(dòng)了RNA靶向研究的快速發(fā)展[67]。目前,RCas系統(tǒng)大致可以分為兩大類,一類是對(duì)傳統(tǒng)DNA靶向的CRISPR系統(tǒng)改造,實(shí)現(xiàn)RNA靶向調(diào)控;另一大類則是特異性靶向識(shí)別ssRNA的CRISPR系統(tǒng)[68]。最具代表性的分別是CRISPR二類中的Cas9系統(tǒng)和Cas13系統(tǒng)。

3.5.1 Cas9系統(tǒng) 傳統(tǒng)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)依賴于sgRNA和非sgRNA互補(bǔ)鏈上的-NGG PAM位點(diǎn),使其實(shí)現(xiàn)Cas9對(duì)DNA靶序列的特異性識(shí)別和切割[69, 70]。Cas9的這一特性限制了其對(duì)單鏈RNA序列的靶向編輯,加入帶有PAM序列的互補(bǔ)反式DNA寡核苷酸(PAMmer),可以克服這一限制,能夠促使Cas9與RNA高親和力結(jié)合并切割RNA;Cas9切割效率受PAMmer長(zhǎng)度的影響;這一策略使得CRISPR-Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)RNA靶向序列靶向識(shí)別和切割[71]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PAMmer只影響核酸酶的RNA切割活性而不影響其與RNA的結(jié)合能力,受此啟發(fā)構(gòu)建的dCas9蛋白,(稱作RCas9)使其在sgRNA的引導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)RNA的靶向識(shí)別和結(jié)合,這一作用無需PAMmer參與,而且RCas9可以在無PAMmer的情況下,替換與微衛(wèi)星重復(fù)異常擴(kuò)增序列結(jié)合的RNA結(jié)合蛋白質(zhì),促使微衛(wèi)星重復(fù)異常擴(kuò)增序列降解[72, 73]。最近,有報(bào)道稱CjCas9(空腸彎曲桿菌Cas9)[74]、NmeCas9(腦膜炎奈瑟菌Cas9)[75]和SauCas9(金黃色葡萄球菌Cas9)[67]可以不依賴PAM,實(shí)現(xiàn)ssRNA靶向,并且CjCas9和NmeCas9的ssRNA切割是可編程的。不過對(duì)于這些新來源的Cas9系統(tǒng),其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3.5.2 Cas13系統(tǒng) 與Cas9需要依賴PAM的靶向切割機(jī)制不同,Cas13系統(tǒng)能特異性地識(shí)別并靶向ssRNA,而且Cas13-crRNA復(fù)合物在識(shí)別靶序列后,除了切割crRNA的ssRNA,Cas13還會(huì)并行切割與crRNA配對(duì)結(jié)合ssRNA附近的其他ssRNA[76, 77],因此,其在基因敲低中的應(yīng)用受限。但失去酶活性的Cas13也可以與dCas9一樣被用于RNA的編輯。

3.5.3 其他RNA編輯技術(shù) SNAP-tag(DNA repair enzyme alkylguaninetransferase,AGT or SNAP-tag)與ADAR(adenosine deaminase acting on RNA,ADAR)或者APOBEC1(apolipoprotein B MRNA editing enzyme catalytic subunit 1,APOBEC1)等堿基編輯酶的融合蛋白質(zhì),在SNAP-tag的催化下可與O-6-芐基鳥嘌呤修飾的gRNA特異性結(jié)合,在RNA特定位點(diǎn)進(jìn)行堿基編輯[78, 79]。通過gRNA上的MS2適配體招募MCP和ADAR2或者APOBEC1等堿基編輯酶形成的融合蛋白質(zhì)[80],也可用于RNA特定位點(diǎn)的堿基編輯。

4 CRISPR-Cas遞送策略

CRISPR系統(tǒng)能在任何遺傳環(huán)境下設(shè)計(jì)一個(gè)編輯可控的gRNA引導(dǎo)到目標(biāo)序列進(jìn)行基因編輯,展現(xiàn)了遺傳疾病治療的強(qiáng)大潛力。為了實(shí)現(xiàn)基于CRISPR系統(tǒng)的體內(nèi)基因編輯治療,必須尋找到一種遞送載體將它們安全、高效和準(zhǔn)確地遞送到人體相關(guān)器官和組織,并且盡可能避免觸發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng),這是目前體內(nèi)基因編輯應(yīng)用的一個(gè)重大挑戰(zhàn)[81]。

4.1 基于腺相關(guān)病毒和脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)的基因編輯工具遞送

迄今為止,已有不同遞送載體用于CRISPR-Cas系統(tǒng)的傳遞,主要可以分為病毒載體(腺相關(guān)病毒、慢病毒)和非病毒載體兩大類,非病毒載體包括天然合成材料(脂質(zhì)體、金納米顆粒、脂質(zhì)納米顆粒)和物理方法(電穿孔、超聲穿孔法和顯微注射法)2種。本文主要介紹腺相關(guān)病毒和脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles,LNPs)。

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)是通過在反向末端重復(fù)序列之間裝載目標(biāo)基因用于疾病治療,這種方法會(huì)受AAV大小的限制,只允許裝載大小4.7 kb以內(nèi)的Cas和基因[82-84]。為了克服AAV裝載大小的限制,目前有2種應(yīng)對(duì)措施,一種方法是設(shè)計(jì)出更小的Cas蛋白。目前報(bào)道的CRISPR-Cas12f系統(tǒng)中enAsCas12f蛋白大小是SpCas9的三分之一,并且表現(xiàn)出比其親本蛋白質(zhì)更好的活性和低脫靶率,很大程度上克服了遞送載體載荷量的限制[85, 86]。另一種則是將基因編輯組件放置到2個(gè)AAV系統(tǒng)中同時(shí)遞送到同一個(gè)細(xì)胞,再在細(xì)胞內(nèi)組合發(fā)揮編輯活性。但是這種方法的效果要明顯遜色于單個(gè)系統(tǒng)遞送[87]。除此之外,AAV在臨床中的應(yīng)用受其自身免疫原性影響,單次注射后會(huì)產(chǎn)生血清型特異性中和抗體,需保證一次足量給藥就能達(dá)到預(yù)期治療效果,這可能帶來意外的不良反應(yīng)[88]。2022年10月,一位27歲杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(duchenne muscular dystrophy,DMD)患者在接受重組腺相關(guān)病毒9型(rAAV9)載體遞送的CRISPR基因編輯治療后不幸去世,高劑量rAAV引起的強(qiáng)烈先天性免疫反應(yīng)導(dǎo)致了急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome ,ARDS),這也是第一例CRISPR介入治療死亡的病例[89]。

以AAV為代表的病毒載體的不足推動(dòng)了LNPs在內(nèi)的非病毒傳遞系統(tǒng)的發(fā)展。與AAV不同,LNP毒性和免疫原性更低并且不受載荷量的限制。它由可電離陽離子磷脂、輔助磷脂、膽固醇和聚乙二醇化磷脂四個(gè)部分組成。為了將其包裹的核酸物質(zhì)運(yùn)送到靶細(xì)胞,LNP首先通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,在內(nèi)體酸化后通過破壞內(nèi)體膜分泌出來,對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造可以調(diào)控遞送[90-93]。LNP存在較強(qiáng)的肝內(nèi)自然累積效應(yīng),目前,已被美國FDA批準(zhǔn)用于通過靜脈注射向人肝細(xì)胞輸送治療性siRNA[94-96]。而其非肝靶向遞送仍然局限于通過局部注射實(shí)現(xiàn),設(shè)計(jì)開發(fā)非肝靶向的LNP遞送系統(tǒng)仍是一大挑戰(zhàn)。此外有研究表明,LNP在小鼠模型中被證明會(huì)誘導(dǎo)炎癥惡化,并且這種惡化是時(shí)間和劑量依賴性的[90, 97][110-111],LNP遞送系統(tǒng)的安全性需要進(jìn)一步考量。

AAV的遞送受限于裝載量和免疫原性,LNP雖然克服了AAV的裝載限制且有較低的免疫原性,但是其研究仍然不夠深入,再加上CRISPR基因編輯器的長(zhǎng)時(shí)間滯留會(huì)導(dǎo)致脫靶編輯造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。因此,遞送仍然是基因編輯體細(xì)胞治療的最大瓶頸。如果在這些問題的優(yōu)化方面取得突破性進(jìn)展,將為基因編輯的臨床轉(zhuǎn)化注入新的活力[98, 99]。

4.2 細(xì)胞外囊泡與基因編輯工具遞送

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)是由細(xì)胞自發(fā)分泌的內(nèi)源性膜性顆粒,通常作為信使在細(xì)胞之間運(yùn)輸各種物質(zhì),例如核酸、蛋白質(zhì)、小分子代謝物和脂質(zhì)等[100]。根據(jù)EV生成途徑的不同,EV可以分為外泌體(exosome,30～150 nm)、微囊泡(microvesicle,100 nm-1 μm)和凋亡小體(apoptatic body, 100 nm～5 μm),其中30～200 nm的小細(xì)胞外囊泡常用于遞送包括CRISPR-Cas在內(nèi)的不同物質(zhì)[101-103]。與傳統(tǒng)遞送載體存在自身免疫原性、毒性和易被機(jī)體代謝清除等問題不一樣,EV表面所攜帶的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)可以防止其被機(jī)體的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system,RES)和單核吞噬系統(tǒng)(monophagocytic system,MPS)清除,從而延長(zhǎng)半衰期。此外,EV的小尺寸使它們更容易穿過細(xì)胞外基質(zhì)等物理屏障[104]。目前,利用EV包載藥物用于治療的疾病涉及癌癥[105, 106]、心血管疾病[107]和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[108]等。與LNPs引發(fā)的炎癥反應(yīng)相比,EV誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的數(shù)量和效應(yīng)都較弱,安全性更高[109]?；谝陨咸攸c(diǎn),EV具有作為遞送CRISPR-Cas系統(tǒng)的優(yōu)良載體的潛力。

CRISPR-Cas系統(tǒng)可以通過質(zhì)粒DNA、mRNA或核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)3種不同形式進(jìn)行遞送,各有優(yōu)缺點(diǎn)[110]。相較于前兩者,RNP遞送不需要進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯,能直接進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行編輯,活性更高,有更低的脫靶率和免疫原性,成為目前最具潛力的遞送形式[111]。研究表明,單純的Cas9蛋白直徑在10～15 nm之間,加入gRNA與之混合后會(huì)發(fā)生聚集直徑達(dá)到200 nm,加入聚谷氨酸或ssODNenh后可以阻止聚集使其直徑降到100 nm左右[112],這超過了大部分病毒和非病毒載體的裝載能力?；诰酆衔锏募{米顆粒和脂質(zhì)體又易在體循環(huán)中被降解,這些因素都限制了RNP的遞送[113]。與病毒不同,EV可以在大小上進(jìn)行修飾。混合EV已被開發(fā)用于攜帶CRISPR/Cas系統(tǒng)等大型分子。混合EV不僅貨物包載能力更強(qiáng),而且由于脂質(zhì)體帶正電荷,帶負(fù)電荷的RNA和DNA能更有效地被包載到EV中[114]。EV的低免疫原性和可操作性為RNP的遞送創(chuàng)造了可靠條件[115][129]。目前,主要通過(1)細(xì)胞內(nèi)EV生成途徑將CRISPR-Cas編輯系統(tǒng)包載到EVs;這些包載方式不會(huì)破壞EV膜結(jié)構(gòu),保證其遞送性能穩(wěn)定;(2)利用電轉(zhuǎn)和化學(xué)轉(zhuǎn)染等物理和化學(xué)方法將Cas蛋白與sgRNA形成的核糖核蛋白質(zhì)顆粒(ribonucleoprotein particles,RNPs),或者能夠編碼表達(dá)Cas蛋白和sgRNA的質(zhì)粒包載到EV中[116, 117](Fig.5),這些方法各有優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)。

Fig.5 The strategies for extracellular vesicle encapsulating gene editors The CRISPR-Cas system can be delivered in three different forms: plasmid DNA, mRNA, or ribonucleoprotein complex (RNP), and can be loaded into the EV in two ways. Encapsulation of the Cas9 RNP by physical/chemical approaches: Membrane disruption of the EV was first performed and then the CRISPR-Cas editor was loaded through a concentration gradient way; encapsulation of the CRISPR-Cas editing system through EV biogenesis (this approach does not damage the EV membrane structure and ensures stable delivery performance)

基因編輯工具的精準(zhǔn)靶向遞送是精準(zhǔn)、高效和靶向基因編輯的難點(diǎn)。EV具有歸巢靶向其親本細(xì)胞同源組織的特性,利用這一特性,可以采用EV實(shí)現(xiàn)組織和器官的靶向遞送。例如,來自小膠質(zhì)細(xì)胞的EV傾向于到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[118],來自施萬細(xì)胞的EV傾向于靶向周圍神經(jīng)[119],而來自腫瘤細(xì)胞的EV傾向于到達(dá)同源的腫瘤細(xì)胞[120]。這種靶向傾向可能與EV同母細(xì)胞共享表面受體和基質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)有關(guān),因此,根據(jù)遞送目的選擇合適來源的EV是遞送設(shè)計(jì)的重要考慮因素。除此之外,采用靶向蛋白質(zhì)或靶向肽對(duì)EV進(jìn)行表面修飾也能實(shí)現(xiàn)EV組織或器官的靶向遞送。在EV表面表達(dá)具有靶向性的重組蛋白質(zhì),例如將EV膜蛋白Lamp2b(lysosome-associated membrane glycoprotein 2b)、PDGFR(platelet-derived growth factor receptors)、CD63(CD63 antigen)與受體細(xì)胞表面的配體融合可以實(shí)現(xiàn)EV對(duì)特定受體細(xì)胞的靶向遞送。Mentkowski等人將一組心肌細(xì)胞靶向多肽與Lamp2b融合,所得的EV經(jīng)給藥后可提高其心臟靶向遞送效率,EV在心臟的保留率提高2.4倍[121]。Liang等人將軟骨細(xì)胞親和肽DWRVIIPPRPSA和Lamp2b融合的重組蛋白組表達(dá)到EV上,賦予了其靶向軟骨組織治療骨關(guān)節(jié)炎的能力[122]。利用人PDGFR的跨膜結(jié)構(gòu)域作為載體與2種靶向CD3和EGFR(epidermal growth factor receptor)的scFv抗體串聯(lián)融合,通過EV生成途徑表達(dá)到EV膜表面,可以實(shí)現(xiàn)乳腺癌的靶向治療[123-125]。除此之外,整合素的表達(dá)也與組織器官的靶向遞送相關(guān),特定部位的整合素表達(dá)下降會(huì)減少該組織對(duì)EV的攝取。例如,ITGβ4是一種EV上表達(dá)的肺相關(guān)整合素,Hoshino等人發(fā)現(xiàn)ITGβ4(Integrin subunit beta 4)的下調(diào)顯著降低了體內(nèi)肺組織對(duì)EV的攝取;相反,過表達(dá)ITGβ4的骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞系會(huì)促進(jìn)EV進(jìn)入肺[126]。

盡管與AAVs或LNPs載體相比,EV在體內(nèi)生物相容性和穩(wěn)定性方面具有許多優(yōu)勢(shì),但基于EV的CRISPR遞送仍處于臨床前階段,仍然存在幾個(gè)局限性需要克服。目前與EV的生物學(xué)功能與作用機(jī)制仍有待闡明,EV生產(chǎn)加工優(yōu)化的方法研究仍需更多研究[127]。EV具有高度異質(zhì)性,不同來源的EV的生物效應(yīng)可能不同,但目前缺乏通用的樣本收集方案和生物標(biāo)志物用以區(qū)分和表征不同來源的EV[128]。此外,EV的貨物包載、靶向、攝取和釋放等方面的機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究[129]。未來應(yīng)當(dāng)深入研究EV的靶向遞送機(jī)制,尋找更加高效的EV貨物包載方法,在實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)遞送的同時(shí)增加其攝取和釋放效率。

5 基因編輯技術(shù)在糖生物學(xué)中的應(yīng)用

糖類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)。與DNA和蛋白質(zhì)不同,糖鏈的生物合成是非模板依賴的,主要依賴級(jí)聯(lián)的酶促催化合成。此外,糖鏈的鏈接方式多樣,單糖種類較多,這使得糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比核酸和蛋白質(zhì)復(fù)雜,這一特性也嚴(yán)重阻礙了糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究。研究發(fā)現(xiàn),糖類物質(zhì)生物合成酶基因表達(dá)水平的改變跟糖鏈結(jié)構(gòu)的改變通常一致,但不完全相同[130, 131]。傳統(tǒng)的RNAi基因沉默策略通常只降低轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平,即使酶蛋白減少80%～90%也可能不會(huì)對(duì)糖基化產(chǎn)生明確和明顯的影響[132]。因此,可以采用基因編輯技術(shù)對(duì)糖基化途徑進(jìn)行精準(zhǔn)編輯,促進(jìn)對(duì)糖類物質(zhì)生物合成、結(jié)構(gòu)與功能的研究,也有助于轉(zhuǎn)化糖科學(xué)的發(fā)展。

5.1 糖基化修飾及其作用

哺乳動(dòng)物中至少有一半的蛋白質(zhì)被糖基化,各種單糖殘基在糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的催化下連接到蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸上的過程稱為糖基化(glycosylation)。在糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase, GT)的參與下,真核生物細(xì)胞中的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)糖基化都沿著分泌途徑發(fā)生,從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開始,在高爾基體中完成。大多數(shù)GTs是II型跨膜糖蛋白質(zhì),兼具內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基腔導(dǎo)向的催化結(jié)構(gòu)域,利用活化的糖核苷酸作為供體,以囊泡形式從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸至高爾基體,參與糖基化修飾[133-135]。N-糖基化是真核生物中一種普遍的糖基化形式。N-糖基化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中由與STT3A或STT3B催化亞基組裝的寡糖轉(zhuǎn)移酶(oligosaccharyltransferase,OST)復(fù)合物啟動(dòng),該復(fù)合物將寡糖轉(zhuǎn)移到多肽主鏈上,在含有N-X-S/T序列的Asn殘基上被修飾,再轉(zhuǎn)移到高爾基體中以多種方式進(jìn)行進(jìn)一步修飾[136-138]。在真核生物中,除了O-GalNAc和O-Xyl (proteoglycan)糖基化在高爾基體進(jìn)行外,大多數(shù)類型的O-糖基化也都是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中由不同的多肽糖基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)的,隨后在高爾基體中進(jìn)一步進(jìn)行延伸、分叉和終止[133, 139]。這些過程可被小分子糖類似物抑制[140-142](Fig.6)。

Fig.6 Cellular glycoengineering Glycosylation can be modulated by direct editing of the GT gene using precision gene editing techniques. Some artificial sugar analogues can modulate the process of glycosylation metabolism (core extension, elongation and branching of oligosaccharides). Extracellularly, glycans may be remodeled by selective endo-/exo-glycosidases. Mutant cells with loss/gain of different glycosylation profiles can be derived using cytotoxic lectins

糖基化異常已被發(fā)現(xiàn)與癌癥等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[143-147]。蛋白質(zhì)糖基化異常會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤、穩(wěn)定性降低和功能喪失[148]。人類基因組包含大約700個(gè)基因參與細(xì)胞糖基化相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體等功能蛋白質(zhì)的編碼[149],其中超過200個(gè)基因編碼GTs[150]。這些基因功能的異常還可導(dǎo)致先天性糖基化異常疾病(congenital disorders of glycosylation,CDG),CDG已發(fā)現(xiàn)接近200種,多數(shù)是罕見病,涉及不同的N-糖基化和O-糖基化(O-mannose、O-glucose、O-fucose、O-GlcNAc、O-GalNAc、糖胺聚糖、糖基磷脂酰肌醇和糖脂)過程[151],這些疾病多數(shù)缺乏有效治療手段[151, 152]。精確基因編輯技術(shù)的發(fā)展為細(xì)胞糖基化的研究和相關(guān)疾病的治療提供了無限機(jī)會(huì)。

5.2 基因編輯技術(shù)在糖生物學(xué)中的應(yīng)用

基因編輯在糖生物學(xué)研究中的應(yīng)用具有悠久歷史[132]。早期糖基轉(zhuǎn)移酶基因或其他影響糖基化的基因編輯是通過隨機(jī)突變和凝集素抗性篩選等隨機(jī)篩選技術(shù)實(shí)現(xiàn)[153-155]。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展,與其他領(lǐng)域一樣,糖生物學(xué)領(lǐng)域的基因編輯也經(jīng)歷了基于胚胎干細(xì)胞中的同源重組策略,對(duì)糖基化相關(guān)基因進(jìn)行靶向敲入或敲除(knock out, KO / knock in, KI)[143, 156]到基于可編程核酸酶基因編輯的轉(zhuǎn)變,逐步實(shí)現(xiàn)了高效、精準(zhǔn)和靶向編輯。這些技術(shù)極大地促進(jìn)了糖類物質(zhì)生物合成、結(jié)構(gòu)與功能研究和糖復(fù)合物的生產(chǎn)和應(yīng)用。

5.2.1 糖類物質(zhì)功能、生物合成及機(jī)制解析 N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)型O-糖基化是最復(fù)雜的蛋白質(zhì)糖基化形式之一,有多達(dá)20種不同的GalNAc-T亞型控制O-糖基化位點(diǎn),目前的分析方法均不能很好地理解和區(qū)分不同GalNAc-T家族成員的功能及作用機(jī)制。精確基因編輯技術(shù)的發(fā)展為研究同工酶的功能和機(jī)制提供了手段。Schjoldager等人[157]通過敲除HepG2(human hepatocellular carcinomas)中GALNT1(polypeptide N-Acetylgalactosaminyltransferase 1)和GALNT2(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 2)來確定該細(xì)胞中ApoC Ⅲ(apolipoprotein C-III)是GALNT2的底物。近來,有研究利用SimpleCell策略,構(gòu)建了只表達(dá)Tn-O-糖型的癌癥細(xì)胞系,并以該細(xì)胞作為抗原制備糖型確定細(xì)胞的特異性單克隆抗體,這為癌癥免疫療法提供了新策略[169]。此外,CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)可以實(shí)現(xiàn)全基因組功能篩選,不僅能鑒定不同的糖基轉(zhuǎn)移酶基因,還可以發(fā)現(xiàn)新的糖基化基因和功能[158]。Han等人通過人肺上皮細(xì)胞基因組規(guī)模的CRISPR/Cas9敲除篩選,發(fā)現(xiàn)了參與唾液酸生物合成和相關(guān)糖基化途徑的調(diào)控基因,包括SLC35A1(solute carrier family 35 ember A1)[159]。Kelkar等人開發(fā)了一種混合基因篩選系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)MGAT5(alpha-1,6-Mannosylglycoprotein 6-Beta-N-acetylglucosaminyltransferase)產(chǎn)生的四天線N-聚糖,參與CD8+ T細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞的殺傷[160]?；蚪M篩選也發(fā)現(xiàn)了硫酸乙酰肝素生物合成的新調(diào)控因子KDM2B(lysine demethylase 2B)[161]和ZNF263[162]。

5.2.2 應(yīng)用于糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析的SimpleCell策略 蛋白質(zhì)糖基化分析的最大難點(diǎn)是糖肽的富集,而聚糖的多樣性和異質(zhì)性阻礙了富集的進(jìn)行。目前,已有的富集方法包括凝集素層析[163]和基于酰肼法[164]與硼酸法[165]的化學(xué)富集等方法。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展,可以通過理性糖基化工程從源頭上簡(jiǎn)化或消除糖鏈結(jié)構(gòu)的多樣性和異質(zhì)性,從而實(shí)現(xiàn)糖肽的有效富集。這種簡(jiǎn)化細(xì)胞糖鏈的策略被命名為SimpleCell策略,即利用基因編輯技術(shù),生產(chǎn)能夠合成糖型確定的糖蛋白質(zhì)組的工程化細(xì)胞。該策略通過凝集素層析從細(xì)胞裂解液和分泌組中富集糖肽,并利用高能碰撞誘導(dǎo)解離或ETD模式,通過LC-MS/MS快速靈敏地鑒定糖基化位點(diǎn)[132]。

SimpleCell策略最初被用于N-乙酰半乳糖胺型O-糖基化,通過敲除COSMC(T-synthase-specific molecular chaperone)基因?qū)崿F(xiàn)去O-糖基化,進(jìn)而使O-聚糖被截?cái)喑梢妆荒赜行Р东@的結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)也可用于糖基化位點(diǎn)的鑒定[166]。隨后,SimpleCell策略通過敲除POMGNT1(protein O-linked mannose N-Acetylglucosaminyltransferase 1)實(shí)現(xiàn)O-甘露糖基化糖肽的鑒定,將復(fù)雜的O-甘露糖基化糖鏈簡(jiǎn)化為只含甘露糖殘基的糖肽[167],簡(jiǎn)化后的結(jié)構(gòu)能被ConA凝集素富集,由此發(fā)現(xiàn),鈣粘蛋白和叢狀蛋白超家族蛋白質(zhì)被O-甘露糖基化。這些O-甘露糖基化在囊胚形成過程中對(duì)E-鈣黏著蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附至關(guān)重要[168]。Konstantinidi等人利用基因編輯技術(shù)敲除COSMC或C1GALT1(core 1 synthase, Glycoprotein-N-Acetylgalactosamine 3-Beta-Galactosyltransferase 1)基因獲得HEK293 SimpleCells,用于確定粘蛋白質(zhì)和粘蛋白樣糖蛋白的O-糖結(jié)構(gòu)域,結(jié)果發(fā)現(xiàn),粘蛋白串聯(lián)重復(fù)序列內(nèi)所有潛在糖基化位點(diǎn)上均能被有效地O-糖基化[170]。

然而SimpleCell策略在廣泛應(yīng)用的同時(shí)也存在一些問題。借助基因編輯技術(shù)設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)化糖結(jié)構(gòu)的SimpleCells,在獲取糖基化位點(diǎn)信息的同時(shí)丟失了糖鏈的結(jié)構(gòu)信息[171],并且細(xì)胞中糖基化途徑的遺傳截?cái)嗫赡軙?huì)影響早期的生物合成步驟[172]。對(duì)于前者,非數(shù)據(jù)依賴采集模式的質(zhì)譜分析有望解決這個(gè)問題[173],而對(duì)于后者,目前暫未發(fā)現(xiàn)SimpleCells和野生型細(xì)胞在O-糖蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)的顯著差異。總之,SimpleCell策略的廣泛應(yīng)用大力地推動(dòng)了糖蛋白組學(xué)的發(fā)展。

5.2.3 細(xì)胞糖芯片的構(gòu)建和應(yīng)用 細(xì)胞表面糖類物質(zhì)在細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用方面具有重要作用,并對(duì)免疫細(xì)胞的遷移、胚胎發(fā)育和癌癥轉(zhuǎn)移等過程至關(guān)重要。糖類物質(zhì)通常通過與蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮作用。糖結(jié)合蛋白質(zhì) ( glycan-binding proteins, GBPs ) 主要分為凝集素和糖胺聚糖結(jié)合蛋白質(zhì)。

糖芯片是一種研究GBPs結(jié)合特異性以及蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)相互作用的技術(shù)[174-176],傳統(tǒng)糖芯片通常是通過化學(xué)偶聯(lián)將糖類物質(zhì)固定在特定的基質(zhì)材料上而得,類似于DNA芯片[177-179]。與糖芯片結(jié)合的蛋白質(zhì)通常使用生物素化或熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)。因而可以用于篩選發(fā)現(xiàn)糖結(jié)合蛋白質(zhì),具有樣品用量少和高通量的特點(diǎn)。缺點(diǎn)是傳統(tǒng)糖芯片不能模擬糖復(fù)合物和細(xì)胞表面的自然環(huán)境,細(xì)胞糖芯片彌補(bǔ)了這一不足[180]。通過GT基因的KO/KI獲取具有不同糖基化特征的等基因細(xì)胞文庫,構(gòu)建細(xì)胞糖芯片。細(xì)胞表面聚糖密度、空間排列、與脂質(zhì)或蛋白質(zhì)的附著,以及相互競(jìng)爭(zhēng)的聚糖結(jié)構(gòu)的存在均可顯著影響聚糖的識(shí)別和結(jié)合能力[181],細(xì)胞糖芯片因而可以更好地再現(xiàn)糖鏈在自然條件下的作用狀態(tài),因此,作為傳統(tǒng)糖芯片的互補(bǔ)方法得到廣泛應(yīng)用。

采用一個(gè)人源糖基轉(zhuǎn)移酶基因的CRISPR/Cas9 gRNA庫[182],Narimatsu等人[183]基于CHO細(xì)胞中開發(fā)了一個(gè)糖胺聚糖細(xì)胞文庫,命名為GAGOme。該文庫可用作糖胺聚糖細(xì)胞糖芯片、用于重組表達(dá)含不同糖胺聚糖(GAG)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)聚糖,以及表達(dá)不同結(jié)構(gòu)的GAG鏈用于制備傳統(tǒng)的糖胺聚糖芯片。該團(tuán)隊(duì)[180, 182]構(gòu)建了一個(gè)糖基工程化改造的等基因HEK293細(xì)胞文庫用作細(xì)胞糖芯片,利用該細(xì)胞文庫發(fā)現(xiàn),微生物黏附素與O-聚糖簇斑塊在真實(shí)細(xì)胞環(huán)境下的結(jié)合特征。在這些研究的基礎(chǔ)上,哥本哈根大學(xué)與江南大學(xué)2個(gè)課題組先后[142, 184]利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建了HEK293中的N-和O-糖基化圖譜,將173個(gè)人類GTs分為16個(gè)不同的途徑和主要生物合成步驟,該圖譜將細(xì)胞中GTs的表達(dá)數(shù)據(jù)從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)化為可預(yù)測(cè)的糖基化能力。

硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究極具挑戰(zhàn),作者團(tuán)隊(duì)[185]通過單獨(dú)或組合敲除表達(dá)HS的基因,建立了一個(gè)能夠表達(dá)不同硫酸乙酰肝素結(jié)構(gòu)的小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞文庫,共包含18個(gè)細(xì)胞系。利用該文庫,作者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步闡明了HS對(duì)FGF2-FGFR1(fibroblast growth factor 2-fibroblast growth factor receptor 1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控作用及分子機(jī)制,同時(shí)也確定了抗HS單鏈片段可變區(qū)抗體(single chain fragment variant, scFv)的表位特征。借助該文庫,作者團(tuán)隊(duì)[186]還確定了與Furin結(jié)合的HS結(jié)構(gòu)特征,進(jìn)一步解釋了Furin的工作機(jī)制,為基于Furin的藥物發(fā)現(xiàn)提供了新方向。研究顯示,SARS-CoV2型病毒刺突蛋白通過其受體結(jié)合域(RBD)與細(xì)胞HS相互作用,Clausen等人[187]利用CRISPR-Cas9技術(shù)制備的能表達(dá)不同HS結(jié)構(gòu)的Hep3B細(xì)胞文庫,不僅證實(shí)新型冠狀病毒的附著和侵襲具有HS依賴性,而且確定了與RBD蛋白結(jié)合的HS的結(jié)構(gòu)特征[188],這提供了新的抗病毒治療策略。

5.2.4 蛋白質(zhì)糖基化工程改造與蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞糖基化改造的目的主要是減少糖基化的異質(zhì)性、敲除非人源糖鏈生成基因和生產(chǎn)具有特定糖型的蛋白質(zhì)[189, 190]。

CHO細(xì)胞糖基化系統(tǒng)與人源細(xì)胞類似,目前,大多數(shù)蛋白質(zhì)藥物采用中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細(xì)胞系生產(chǎn)[191, 192]。CHO生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物主要為IgG抗體,IgG 抗體Fc中的一個(gè)保守位點(diǎn) Asn 297的N-聚糖與Fc受體的結(jié)合至關(guān)重要,是抗體功能的決定因素之一[193]。該位點(diǎn)N-聚糖的糖型是抗體與FcγRIIIa結(jié)合的重要因素[194]。其中平分型糖鏈?zhǔn)墙Y(jié)合必須的,而末端的巖藻糖殘基則抑制抗體與FcγRIIIa的結(jié)合,補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用需要末端的半乳糖殘基。敲除FUT8(fucosyltransferase 8)基因的CHO細(xì)胞可以產(chǎn)生無巖藻糖基化修飾的抗體,該抗體能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的抗體依賴細(xì)胞毒作用(antibody dependent cytotoxicity, ADCC)[190, 195, 196]。第一個(gè)實(shí)現(xiàn)FUT8基因敲除的CHO細(xì)胞系是通過靶向同源重組產(chǎn)生的,這種方法需要篩選鑒定超過10 000個(gè)CHO克隆才能獲得敲除細(xì)胞[196],而基于CRISPR-Cas的精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)能夠快速構(gòu)建基因突變細(xì)胞系[197]。利用基因編輯技術(shù)分別構(gòu)建FUT8和β4GALT1(beta-1,4-galactosyltransferase 1)分別敲除和雙敲除的CHO細(xì)胞系,這些細(xì)胞可以用以生產(chǎn)不同半乳糖修飾和巖藻糖修飾的抗體[198]。利用CRISPR-Cas9技術(shù)也構(gòu)建了UDP-Gal-4-epimerase(Gale)和GDP-L-fucose synthase(Fx)分別敲除和雙敲除的CHO細(xì)胞系,這些細(xì)胞不能合成UDP-Gal或/和GDP-Fuc,也可以用于生產(chǎn)不同半乳糖修飾和巖藻糖修飾的抗體[199]。除了上述的2種N-聚糖修飾,N-聚糖的唾液酸化可能影響免疫調(diào)節(jié)功能和循環(huán)半衰期。人HEK293-T細(xì)胞能產(chǎn)生α2-3-和α2-6連接唾液酸的混合物,大多數(shù)可溶性糖蛋白質(zhì)(包括IgG)表達(dá)α2-6連接唾液酸[190]。研究顯示,具有α-2,6唾液酸化的免疫球蛋白G對(duì)抗體依賴性細(xì)胞毒性和抗炎功效有影響[200, 201]。因此,設(shè)計(jì)勻質(zhì)α2-6-唾液酸化糖型的IgG抗體有助于介導(dǎo)抗炎作用并改善血清半衰期。然而,由于CHO細(xì)胞中僅存在α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶[202],且唾液酸轉(zhuǎn)移酶不能修飾重鏈N-聚糖,因此,難以改造生成α-2,6唾液酸化抗體。過表達(dá)α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6Gal1基因編碼, ST6 Beta-Galactoside Alpha-2,6-Sialyltransferase 1),同時(shí)使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除ST3GAL4(ST3 Beta-Galactoside Alpha-2,3-Sialyltransferase 4)和ST3GAL6(ST3 Beta-Galactoside Alpha-2,3-Sialyltransferase 6)基因,在CHO細(xì)胞系中成功生成α-2,6唾液酸化IgG抗體[203]。雖然CHO細(xì)胞確實(shí)能產(chǎn)生安全有效的糖蛋白質(zhì)藥物,但由于所得N-聚糖的異質(zhì)性使得質(zhì)量難以控制[204]。目前,CHO基因工程正朝著增強(qiáng)糖基化能力,減少異質(zhì)性的方向前進(jìn),而精確基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了這一進(jìn)程[205]。Zhang等人[206]采用基因編輯技術(shù)敲入/敲除了CHO細(xì)胞N-糖基化途徑的關(guān)鍵的19個(gè)GTs基因,構(gòu)建了相應(yīng)的細(xì)胞株,這使得生產(chǎn)特定糖基化修飾的糖蛋白質(zhì)成為可能。HEK293的糖基化工程細(xì)胞文庫也可以用于特定糖型蛋白質(zhì)的表達(dá)[142][184]。

6 問題與展望

CRISPR-Cas系統(tǒng)作為最具潛力的基因編輯工具,在遺傳疾病治療上有著顯著優(yōu)勢(shì),并且已經(jīng)在臨床前和臨床治療中得到了廣泛的應(yīng)用[207]。CRISPR-Cas基因組編輯也是創(chuàng)建用于人類遺傳疾病研究和治療動(dòng)物模型的強(qiáng)大工具[208]。CRISPR-Cas等精確基因編輯技術(shù)也為糖生物學(xué)研究提供了新工具,為基礎(chǔ)糖生物學(xué)研究及糖類相關(guān)疾病治療開辟了新道路。例如,基因編輯技術(shù)為治療用重組糖蛋白質(zhì)的提質(zhì)增效提供了新手段。然而,作為一種新工具,CRISPR-Cas仍然還存在許多問題亟待解決:(1)傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)依賴于DSB,無法實(shí)現(xiàn)堿基水平的插入、刪除和替換,最近幾年新興的CRISPR工具雖然克服了上述限制,但仍然無法擺脫其自身毒性。由于這些工具對(duì)于基因的調(diào)控在DNA水平,一旦出現(xiàn)錯(cuò)誤編輯,其傷害是終身甚至可遺傳性的。(2)CRISPR的精準(zhǔn)靶向遞送仍然是一個(gè)難點(diǎn),其主要障礙包括低遞送效率和缺乏組織特異性,這嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。目前,應(yīng)用最多的基于AAV和LNP遞送策略,其受載量、自身免疫原性、易受到達(dá)靶細(xì)胞前被循環(huán)系統(tǒng)清除等限制。EV憑借其體內(nèi)生物相容性和穩(wěn)定性方面等許多優(yōu)勢(shì),在一定程度上比AAV和LNP具有優(yōu)勢(shì),隨著EV攝取、釋放和加工等機(jī)制的進(jìn)一步闡明,EV遞送 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用將會(huì)得到更加廣泛。(3)新的CRISPR系統(tǒng)仍在不斷被發(fā)現(xiàn),除了高編輯效率的Cas9系統(tǒng)、迷你型Cas12f系統(tǒng)和專門用于RNA編輯的Cas13系統(tǒng),未來可能還有發(fā)現(xiàn)更多功能特異的CRISPR系統(tǒng)。因此,亟需對(duì)各類系統(tǒng)進(jìn)行更加深入的研究。(4)CRISPR-Cas等精確基因編輯技術(shù)的發(fā)展為糖類物質(zhì)的生物合成機(jī)制、結(jié)構(gòu)與功能研究和特定糖型糖復(fù)合物的生產(chǎn)帶來了新機(jī)會(huì),為基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化糖科學(xué)研究創(chuàng)造了新機(jī)遇,未來需要更好地利用基因編輯技術(shù)開展合成糖生物學(xué)研究,實(shí)現(xiàn)格物致知向造物致知的轉(zhuǎn)變,同時(shí)也開展糖基化異常疾病的基因治療。