葉雙 王宏雁

本研究借鑒前人研究，在無溶劑介質(zhì)中通過脂肪酶催化大豆油和丁酸乙酯酯交換反應，以丁酸插入率為指標，探究合成長短鏈甘油三酯的最佳反應條件，豐富了國內(nèi)對大豆油改性制備低熱量結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的全面研究。

一、材料與儀器

1.材料。大豆油，浙江益海嘉里食品工業(yè)有限公司；丁酸乙酯（純度＞98%），天津市科密歐化學試劑有限公司；固體脂肪酶Novozyme 435，諾維信生物技術(shù)有限公司；丁酸甲酯，上海Merck公司；正己烷及其他有機試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

2.儀器。SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州丹瑞實驗儀器設備有限公司；氣相色譜儀，美國安捷倫公司；BS224S電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；離心機，常州國華電器有限公司。

二、實驗與方法

1.長短鏈脂肪酸甘油三酯的制備與分離。（1）制備。大豆油與丁酸乙酯的酯交換反應在無溶劑體系中進行。稱取15g大豆油與一定量的丁酸乙酯置于150mL錐形瓶內(nèi)，混合均勻后加入一定量的固定化脂肪酶Novozyme 435，蓋緊塞子，將其放在恒溫水浴振蕩器中，保持100r/min的振蕩速率，在特定溫度下反應4h后終止，過濾除去固體脂肪酶。（2）薄層層析法分離。選用100mm×200mm規(guī)格的硅膠板，對丁酸乙酯、大豆油和酶催化大豆油與丁酸乙酯合成的長短鏈甘油三酯產(chǎn)物進行TLC分析，參照標準譜圖將對應的長短鏈甘油三酯條帶刮下，用正己烷萃取2次，加入適量的無水硫酸鈉，然后旋蒸除去正己烷。

2.產(chǎn)物組成分析。采用氣相色譜檢測方法對產(chǎn)物組成進行分析。稱取0.1g樣品，溶于10mL正己烷中，混合均勻后取1mL置于色譜瓶中進行氣相分析。

氣相色譜條件如下：色譜柱DB-1HT毛細血管（29m×250μm×0.2μm）；載氣N2（純度99.999%）；進樣量1，進樣口溫度260℃，分流比20：1；氫火焰離子化檢測器，檢測口溫度380℃；氫氣流量60mL/min，空氣流量400L/min，尾吹氣流量50mL/min。程序升溫條件如下：溫度80℃，保持2min；以10℃/min的升溫速率持續(xù)加熱至200℃，保持1min；以30℃/min的升溫速率加熱至350℃，保持6min。

3.脂肪酸組成分析。采用甲酯化方法對脂肪酸組成進行分析。稱取100mg分離后的產(chǎn)物，加入0.2mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液2mL，快速混勻，再移取3mL的正己烷震蕩30s，使之充分混合后，放入離心機離心2min，獲得分層溶液，將上層透明澄清溶液用無水硫酸鈉干燥，然后吸取上清液用于氣相分析。

氣相色譜分析條件如下：BPX70，30m×0.25mm×0.25μm；載氣N2；進樣量1；檢測器溫度250℃，進樣口溫度250℃；氮氣流速32mL/min，氫氣流速50mL/min，空氣流速400mL/min。程序升溫條件如下：溫度60℃，保持3min；以10℃/min的升溫速率持續(xù)加熱至180℃；以5℃/min的升溫速率加熱至230℃，保持3min。

4.丁酸插入率的測定。丁酸插入率的計算公式如下：

三、結(jié)果與討論

1.產(chǎn)物組成分析。圖1為產(chǎn)物甲酯化后的氣相色譜圖。對照各標準樣品對產(chǎn)物譜圖進行定性分析，丁酸甲酯的保留時間為2.119min，棕櫚酸甲酯的保留時間為15.176min，硬脂酸甲酯的保留時間為16.642min，油酸甲酯的保留時間為16.905min，亞油酸甲酯的保留時間為17.383min，亞麻酸甲酯的保留時間為17.887min。由圖1可以看出，在本實驗選定的反應條件下，圖中未出現(xiàn)太多雜峰，且各脂肪酸甲酯的分離情況較好。

圖1：產(chǎn)物甲酯化氣相色譜圖

2.單因素實驗結(jié)果分析。（1）反應時間對長短鏈甘油三酯含量的影響。在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1、反應溫度為50℃、加酶量為總底物的9%時，每次間隔2h進行一次產(chǎn)物取樣，以探究制備長短鏈甘油三酯的最佳反應時間，探究結(jié)果如圖2所示。

圖2：反應時間對丁酸插入率的影響

由圖2可知，在不同反應時間下進行長短鏈甘油三酯的制備，丁酸插入率發(fā)生了改變。在開始反應的10h內(nèi)，隨著時間的推移，反應速度加快，丁酸插入率持續(xù)提升，在反應了10h時，丁酸的插入率達到12.16%；而在反應了10h之后，丁酸插入率反而下降。這是因為酯交換反應是一個對峙反應，也可以用化學動力學平衡理論對這種現(xiàn)象進行解釋。在反應早期，正向反應的速率快于反向反應的速率，因此丁酸插入率會不斷增加。隨著反應的進行，反向反應的速率逐漸增加，正向反應的速率逐漸降低，最終達到動態(tài)平衡，這時反應的產(chǎn)物和反應物濃度不再發(fā)生變化，所以插入率也不再增加。隨著時間的推移，由于反向反應速率增加，丁酸插入率反而會下降。綜合考慮，反應進行10h為最佳，所以本實驗在后續(xù)階段會把反應10h時的數(shù)據(jù)作為主要數(shù)據(jù)。

（2）加酶量對長短鏈甘油三酯含量的影響。在反應時間為10h、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1、反應溫度為50℃的反應條件下，探究不同反應溫度對制備長短鏈甘油三酯的影響，探究結(jié)果如圖3所示。

圖3：加酶量對丁酸插入率的影響

由圖3可知，在加酶量為3%-9%時，丁酸插入率隨著加酶量的增加而增加，但在加酶量超過9%后，丁酸插入率反而隨著加酶量的提升而降低。在反應初期，較高的加酶量會促進酶活性位點提高反應速率，導致?；w的摻入量增加。同時在這一時期，底物分子與酶分子的結(jié)合比較容易，酶底物復合物的形成速率較快，使得丁酸插入率隨著加酶量的增加而提升。但當加酶量超過一定閾值時，丁酸插入率反而會隨著加酶量的增加而降低，這是因為隨著反應的進行，脂肪酶產(chǎn)生聚集，致使底物難以擴散，從而導致反應速率下降。為了降低生產(chǎn)成本并提高反應效率，加酶量控制在9%為最佳。

（3）反應溫度對長短鏈甘油三酯含量的影響。在反應時間為10h、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1、加酶量為總底物的9%時，探究不同反應溫度對制備長短鏈甘油三酯的影響，探究結(jié)果如圖4所示。

圖4：反應溫度對丁酸插入率的影響

由圖4可知，在反應溫度為40℃-60℃時，丁酸插入率顯著提升。根據(jù)Arrhenius定律，反應溫度的升高通常導致由酶催化的加速效應，由于熱力學平衡的移動，高溫有利于反應正向移動，較高的溫度也降低了溶液的粘度，減少了傳質(zhì)限制，此時底物分子與酶分子之間的相互作用增強，酶與底物的結(jié)合力增加，使得酶底物復合物的形成速率提高。但當反應溫度超過一定閾值時，酶會發(fā)生構(gòu)象變化，酶分子的空間構(gòu)型發(fā)生改變，酶的催化活性會受到影響；同時，溫度升高也會加速酶的失活，降低酶的穩(wěn)定性，使酶分子失去原有的催化能力，從而導致丁酸插入率開始降低。

（4）丁酸乙酯與大豆油的摩爾比對長短鏈甘油三酯含量的影響。在反應時間為10h、反應溫度為60℃、加酶量為總底物的9%的反應條件下，探究丁酸乙酯與大豆油的不同摩爾比對制備長短鏈甘油三酯的影響，探究結(jié)果如圖5所示。

圖5：丁酸乙酯與大豆油的摩爾比對丁酸插入率的影響

酯交換反應是一個可逆反應，反應平衡是一個動態(tài)過程，這種平衡僅與起始反應物的濃度相關，即丁酸乙酯與大豆油的摩爾比。由圖5可知，在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比在1：1-3：1時，隨著底物中丁酸的量不斷上升，丁酸插入率顯著提升；但是在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比達到3：1之后，丁酸插入率轉(zhuǎn)為下降。這是因為在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比在1：1-3：1時，丁酸量的增加可以提高丁酸在化學反應中的濃度，從而促進丁酸的插入率；但當丁酸乙酯與大豆油的摩爾比超過3：1時，丁酸乙酯的濃度占據(jù)了主導地位，丁酸的濃度相對降低，從而導致丁酸插入率下降。綜合考慮，選擇丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1最合適。

綜上所述，本研究以丁酸乙酯和大豆油為原料，固體脂肪酶Novozyme 435為催化劑，探究了反應時間、反應溫度、加酶量和底物比率對大豆油中丁酸插入率的影響。結(jié)果表明，在反應時間為10h、反應溫度為50℃、加酶量為9%、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1時，大豆油中的丁酸插入率最高。

作者簡介：葉雙（1999-），女，漢族，河南南陽人，碩士研究生在讀，研究方向為油脂化工。

*通信作者：王宏雁（1963-），男，漢族，河南鄭州人，副教授，碩士研究生，研究方向為應用化學。