付瑤,黃宗瑤,劉洋

610054 成都,電子科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院(付瑤);610041 成都,四川省腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,四川省腫瘤醫(yī)院·研究所,四川省癌癥防治中心,電子科技大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 病理科(付瑤、黃宗瑤、劉洋)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM;WHO 4級(jí))是最具侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤,患者中位生存期為14.5～16.6個(gè)月[1-4]。GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是最大限度安全手術(shù)切除和化療或放療,然而在過(guò)去的10年中,已有的治療手段不能實(shí)現(xiàn)最佳緩解,GBM患者的預(yù)后仍然沒(méi)有改善[5],治療失敗的主要原因是腫瘤的異質(zhì)性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)[6-7]。對(duì)GBM樣本的遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示了GBM的分子異質(zhì)性。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤至少可以分為前神經(jīng)元型、經(jīng)典型和間充質(zhì)型[8]。最近的scRNA-seq分析進(jìn)一步確定了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以不同的細(xì)胞狀態(tài)存在,包含異質(zhì)性亞群,包括放射狀膠質(zhì)樣腫瘤干細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞,這些細(xì)胞類型與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和侵襲有關(guān)[9-11]。這些數(shù)據(jù)集為我們探索和識(shí)別GBM發(fā)展所必需的新的分子調(diào)控因子提供了豐富的資源。鈣調(diào)蛋白3(calponin 3,CNN3)屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的鈣調(diào)蛋白家族,通過(guò)與f-肌動(dòng)蛋白結(jié)合影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和肌動(dòng)球蛋白相互作用。在之前的研究中,CNN3已被證明在多種癌癥類型中促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,如骨肉瘤、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃腫瘤和結(jié)腸腫瘤,可能是通過(guò)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和治療抵抗[12-16]。然而,CNN3是否以及如何影響GBM患者的腫瘤發(fā)展和預(yù)后尚不清楚。因此,在本研究中,我們利用各種公開(kāi)的多組學(xué)數(shù)據(jù)集系統(tǒng)地評(píng)估了CNN3在GBM中的作用,并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)集分析

為了對(duì)CNN3 mRNA表達(dá)進(jìn)行泛癌分析,我們從UCSC公共中心的GDC泛癌數(shù)據(jù)庫(kù)下載了包含轉(zhuǎn)錄組譜和預(yù)后數(shù)據(jù)的泛癌隊(duì)列(https://xenabrowser.net/datapages/), 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.nih.gov/)下載批量RNA-seq數(shù)據(jù)集或微陣列數(shù)據(jù)和多種腫瘤類型患者的臨床信息,并利用CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.nih.gov/)和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)(GSE7696)進(jìn)行進(jìn)一步分析[17]。隨后,我們使用GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TCGA-GBM隊(duì)列[18]中各亞型GBM中CNN3 mRNA的表達(dá)情況。對(duì)于CGGA數(shù)據(jù)庫(kù),我們進(jìn)一步按膠質(zhì)瘤類別提取GBM樣本進(jìn)行后續(xù)生存分析。我們從UCSC Cell Browser(http://gbm.cells.ucsc.edu)下載Bhaduri等[9]已發(fā)表的GBM scRNA-seq數(shù)據(jù)集,并計(jì)算每種細(xì)胞類型中CNN3的表達(dá)。我們利用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/)分析CNN3和HDAC1蛋白在多種腫瘤類型中的表達(dá)。我們從CPTAC(https://proteomics.cancer.gov/programs/cptac)數(shù)據(jù)庫(kù)下載了Wang等[19]已發(fā)表的GBM相關(guān)的蛋白組學(xué)數(shù)據(jù),進(jìn)而分析了在GBM樣本及其配對(duì)癌旁樣本中CNN3蛋白水平的表達(dá)情況。我們從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載Lo Cascio等[20]已發(fā)表的在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioblastoma stem cells,GSCs)通過(guò)shRNA 敲低HDAC1基因的RNA-seq數(shù)據(jù),包括BT145、BT187和GB3 3種GSCs,并計(jì)算各組中CNN3的表達(dá)量。

1.2 生存分析

通過(guò)對(duì)公共數(shù)據(jù)集中所有樣本的每個(gè)CNN3 mRNA表達(dá)值進(jìn)行迭代,獲得最佳截點(diǎn)。采用survminer R包繪制生存曲線。

1.3 相關(guān)性分析

我們計(jì)算了基因表達(dá)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。采用ggplot2包[21]對(duì)散點(diǎn)圖進(jìn)行可視化。

1.4 基因富集分析

我們首先計(jì)算TCGA GBM隊(duì)列中每個(gè)基因與CNN3的相關(guān)性,并通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)將所有基因按降序排列,作為后續(xù)分析的輸入。采用GSEA軟件(v 4.0.3,http://www.broadinstitute.org/gsea)進(jìn)行GSEA分析。采用P調(diào)整值和標(biāo)準(zhǔn)化富集評(píng)分量化統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和富集程度。通過(guò)GSEA軟件[22]對(duì)KEGG通路進(jìn)行富集分析。

1.5 差異分析

根據(jù)CNN3表達(dá)值的中位數(shù),將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。然后對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,獲得在高表達(dá)組中表達(dá)尤其高的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),并使用limma R包鑒定[23]。使用log2倍變化(FC)值> 5和校正的P值<0.01來(lái)鑒定上調(diào)的DEGs。

1.6 基因本體富集分析

使用clusterProfiler R軟件包進(jìn)行GO富集分析,Benjamini-Hochberg校正P<0.01認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[22]。利用dotplot函數(shù)將GO Biological Process富集結(jié)果可視化。

1.7 計(jì)算上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)標(biāo)志評(píng)分

我們從Zeng等[24]發(fā)表的研究中收集了EMT特征基因列表。對(duì)于給定的樣本,使用基于簽名基因列表的默認(rèn)參數(shù)GSVA包[25]計(jì)算ssgsea標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)分。采用ggplot2包[21,25]對(duì)箱線圖進(jìn)行可視化。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)

U87細(xì)胞系是一種GBM細(xì)胞系,它維持在補(bǔ)充有10% FBS(Gibco;Thermo Fisher Scientific,Inc.),50 U/mL青霉素和50 mg/mL鏈霉素的DMEM(Invitrogen;Thermo Fisher Scientific,Inc.)。將細(xì)胞置于含5%CO2的37℃環(huán)境中培養(yǎng)。

1.9 shRNA質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

我們按照多重生物信息規(guī)律,設(shè)計(jì)了兩個(gè)寡核苷酸(shRNA1和shRNA2)作為CNN3 mRNA的靶基因,一個(gè)寡核苷酸(scramble) 標(biāo)識(shí)對(duì)照組構(gòu)建的亂序序列,作為空白靶基因,不能靶向到人類任何已知基因。CNN3 shRNA 靶向序列示意圖: shRNA1: 5′-GCAGAAGAAGATCTTCGCAAT-3′;shRNA2: 5′-GACCACAATTAGTCTGCAGAT-3′;scramble: 5′-GCAGGTAACGCGACTATAAAT-3′。這些shRNA是由青島生物技術(shù)公司(北京)合成的。將shRNA序列克隆到攜帶嘌呤霉素耐藥基因的pLentiV2T載體中。每個(gè)shRNA由一個(gè)獨(dú)特的人類U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

1.10 慢病毒組裝和感染U87細(xì)胞株

通過(guò)磷酸鈣沉淀的方法在293T細(xì)胞中組裝并收獲攜帶質(zhì)粒的慢病毒,并通過(guò)Lenti-X Concentrator(Takara)進(jìn)行濃縮。將U87細(xì)胞培養(yǎng)于包被的6孔板中,首先用100 μL攜帶PLKO1-shRNA1、PLKO1-shRNA2或PLKO1-scramble的濃縮慢病毒感染細(xì)胞。在含1 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。qPCR檢測(cè)細(xì)胞中CNN3的mRNA表達(dá)水平。

1.11 RNA提取和qRT-PCR

使用Trizol試劑(Thermo Fisher Scientific)從U87細(xì)胞系中純化總RNA。每個(gè)樣本2 μg RNA用含gDNase (Tiangen)的FastKing RT Kit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,在iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix(BioRad)中制備,用BioRad CFX96 Touch Real-Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分析。用于qPCR的引物列表如下: CNN3-cDNA-F(primer1): 5′-GCAGGGATGTTAGCACCAGGTA-3′;CNN3-cDNA-R(primer1): 5′-CTGTTCCTTGGCTTCCGTTGTG-3′;CNN3-cDNA-F(primer2): 5′-TTACGGGACTAGGAGGCATCT-3′;CNN3-cDNA-R(primer2): 5′-CCGGCTGTAATGTTAGCTTCTG-3′;GAPDH-cDNA-F: 5′-CATGGGTGTGAACCATGAGA-3′;GAPDH-cDNA-R: 5′-CAGTGATGGCATGGACTGTG-3′。

1.12 克隆形成試驗(yàn)

為了測(cè)定對(duì)照組以及兩種CNN3敲低組(shRNA1 和 shRNA2)在U87 細(xì)胞系上的克隆形成能力,每組各2 000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)至有明顯菌落形成。采用晶體紫染色(Beyotime生物技術(shù)),對(duì)每個(gè)孔中的克隆總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)和比較。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1．5 治療與隨防 確診CH后立即給予優(yōu)甲樂(lè)（左旋甲狀腺素鈉）替代治療。藥物治療2周后復(fù)查血清甲狀腺功能，根據(jù)指標(biāo)調(diào)整藥物劑量，并定期隨防。隨防期間給予甲狀腺B超檢查、體格發(fā)育和心理發(fā)育評(píng)估等。PKU患兒給予低／無(wú)苯丙氨酸奶粉或食物治療；BH4缺乏癥補(bǔ)充BH4和神經(jīng)遞質(zhì)前質(zhì)（多巴和5－羥色氨），定期隨訪監(jiān)測(cè)血中Phe濃度在理想范圍，并定期評(píng)估體格發(fā)育、智能發(fā)育。其它遺傳代謝病根據(jù)具體疾病給予飲食控制、左旋肉堿、維生素B12等。隨防期間定期監(jiān)測(cè)血中相應(yīng)氨基酸譜、酯酰肉堿濃度，評(píng)估體格與智能發(fā)育。

1.13 Transwell實(shí)驗(yàn)

在24孔Transwell系統(tǒng)中,通過(guò)Transwell?滲透性支撐試驗(yàn)(聚碳酸酯膜,康寧)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。將懸浮于無(wú)血清DMEM中的U87細(xì)胞(1×105)加入上室,將10% FBS DMEM加入下室。10 h后用多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色。將侵襲的細(xì)胞在顯微鏡下成像,用圖像測(cè)量結(jié)晶紫染色強(qiáng)度,每組至少測(cè)量6個(gè)成像視野并進(jìn)行比較。

1.14 關(guān)鍵基因分層簇中的藥物發(fā)現(xiàn)

查詢癌癥藥物敏感性基因組學(xué)(genomics of drug sensitivity in cancer,GDSC)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cancerrxgene.org),根據(jù)CNN3的表達(dá)情況,尋找在不同組中表現(xiàn)出不同療效的候選藥物。我們篩選了癌癥細(xì)胞系百科全書(CCLE)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://portals.broadinstitute.org/ccle)中的所有細(xì)胞系,只保留了GBM細(xì)胞系。根據(jù)CNN3表達(dá)值的中位數(shù)將所有細(xì)胞系分為高、低表達(dá)組,比較各組間藥物反應(yīng)的AUC的差異。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 4.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)變量比較采用Student’st檢驗(yàn)。所有P值均為雙側(cè),顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。在圖中,使用的是標(biāo)準(zhǔn)符號(hào):**P<0.001和***P<0.0001。

2 結(jié) 果

2.1 在GBM中CNN3高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)

我們首先使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行泛癌分析,比較不同腫瘤類型和配對(duì)正常組織中CNN3的mRNA表達(dá)。CNN3在GBM、低級(jí)別膠質(zhì)瘤、肉瘤和皮膚黑色素瘤中顯著上調(diào)(圖1A)。在這些腫瘤中,CNN3在GBM中上調(diào)最為顯著,其高水平表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)(圖1B)。我們進(jìn)一步分別使用CGGA GBM隊(duì)列以及Murat等[17]已發(fā)表GBM數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立的驗(yàn)證,該結(jié)果與TCGA結(jié)果一致(如圖1C)。在CGGA數(shù)據(jù)集中,我們還觀察到隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的提高,CNN3表達(dá)量也隨之增加的趨勢(shì)(圖1D)?？紤]到GBM的異質(zhì)性,我們根據(jù)分子類型(包括前神經(jīng)元型、經(jīng)典型和間充質(zhì)型)對(duì)TCGA GBM隊(duì)列進(jìn)行了細(xì)分,發(fā)現(xiàn)CNN3在所有分子亞型均上調(diào)(圖1E)。來(lái)自單細(xì)胞分析的GBM scRNA-seq數(shù)據(jù)集也表明,CNN3在多種細(xì)胞群中高表達(dá),其中包括已被證明在GBM中介導(dǎo)侵襲表型的腫瘤干細(xì)胞-類似于胚胎神經(jīng)干細(xì)胞放射狀膠質(zhì)細(xì)胞以及已證明可以作為GBM 起始細(xì)胞的少突前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells,OPC)[9](圖1F)。為了檢驗(yàn)CNN3在蛋白水平是否也在GBM中上調(diào),我們分析了Wang等[19]和HPA公共數(shù)據(jù)集的蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組化數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)從蛋白水平仍然可以看到CNN3在腫瘤組織中顯著高于匹配的正常組織(圖1G、H)。

圖1 GBM中CNN3高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)

2.2 CNN3促進(jìn)GBM細(xì)胞的增殖和侵襲

為了研究CNN3在GBM中的功能,我們鑒定了TCGA GBM樣本中與CNN3表達(dá)相關(guān)的基因,并進(jìn)行了GSEA分析。我們發(fā)現(xiàn)這些基因在已報(bào)道的腫瘤相關(guān)通路中富集,包括PI3K_AKT_MTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路以及腫瘤侵襲和遷移基因集(圖2A)[26-27]。我們進(jìn)一步分析了CNN3與增殖和侵襲相關(guān)的單個(gè)基因,如PCNA、VIM、CD44和SMAD1的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)存在強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系(圖2B)。此外,我們對(duì)CGGA GBM隊(duì)列中CNN3高表達(dá)組中高表達(dá)基因進(jìn)行了功能富集分析。這些基因主要參與組蛋白修飾、正向細(xì)胞周期調(diào)控、EMT生物學(xué)過(guò)程調(diào)控,與GSEA分析一致(圖2C)。我們還發(fā)現(xiàn),在CGGA GBM樣本中,CNN3高表達(dá)組的EMT評(píng)分遠(yuǎn)高于CNN3低表達(dá)組(圖2D)。這些數(shù)據(jù)表明,CNN3的高表達(dá)與GBM的增殖和遷移/侵襲增加相關(guān)。

圖2 CNN3促進(jìn)GBM細(xì)胞的增殖和侵襲

為了驗(yàn)證這一結(jié)論,我們?cè)赨87 GBM細(xì)胞中進(jìn)行了shRNA敲除實(shí)驗(yàn)。我們?cè)O(shè)計(jì)并選擇了兩個(gè)針對(duì)CNN3的shRNA,并通過(guò)RT-qPCR在U87細(xì)胞中驗(yàn)證了敲除效率(圖3A)。接下來(lái),我們對(duì)CNN3敲除組和對(duì)照組進(jìn)行功能分析。克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,CNN3敲除的U87細(xì)胞的克隆形成能力明顯低于對(duì)照組(圖3B,P<0.05)。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,CNN3敲除的U87細(xì)胞的遷徙能力明顯低于對(duì)照組(圖3C,P<0.05)。這些結(jié)果支持CNN3促進(jìn)GBM細(xì)胞的增殖和遷移。

圖3 shRNA敲除實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

2.3 HDAC1是CNN3的候選上游調(diào)控基因

圖4 HDAC1是CNN3的候選上游調(diào)控基因

2.4 GBM治療中抗CNN3藥物的預(yù)測(cè)療效

為了確定GBM治療中可能對(duì)CNN3有效的潛在藥物,我們使用了GDSC數(shù)據(jù)庫(kù)中的預(yù)測(cè)模型。采用劑量-AUC評(píng)估藥物反應(yīng)。在GDSC數(shù)據(jù)庫(kù)中,共有257種化合物在GBM細(xì)胞系上進(jìn)行了測(cè)試。在這些化合物中,GSK269962A(一種選擇性ROCK抑制劑)和TANESPIMYCIN(一種由抗腫瘤抗生素格爾德霉素衍生而來(lái)的苯醌類抗腫瘤抗生素)被預(yù)測(cè)對(duì)CNN3高表達(dá)的GBM細(xì)胞最有效(圖4F)。這些結(jié)果為CNN3在GBM治療中的潛在靶點(diǎn)提供了見(jiàn)解(圖4G)。

3 討 論

GBM是一種具有高度侵襲性的腦腫瘤,在目前的治療手段下預(yù)后較差[5]。治療失敗的主要原因是腫瘤的異質(zhì)性和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。確定調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的分子通路和藥物靶點(diǎn)對(duì)延長(zhǎng)患者生存期和改善其生活質(zhì)量至關(guān)重要[1-2,7]。

既往的研究表明,CNN3在各種類型的腫瘤中發(fā)揮了重要作用。Dai等[12]研究表明,在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中觀察到CNN3的高表達(dá),CNN3表達(dá)沉默可以抑制體內(nèi)皮下腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。Nair等[14]證明CNN3與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和治療抵抗作用有關(guān)。此外,CNN3還被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)胃癌中阿索魯比辛的細(xì)胞入侵和對(duì)治療的抵抗作用[13]。Xu等[32]報(bào)道,在TCGA中,CNN3的高表達(dá)預(yù)示著所有膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后。然而,該研究沒(méi)有區(qū)分低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤,也沒(méi)有提供機(jī)制分析。由于GBM和低級(jí)別膠質(zhì)瘤是由獨(dú)特的驅(qū)動(dòng)突變組合驅(qū)動(dòng)的本質(zhì)不同的疾病,因此這種全膠質(zhì)瘤分析的臨床意義有限。此外,在Xie等[33]的研究證實(shí)了CNN3對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和入侵的促進(jìn)作用,但沒(méi)有對(duì)可能的分子機(jī)制進(jìn)行深入分析以及可能用于GBM治療的靶向治療藥物。

本研究以GBM樣本為研究對(duì)象,在轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、單細(xì)胞等多維度數(shù)據(jù)中比較了CNN3在GBM和正常組織中的表達(dá),建立了其在不同GBM亞組和細(xì)胞類型中的表達(dá)模式,并建立了CNN3高水平表達(dá)與GBM不良預(yù)后的相關(guān)性。我們還功能性驗(yàn)證了CNN3在促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖和侵襲中的作用,并確定了一個(gè)潛在的候選分子上游調(diào)控因子HDAC1。如果我們進(jìn)一步在其他細(xì)胞系和體內(nèi)模型中測(cè)試HDAC1和CNN3之間的相互作用,將有助于我們的研究。此外,我們預(yù)測(cè)了兩種小分子藥物的療效,可用于未來(lái)GBM的治療。

在本研究中,雖然我們使用多個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)解釋了CNN3在GBM中的表達(dá)模式,并在U87細(xì)胞中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,但本實(shí)驗(yàn)僅基于細(xì)胞系以及公共數(shù)據(jù)集的分析,未來(lái)還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證CNN3在動(dòng)物模型中對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的促進(jìn)作用,以及上下游基因的敲低對(duì)腫瘤增殖、侵襲和對(duì)藥物治療的影響。此外,我們利用GDSC數(shù)據(jù)庫(kù)確定了2種可能用于GBM治療的小分子藥物,但需要更多的藥物治療實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證我們的研究結(jié)果。

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