林凡力，彭建斐，鄧澤征，郭璐璐，姚廷山，馬皓月，馬冠華

（1西南大學植物保護學院，重慶 400716；2湖南省煙草公司懷化市公司，湖南懷化 418000）

0 引言

煙草野火病(Tobacco Wildfire)是細菌性葉部病害，由丁香假單胞桿菌煙草致病變種Pseudomonas syringaepv.tabaci引起，多集中于煙草幼苗階段與大田階段發(fā)病。該病害初發(fā)生時為水浸小斑點，外緣有黃色暈圈，溫濕度適宜時形成無規(guī)則的褐色輪紋斑，后期病斑相連成片，形成近圓形或無規(guī)則大病斑；該病害可導致煙草煙葉大面積死亡或腐爛，仿佛火灼燒狀。WOLF 等[1]1917 年首次報道該病害在美國煙區(qū)發(fā)生，之后各國陸續(xù)有報道。20 世紀中期該病害在中國就有零星發(fā)生，到80年代中后期已在多個省(區(qū))大流行，并從次要病害上升為主要病害，尤其在四川、云南等產(chǎn)煙區(qū)，該病害連年發(fā)生且為害嚴重[2-6]。中國對煙草野火病研究多集中于病害流行學[7]、病菌致病性[8-9]、毒素及抗藥性[10-12]等方面。該病原菌存在生理分化現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為對長花煙與黃花煙的致病性差異。云南[13]、黑龍江和吉林三省[14-15]報道過煙草野火病菌遺傳多樣性研究，分子標記是研究真菌遺傳多樣性和種群結構的重要手段，可有效研究病菌與地理環(huán)境或寄主之間的關聯(lián)。多位點序列分型(MLST)技術是近年流行的基于核酸序列測定細菌分型的方法，具有重復性強，分辨率高等優(yōu)點，是一種更準確的分型系統(tǒng)方法，多應用于人體病原細菌研究，可比對分析各菌株間顯著保守性表現(xiàn)的管家基因堿基分布改變。明晰病菌的遺傳多樣性可揭示同種病菌不同區(qū)系之間的遺傳和進化，了解和掌握病菌遺傳結構和多樣性水平可為有效防治措施制定和品種選育提供強力支撐，為病菌的生物學特性研究提供新視角[13]。因此，筆者收集了湖南、重慶等5 個?。ㄊ校煵菀盎鸩【捎枚辔稽c序列分型技術研究煙草野火病菌菌株之間的遺傳多樣性，以期為該病害的有效防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從湖南、重慶、四川、黑龍江、吉林等5個煙草種植?。ㄊ校┎杉療煵菀盎鸩?，分離野火病菌。供試煙草品種為‘云煙87’，玉溪中煙種子有限責任公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及致病性測定病樣采用組織分離法分離病原菌[16]，純化保存?zhèn)溆?。‘云?7’煙草種子播種于滅菌土壤中，培育至3片真葉苗，移栽至無菌蛭石營養(yǎng)缽，放置于25℃溫室光照培養(yǎng)，在煙苗5～7 片真葉期，使用注射器在葉片背面接種3.0×108cfu/mL 待測病菌菌懸液，完成柯赫氏法則證病。

1.2.2 病原菌分子鑒定按細菌DNA 快速抽提試劑盒說明[17]，提取煙草野火病菌DNA，PCR 用細菌16srDNA常 規(guī) 引 物27F/1492R(27F： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3'，1492R： 5'-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3'[14])?？偡磻w積為50 μL：ddH2O 37 μL，10×PCR buff 5 μL，2.5 mol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L Primer (+) 1 μL，10 μmol/L Primer(-)(10μmol/L)1μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶1μL，30 ng/μL DNA模板1μL。

PCR反應程序：95℃，預變性5 min；每一個循環(huán)為94℃變性0.5 min，60℃，退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，PCR放置產(chǎn)物4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

擴增產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司測序，應用DNA Star軟件得到16s-rDNA序列，提交至NCBI比對，進行病原菌分子鑒定。

1.2.3 病菌遺傳多樣性 從NCBI 網(wǎng)站下載JWJF01000000 野火病菌菌株的基因組序列，找到11個管家基因的序列[18]，提交上海生工生物工程有限公司使用primer 5.0軟件設計引物，PCR篩選較優(yōu)管家基因及退火溫度，最終優(yōu)選3 個管家基因（表1），進行MLST分析。

表1 JWJF01000000野火病菌菌株基因組中7個管家基因的功能和引物序列

DNA提交華大基因科技股份有限公司測序后，運用DNA Star雙向拼接并校對。應用DANMAN軟件多序列比對管家基因PCR 產(chǎn)物的若干堿基序列，確定“菌株的序列型(ST)”；登陸http://www.eBURST.mlst.net/，應用eBURST V3 軟件，以Gap、Pgi及Pfk基因標準，繪制供試菌株種群遺傳關系圖譜。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離與鑒定

共采集病樣112 份，分離獲得疑似煙草野火病菌菌株160株，菌株來源分別為四川40株，湖南20株，重慶40 株，吉林40 株，黑龍江20。按照柯赫氏法則驗證，其中144 株為煙草野火病菌Pseudomonassyringaepv.tabaci。

2.2 病原菌分子鑒定

DNA快速抽提試劑盒提取144株菌株DNA，選擇細菌通用引物27F/1492R，PCR 擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到1 條約為600 bp 清晰條帶。測序拼接得到該部分的基因序列，序列大小為589 bp（見圖1）。

圖1 部分煙草野火病病原菌基因組DNA的16s-rDNA PCR擴增

BLAST分析結果表明，144株菌株序列P.syringae(CP000075.1)和P.amygdale(CP020351.1)相似性達到99%以上，結合致病性檢測結果，分離獲得的144株菌株鑒定為煙草野火病菌P.syringaepv.tabaci。

2.3 多位點序列分型

2.3.1Gap基因eBURST V3 分析結果表明（參照Gap基因標準），待測煙草野火病菌株均屬于同一亞群以及ST85 這一單獨群。除了單獨的29 個ST，待測菌株構建4 個CC，即CCl（77 個ST 組成）、CC2（10 個ST 組成）、CC3（3 個ST 組成）和CC4（2 個ST 組成）（見圖2）。

圖2 共享Gap基因標準下煙草野火病菌種群結構

2.3.2Pgi基因eBURST V3分析結果表明（參照Pgi基因標準），待測煙草野火病菌株歸至亞群1～亞群5及4個單一群。亞群1包含58個ST，核心型為ST43，菌株11 株，其中吉林5 株，四川4 株，湖南2 株；亞群2 包含18 個ST，核心型為ST66，菌株5 株，其中重慶3 株，四川2株；亞群3包含4個ST；亞群4包含4個ST，均來自黑龍江；亞群5 包含2 個ST，均來自四川。4 個單一群菌株則分別來自湖南、吉林、重慶與四川。

亞群1 中的ST 構建出CCl、CC2 這2 個同源復合體（除去ST9、ST14、ST30、ST39、ST51、ST73、ST82、ST84），其中CC2 含有3 個ST，分別為ST72、ST74 和ST76。亞群2 中的ST 形成2 個CCl、CC2（除去ST4、ST6、ST8、ST65、ST69、ST71），CC2 含有2 個ST，分別為ST17和ST64（見圖3）。

圖3 共享Pgi基因標準下煙草野火病菌種群結構

2.3.3Pfk基因eBURST V3分析表明（參照Pfk基因標準），供試菌株聚集于亞群1、亞群2、亞群3、亞群4 及30 個單一群。亞群1 為CCl、亞群2 為CC2、亞群3 為CC3，而ST6、ST7、ST8、ST9等均為單一群（圖4）。

圖4 共享Pfk基因標準下煙草野火病菌種群結構

綜合分析結果，基于Gap基因標準，供試煙草野火病菌菌株僅1 個亞群與單一群，菌株間的多態(tài)性以及差異性較??；基于Pfk基因標準，由于過多單一群，亞群和單一群間的遺傳差異性也較小；而基于Pgi基因標準的分型較好，ST間的遺傳性差異較大，分為優(yōu)勢亞群1和亞群2。亞群1中核心ST型ST43為中國主要種群，來自四川、湖南、吉林。亞群2中核心ST型ST66來自四川與重慶。同一核心型菌株間不存在顯著相關性。

2.4 煙草野火病病菌分型關聯(lián)分析

對中國東北和南部片區(qū)采集病樣分離純化鑒定的煙草野火病菌進行亞群劃分分析，結果表明南北方煙草野火病菌ST 型的差異不明顯，而亞群4 較為特殊，其包含的菌株均來自東北，推測這些菌株由同種ST型發(fā)展蔓延而來。試驗采集的病樣來自西南地區(qū)主栽品種云煙87，東北地區(qū)主栽品種吉煙9 號和龍江911，分析發(fā)現(xiàn)，亞群1 和亞群2 的核心ST 型包含的煙草品種不同，相同ST型可能來自不同的煙草品種，而不同ST型也可能來自同一煙草品種（表2），推測煙草品種與病菌組群間無關聯(lián)性。

表2 煙草野火病菌的MLST分型關聯(lián)分析

3 結論與討論

中國主栽煙草品種多數(shù)不抗煙草野火病，該病防控較困難[18-19]。目前，選育優(yōu)質(zhì)抗野火病品種是防治該病害最有效的方法，而明確其病菌遺傳多樣性是抗病品種選育的前提[20-23]。中國各地煙草野火病菌ST型不同，同一ST 型可能會誘導病害大面積發(fā)生，目前因環(huán)境、人為因素等的影響，已進化發(fā)展為不同的ST型[24]。

本試驗中，煙草野火病菌遺傳多樣性分析的144株菌株，來自四川、重慶、湖南、吉林及黑龍江5省（市）的3 個煙草品種，地理跨度較大。Pgi基因標準條件下，供試菌株分為5個亞群和4個單一群，其中，亞群1內(nèi)的ST 型數(shù)量最多，其核心型菌株來源3 個省，菌株分布較廣，不存在區(qū)域優(yōu)勢；亞群2 內(nèi)的ST 型數(shù)量次之，其核心型菌株來自兩個省，各菌株關系松散，不在同一CC上；亞群5內(nèi)的ST型數(shù)量最少，菌株皆來自四川；而4 個單一群菌株分別來自吉林、湖南、重慶與四川4個省（市），結果表明，煙草野火病菌組群劃分同煙草品種不存在關聯(lián)。

以煙草野火病菌來源的地域分析，試驗所用的供試菌株主要來自中國東北與西南，地理跨度較大，結果表明，優(yōu)勢亞群1 和亞群2 囊括了來自吉林、湖南、重慶、四川及黑龍江5 個區(qū)域的菌株，菌株ST 型無明顯差異。亞群分析結果表明，亞群1的核心型ST來自吉林、四川、湖南，說明亞群1所包含的菌株分布較廣，不存在區(qū)域優(yōu)勢；亞群2 核心型ST 源于四川和重慶，但亞群內(nèi)各菌株關系松散，不在同一CC 上；亞群4 的所有ST型菌株均來自東北。

煙草品種來看，亞群1 和亞群2 的核心ST 型來源的煙草品種不同，表明相同ST型可來自不同的煙草品種，不同ST 型也可能存在于相同煙草品種，說明煙草野火病菌組群劃分同煙草品種不存在相關性。陳赟娟等[25]結果表明，煙草野火病菌群體致病性存在差異，來源地也不同，兩者之間無關聯(lián)性。劉雅婷等[13]發(fā)現(xiàn)，云南煙草野火病菌群體遺傳多樣性突出。夏緯躍等[26]發(fā)現(xiàn)，吉林省轄區(qū)內(nèi)70株煙草野火病菌在區(qū)域上的遺傳多態(tài)性豐富。本試驗研究結果與之類似，供試煙草野火病菌存在豐富的遺傳多樣性。