趙立波 陳家鈴 陶春霖

再生障礙性貧血（Aplastic amemia，AA），又稱血虛證，為中醫(yī)臨床常見癥候，是一種以造血功能衰竭為特征的疾病，其發(fā)病機(jī)制主要與骨髓造血干細(xì)胞損傷、造血微環(huán)境損傷以及免疫性造血抑制等機(jī)制相關(guān)。目前，治療AA的主要藥物如環(huán)孢素（cyclosporine A，CsA），存在使用后反應(yīng)率較低且復(fù)發(fā)率較高的缺點(diǎn)。本研究以西澳菲斯特農(nóng)場(chǎng)赤桉樹蜂蜜為研究對(duì)象，通過建立小鼠血虛模型，探究服用不同劑量的TA10+FFJH以及TA30+FFJH對(duì)小鼠血虛癥狀的影響。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)藥品與試劑。西澳菲斯特農(nóng)場(chǎng)赤桉樹蜂蜜（Fewsters Farm jarrah honey，F(xiàn)FJH），洋妝源（上海）網(wǎng)絡(luò)科技有限公司；乙酰苯肼、淋巴細(xì)胞分離液，美國(guó)SIGMA公司；環(huán)磷酰胺，上海華聯(lián)制藥有限公司；促紅細(xì)胞生成素（EPO）ELASA試劑盒，美國(guó)R&D Systems公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。選擇BALB/c小鼠80只，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雌雄各半，年齡為8-12周，體重控制在18-22g。飼養(yǎng)溫度為（23±1）℃，濕度控制在40%-60%，24h光暗循環(huán)，通風(fēng)良好。飼養(yǎng)期間保證小鼠自由飲水、飲食。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.模型建立。（1）實(shí)驗(yàn)分組。選取BALB/c小鼠80只，在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其分為以下8組：①正常對(duì)照組；②血虛模型組；③25%-TA10+FFJH組；④50%-TA10+FFJH組；⑤75%-TA10+FFJH組；⑥25%-TA30+FFJH組；⑦50%-TA30+FFJH組；⑧75%-TA30+FFJH組。每組小鼠各10只。（2）實(shí)驗(yàn)流程。按照乙酰苯肼、X射線、環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用的方法，建立再生障礙性貧血小鼠模型。將不同劑量的蜂蜜溶解至等量生理鹽水中，從第7d開始，以每天1次的頻率按各組劑量對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，同時(shí)對(duì)空白對(duì)照組以及血虛模型組的小鼠灌胃等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)周期為45d，45d后頸椎脫臼處死小鼠，采樣進(jìn)行檢測(cè)。

2.各組小鼠一般行為學(xué)觀察。經(jīng)上述步驟處理45d后，對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)靈活度、反應(yīng)敏捷度、毛發(fā)光澤度、脫毛情況及體重變化情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。

3.外周血檢測(cè)。（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)。各實(shí)驗(yàn)組在第45d對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱重，經(jīng)眼眶取血，測(cè)定外周血的血紅蛋白含量、紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板數(shù)；在顯微鏡下觀察外周血涂片，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。（2）EPO濃度測(cè)定。EPO是一種重要的造血調(diào)控因子，血液中的EPO水平能夠反映機(jī)體生成紅細(xì)胞的能力。參考文獻(xiàn)中的方法，對(duì)血液進(jìn)行樣品處理，使用試劑盒對(duì)血液中的EPO含量進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣本的EPO濃度（pg/mL）。

4.骨髓有核細(xì)胞（BMCs）計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)參考陳姍姍等的方法，頸椎脫臼處死小鼠，取右側(cè)股骨，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗，取骨髓細(xì)胞懸液，配平至相同體積，取0.2mL細(xì)胞懸液裂解紅細(xì)胞后，以自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)BMCs數(shù)量。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，結(jié)果以Means±SEM表示。采用Origin8.5和SPSS分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

三、結(jié)果分析

1.血虛模型小鼠一般行為學(xué)觀察。與正常對(duì)照組相比，血虛模型組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)皮毛蓬亂、光澤度降低以及部分脫毛現(xiàn)象，且隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的發(fā)展，癥狀逐漸加重。同時(shí)，小鼠還出現(xiàn)精神不佳、活動(dòng)減少、體重下降的癥狀。

對(duì)比服用各FFJH劑量組與血虛模型組發(fā)現(xiàn)，服用FFJH組小鼠的皮毛光澤度下降及脫毛的程度均有所減輕，精神狀態(tài)也有明顯提升。各組小鼠的體重平均值如圖1所示，通過對(duì)比可以看出，灌胃FFJH各組小鼠的平均體重均高于血虛模型組，且呈劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系，說明FFJH對(duì)血虛引起的小鼠體重下降有抑制作用。同時(shí)，通過在同劑量添加下體重值的對(duì)比可以觀察到，TA30+FFJH較TA10+FFJH的效果更佳。

圖1：FFJH對(duì)小鼠體重的影響（）

注：與空白組相比，#代表與空白對(duì)照組相比差異顯著，P＜0.05；*表示與模型組相比差異顯著。

2.FFJH對(duì)血虛模型小鼠外周血三系水平的影響。表1為不同F(xiàn)FJH劑量組、空白對(duì)照組以及血虛模型組小鼠的外周血中血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）以及血小板（PLT）水平情況。由表1可以看出，在血虛模型條件下，小鼠血常規(guī)中的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低（P＜0.01），即血虛模型組小鼠的血象三系水平明顯下降。服用各FFJH劑量組與血虛模型組相比，小鼠的外周血三系水平均有所提升，且呈劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系，說明FFJH對(duì)小鼠的再生障礙性貧血有顯著改善效果（P＜0.01）。

3.FFJH對(duì)血虛模型小鼠EPO濃度的影響測(cè)定。研究表明，EPO具有抗凋亡以及促進(jìn)血管生成的作用，其濃度水平能直觀反映骨髓紅系造血功能障礙的程度，圖2為不同F(xiàn)FJH劑量組、空白對(duì)照組以及血虛模型組小鼠的EPO濃度測(cè)定結(jié)果。在血虛模型條件下，小鼠血清中的EPO濃度顯著提高（P＜0.01），而各FFJH劑量組與血虛模型組相比，EPO含量均顯著降低，并呈劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，F(xiàn)FJH對(duì)再生障礙性貧血小鼠外周血中各種血細(xì)胞的形成有促進(jìn)作用，而且通過組間數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在同劑量添加條件下，TA30+FFJH組較TA10+FFJH組的EPO濃度下降更明顯，說明TA30+FFJH降低EPO濃度的作用比TA10+FFJH更好。

圖2：FFJH對(duì)小鼠血液中EPO水平的影響（）

注：與空白組比較，##代表與空白對(duì)照組相比差異極顯著，P＜0.01；**表示與模型組相比差異極顯著，P＜0.01。

4.FFJH對(duì)小鼠BMCs水平的影響。圖3為不同F(xiàn)FJH劑量組、空白對(duì)照組以及血虛模型組的BMCs水平。與空白組相比，血虛模型組小鼠的造血干細(xì)胞數(shù)量顯著下降（P＜0.01），而各FFJH劑量組的BMCs水平明顯高于血虛模型組，并呈劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系（P＜0.05），推測(cè)FFJH有促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖的效果，可以抑制再生障礙性貧血小鼠有核細(xì)胞減少，進(jìn)而對(duì)骨髓的造血機(jī)能產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用。通過組間數(shù)據(jù)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，在同劑量添加條件下，TA30+FFJH組較TA10+FFJH組促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖的效果更明顯，說明TA30+FFJH促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖的作用比TA10+FFJH更好。

圖3：FFJH對(duì)小鼠BMCs水平的影響（）

注：與空白組相比，##代表與空白對(duì)照組相比差異極顯著，P＜0.01；**表示與模型組相比差異極顯著，P＜0.01。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠血虛模型，觀察各組小鼠體重變化、外周血常規(guī)、EPO濃度以及骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)的差異，發(fā)現(xiàn)FFJH可以改善血虛模型小鼠再生障礙性貧血導(dǎo)致的精神不佳、毛發(fā)光澤受損、體重下降癥狀。服用FFJH后，模型小鼠血象三系水平以及骨髓細(xì)胞水平的下降速度均明顯減緩（P＜0.01），EPO水平波動(dòng)明顯減小，并呈劑量對(duì)應(yīng)關(guān)系（P＜0.01），說明FFJH能有效緩解并修復(fù)血虛模型處理小鼠的骨髓造血微環(huán)境受損。不過，本研究也存在一定的不足之處，雖然證明了FFJH可以為機(jī)體補(bǔ)充相關(guān)營(yíng)養(yǎng)素以減輕小鼠的血虛癥狀，但未對(duì)調(diào)節(jié)血虛癥狀的具體機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

作者簡(jiǎn)介：趙立波（1987-），男，漢族，河南信陽人，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称贰?/p>

陳家鈴（1993-），女，漢族，貴州安順人，大學(xué)本科，研究方向?yàn)樵习案男浴?/p>

*通信作者：陶春霖（1986-），男，漢族，天津人，大學(xué)本科，研究方向?yàn)樵习案男浴?/p>