王雷 唐秋梅 黃寶純 劉宇凡 楊光勇 何光志

自啤酒進入我國后，其市場份額呈現爆發(fā)式增長，在促進經濟增長的同時，也被大多數人接受和喜愛。然而，隨著生活節(jié)奏日益加快和工作壓力持續(xù)增長，人們的飲酒率持續(xù)上漲，由于過度飲酒導致的消化道疾病、心血管疾病等也日益增加，因此可利用一些具有保健功能的藥材，研發(fā)出保健型啤酒以替代普通啤酒。中藥杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）具有補肝腎、強筋骨、安胎的功效，臨床多用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈目眩等癥狀。本研究結合中藥杜仲的優(yōu)勢和啤酒的特點，利用杜仲研制出保健型啤酒，再利非靶向液-質（LC-MC）聯用對杜仲啤酒進行成分鑒定與分析，以期為杜仲啤酒的開發(fā)提供一定的實驗依據。

一、原料與設備

1.原料。淺色小麥（德國）、S-33型酵母（德國）、啤酒花（美國）、杜仲（毫州市任大蘭藥業(yè)有限公司）、雪花啤酒（華潤雪花啤酒有限公司，批號為QS510015030230）。

2.主要試劑。甲醇（67-56-1，≥99.9%，Thermo）；乙腈（75-05-8，≥99.9%，Thermo）；2-氯苯丙氨酸（103616-89-3，98.5%，Aladdin）；甲酸（64-18-6，≥98%，TCI）；甲酸銨（540-69-2，≥99%，Sigma）；H2O（7732-18-5，100%，Milli-Q）。

3.儀器及設備。電子分析天平（EL104，梅特勒-托列多有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-42（0），蘇州威爾實驗用品有限公司）；離心機（Sorvall Legend 21R，美國Thermo Fisher公司）；糖化鍋（WS-38，廣州偉納斯不銹鋼實業(yè)有限公司）；發(fā)酵罐（800mL，煙臺帝伯仕自釀有限公司）；高壓滅菌鍋（YA28X6T，寧州甬安醫(yī)療器械制造公司）；生化培養(yǎng)箱（LRH-150-Ⅱ，廣東醫(yī)療器械）；麥芽汁糖度計（1.0-1.1，煙臺帝伯仕自釀有限公司）；pH計（HI2215，哈納儀器（北京）有限公司）；電磁爐（WLK-T1，廣州半球實業(yè)有限公司）；冷凍離心機（H2050-R，湘儀）；混勻儀（QL-866，其林貝爾）；真空濃縮儀（5305，Eppendorf）；濾膜（0.22?m PTFE，津騰）；冷凍干燥機（SCINTZ-10N，新芝）；液相色譜儀（Ultimate300，Thermo）；質譜儀（Q Exactive Focus，Thermo）。

二、實驗與方法

1.杜仲啤酒的制備。（1）制備麥芽汁。粉碎小麥時加入少量水使小麥潤濕，且粉碎不宜過細。按料液比1：4，于37℃下自然浸泡30min，直接升溫至55℃進行蛋白休止30min，然后轉移到糖化鍋中，緩慢升溫至65℃-78℃進行糖化（60min）。結束糖化后進行過濾，將濾液煮沸后加入啤酒花（啤酒花總量按40-60mg/L計算）。煮沸后先加入10%的啤酒花；煮沸60min后加入50%的啤酒花總量；煮沸90min后加入余下的啤酒花，繼續(xù)煮沸10min，除去表面的浮沫。用冷卻盤快速冷卻，使溫度快速降到25℃以下。將煮沸冷卻后的麥芽汁沿一個方向攪拌旋轉，使蛋白沉積在底部，靜置10min備用。

（2）前發(fā)酵。將杜仲粉加適量水浸泡30min，加入8倍量的水煮沸30min，過濾，濾液備用。將藥渣再加入4倍量的水煎煮20min，再進行過濾，藥渣重復上一步操作，合并三次濾液并濃縮。將濃縮液加入煮沸后的麥芽汁中，加入5%的啤酒酵母，充氧，密封，在12℃條件下進行前發(fā)酵。

（3）后發(fā)酵。前發(fā)酵結束后，將前發(fā)酵液得到的新鮮嫩啤酒進行低溫離心，將上清液轉移至滅菌后的啤酒瓶中，再進行封瓶與滅菌。將發(fā)酵溫度由12℃以每天1℃的速度進行升溫，直至溫度達到20℃時停止升溫。常溫保存，可得熟化后的啤酒。

2.感官檢測。參照啤酒感觀評價的研究、啤酒分析方法，設置感官評價項目（表1），包括4大項內容，總分100分，隨機抽取20名校內人員進行品評（得分用±SD表示）。

3.理化指標檢測。根據GB/T 4928-2008《啤酒分析方法》的要求，對本研究制備的啤酒進行感官要求（外觀、口感、泡沫）及原麥芽汁的濃度、酒精度數、酸度等理化指標的檢測，根據結果對啤酒質量進行優(yōu)級評定。

4.非靶向液-質聯用物質分析。（1）檢測樣本預處理。精確移取適量樣本于2mL離心管中，濃縮干燥；加入500?L甲醇溶液（-20℃保存）到干燥后的樣本管中，渦旋1min；12000rpm、4℃離心10min，取全部上清液，轉移至新的2mL離心管中，濃縮干燥；準確加入150?L 80%甲醇水配制的2-氯-L-苯丙氨酸（4ppm）溶液（-20℃保存）復溶樣品，取上清液過0.22?m膜過濾，過濾液加入到檢測瓶中，用于LC-MS檢測。

（2）上機檢測。①色譜條件。使用Thermo Vanquish（Thermo Fisher Scientific，USA）超高效液相系統(tǒng)，色譜柱為ACQUITY UPLC? HSS T3（2.1×150mm，1.8?m）（Waters，Milford，MA，USA），流速為0.25mL/min，柱溫為40℃，進樣量為2?L。正離子模式，流動相為0.1%甲酸乙腈（C）和0.1%甲酸水（D），梯度洗脫程序為：0-1min，2%C；1-9min，2%-50%C；9-12min，50%-98%C；12-13.5min，98%C；13.5-14min，98%-2%C；14-20min，2%C。負離子模式，流動相為乙腈（A）和5mM甲酸銨水（B），梯度洗脫程序為：0-1min，2%A；1-9min，2%-50%A；9-12min，50%-98%A；12-13.5min，98%A；13.5-14min，98%-2%A；14-17min，2%A。②質譜條件。Thermo Q Exactive Focus質譜檢測器（Thermo Fisher Scientific，USA），電噴霧離子源（ESI），正離子噴霧電壓為3.50kV，負離子噴霧電壓為-2.50kV，鞘氣為30arb，輔助氣為10arb，毛細管溫度為325℃，分辨率70000進行一級全掃描，一級離子掃描范圍為m/z81-1000。采用HCD進行二級裂解，碰撞電壓為30%，二級分辨率為17500，采集信號前3離子進行碎裂，同時采用動態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

（3）數據處理。通過Proteowizard軟件包中的MSConvert工具，將原始質譜raw文件轉換為mzXML文件格式。采用RXCMS軟件包進行峰檢測、峰過濾、峰對齊處理，得到物質定量列表，參數設置為bw=2，ppm=15，peakwidth=c（2，15），mzwid=0.015，mzdiff=0.01，method=“centWave”。采用公共數據庫HMDB6、METLIN、massbank、LipidMaps、mzclound、KEGG及自建物質庫進行物質的鑒定，參數設置為ppm＜20ppm?；赒C樣本的LOESS信號校正方法實現數據矯正，消除系統(tǒng)誤差。在數據質控中，過濾掉QC樣本中RSD＞30%的物質。

三、結果與分析

1.麥芽發(fā)酵液。糖化過濾后得到橙黃色麥芽汁，測得其麥芽汁濃度為11°P。在前發(fā)酵期間，第3d后開始進入高泡期，7d后泡沫消失，10d后得到新鮮嫩啤酒，如圖1所示。

圖1：麥芽發(fā)酵液

2.后發(fā)酵。經過后發(fā)酵后，啤酒的整體顏色呈現淡黃色或淡棕色，接近于杜仲藥材提取液的顏色，如圖2所示。

圖2：后發(fā)酵液

3.感官檢測結果。根據GB/T 4928-2008中對啤酒感觀的要求，隨機抽取20名校內人員進行品評（得分用±SD表示），總得分為83.95±4.90，表明本研究制備的杜仲啤酒符合濃色啤酒的規(guī)定，詳見表2。

4.理化指標檢結果。對照GB/T 4928-2008中的啤酒理化指標要求，本實驗制備的杜仲啤酒符合濃色啤酒的規(guī)定要求，其質量優(yōu)級為3.7，詳見表3。

5.鑒定結果。通過液質聯用（LC-MS）方式進行物質鑒定檢測，最終鑒定出543個代謝物，其中包含黃酮類、綠原酸、新綠原酸、桃葉珊瑚苷等成分，詳見表4。

四、討論與結論

經LC-MS方法檢測得出，杜仲啤酒中含有槲皮素、綠原酸、桃葉珊瑚苷等成分。研究證明，槲皮素在高血壓、糖尿病、心血管疾病等治療方面發(fā)揮作用，通過調控炎癥信號通路減輕肝組織損傷來發(fā)揮免疫作用，改善三氯化鐵誘導頸動脈損傷引起的血流減慢來抗血小板，防止血栓形成，減少血管彈性來降低血壓，從而改善心功能，防止心肌缺血。作為植物體內的一種有機化合物，綠原酸是植物細胞經過有氧呼吸合成的次生代謝產物，具有降壓、抗菌等多種藥理性功能。作為一種天然的環(huán)烯萜苷化合物，桃葉珊瑚苷是杜仲的有效成分之一，具有抑制氧化應激反應、炎癥反應等功能。

綜上所述，高血壓、糖尿病、心臟病的發(fā)病機制廣泛，且與日常生活飲食息息相關，常規(guī)啤酒的成分、酒精含量等可能會刺激神經系統(tǒng)和血管擴張，增加疾病的惡化進程。而杜仲啤酒中的活性成分可以在緩解壓力的同時從源頭對疾病進行調控，整體調節(jié)身體機能。與傳統(tǒng)的杜仲浸泡酒相比，本研究制備的杜仲啤酒口感更佳，刺激性更小，適用人群更為廣泛。

基金項目：2020年貴州中醫(yī)藥大學藥食兩用類中藥啤酒研究中心。

作者簡介：王雷（1998-），男，大學本科，研究方向為制藥工程。

*通信作者：何光志（1977-），男，博士，教授、碩士生導師，研究方向為中西醫(yī)結合。