雷棋怡 徐楊 李鵬飛

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，蘇州 215000；2.蘇州大學(xué)造血干細(xì)胞移植研究所，蘇州 215000）

腸黏膜屏障是腸道與外界環(huán)境接觸的第一道屏障，對減少病原體的侵襲、毒素的吸收有極其重要的作用。腸道屏障功能的減退或缺失往往伴隨著腸道菌群失調(diào)，甚至?xí)?dǎo)致腸道菌群的易位，致使菌群進(jìn)入血液，進(jìn)而引發(fā)多種腸道和血液疾病，如炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease, IBD）［1］、膿毒血癥（Sepsis）［2-3］、移植物抗宿主癥（graft ver?sus?host disease, GVHD）［4］等。因此，腸道菌群與腸道屏障之間的相互作用備受矚目。一方面，腸道菌群為宿主提供能量和營養(yǎng)，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育，幫助宿主抵御病原體。另一方面腸道細(xì)菌的代謝物如短鏈脂肪酸（short chain fatty acid, SCFAs）可以影響人類腸道上皮和黏膜屏障的完整性、免疫反應(yīng)和微生物群的多樣性［5］。但是，能應(yīng)用到臨床治療的菌群產(chǎn)物依然十分有限,需要進(jìn)一步探索腸道菌群與宿主之間相互作用的機(jī)制。

作為腸道中最主要的共生菌類群之一，擬桿菌的多個成員被認(rèn)為是腸道有益菌，在調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)和維持腸道屏障等方面起到重要作用［6-8］。值得注意的是，基因組測序結(jié)果表明，約50%的擬桿菌目細(xì)菌中都存在著六型分泌系統(tǒng)（T6SS）［9］。T6SS 是存在于革蘭氏陰性菌中的蛋白分泌系統(tǒng)，一般通過接觸依賴的方式將效應(yīng)物注入到相同生態(tài)位的靶細(xì)胞中，在多種水平上調(diào)節(jié)和塑造腸道菌群的穩(wěn)定性［10］。早期研究表明T6SS 可以殺傷相同生態(tài)位的細(xì)菌以影響菌群構(gòu)成，有助于細(xì)菌在腸道的定殖［11］。在腸道病原菌中，T6SS 效應(yīng)蛋白通過黏附修飾、細(xì)胞骨架重構(gòu)和逃避宿主固有免疫等過程來實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)病原菌的定位、存活和傳播［12-14］。目前鑒定出來的T6SS 效應(yīng)蛋白多為核酸酶或者核酸靶向酶，然而絕大多數(shù)共生菌T6SS 的功能，尤其是對腸道屏障的功能尚不清楚。

腸道炎癥的發(fā)病因素包括遺傳易感、黏膜屏障的損壞、腸道微生物群的失調(diào)和免疫紊亂等。靶向腸道菌群的定向精準(zhǔn)干預(yù)，是治療腸道炎癥相關(guān)疾病的新選擇。本研究擬利用硫酸葡聚糖鈉鹽（DSS）誘導(dǎo)的小鼠腸道屏障損傷模型，探討腸道擬桿菌T6SS 以及其分泌蛋白對腸道炎癥以及腸道屏障的作用。本研究進(jìn)一步通過非靶向代謝組分析探討T6SS介導(dǎo)的細(xì)菌間競爭對腸道代謝組的影響，為其作為益生菌改善腸道屏障功能提供理論依據(jù)［15］。

1 材料與方法

1.1 材料

Bacteroides fragilis（脆弱擬桿菌, B.fragilis）菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；限制性內(nèi)切酶BamH I 和Sal I 購自NEB；感受態(tài)細(xì)胞 S17?pir 購自源葉生物；紅霉素購自索萊寶；四環(huán)素購自Cayman；DSS（36-50 kD）購自MP Biomedicals；異硫氰酸熒光素葡聚糖購自Sigma?aldrich；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；SYBR Green 探針購自上海藍(lán)木；引物由金唯智公司負(fù)責(zé)合成（表1）；多功能酶標(biāo)儀用Synergy HTX Multimode Reader 購自BioTek；qRT?PCR 儀購自Applied Biosystems。

表1 引物列表Table 1 Primer sequence

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) B.fragilis 按1∶100 接種到新鮮的腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基中，活化過夜2 次。二次活化培養(yǎng)16 h 后，離心濃縮細(xì)菌（6 000 ×g，4℃，10 min），并用磷酸緩沖鹽水（PBS）洗滌2 次，最后將收集的細(xì)胞重新懸浮于PBS 溶液中調(diào)整至所需終濃度。

1.2.2 缺陷株的制備 本實(shí)驗(yàn)采用自殺質(zhì)粒pLGB13構(gòu)建T6SS 缺陷株［16-17］。將選定基因上下游500-3 000 bp 序列通過BamH I 和Sal I 雙酶切位點(diǎn)克隆到自殺質(zhì)粒上，隨后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞S17?pir 中。然后通過接合轉(zhuǎn)化的方式將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到B.fragilis WT菌株中。第一輪篩選采用紅霉素（索萊寶，e8100）和特異性引物得到發(fā)生單邊同源重組的克隆。第二輪篩選將細(xì)菌用有限稀釋法涂布于含有四環(huán)素（6 μg/mL）的血平板上進(jìn)行培養(yǎng)，利用特異性PCR 篩選，得到T6SS 缺陷株。利用全基因組測序確定突變株的基因敲除。

1.2.3 同源進(jìn)化樹的構(gòu)建 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中T6SS 保守基因tssH，利用MEGA11［18］構(gòu)建N?J［19］同源進(jìn)化樹分析其序列多態(tài)性。

1.2.4 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計 選用SPF 級雌性C57BL/6J 小鼠，8-10 周齡，體重為（20±2）g/只。動物隨機(jī)分為3 組，每組10 只，分別在溫度21-25℃、相對濕度40%-60%的標(biāo)準(zhǔn)條件下和標(biāo)準(zhǔn)光周期（12 h白天/12 h 黑夜）下飼養(yǎng)。給予小鼠酸化水和標(biāo)準(zhǔn)食物，并在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行為期7 d 的馴化。隨后，各組小鼠飲水中加入3%（W/V）DSS，維持7 d，第8天改為常規(guī)飲用水。B.fragilis WT 和ΔT6SS 組每24 h 分別灌胃1 × 109CFU 相應(yīng)脆弱桿菌株活菌制劑，共7 d，每24 h 灌胃一次。

1.2.5 血清熒光素的測定 在第9 天前一晚所有小鼠禁食、禁飲12 h 后，灌胃異硫氰酸熒光素葡聚糖。所有小鼠在異氟醚下處死。收集眼球血及結(jié)腸。眼球血室溫放置30 min 待血液凝固后，離心3 000×g，RT 15 min，取上清測定血清中的熒光強(qiáng)度。本項(xiàng)目經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查同意并按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（2021 倫審（申報）批第248 號）。

1.2.6 組織病理學(xué) 建立DSS 模型后第9 天，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，收集小鼠的結(jié)腸，用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛液固定后經(jīng)石蠟包埋、切片及HE 染色后，在鏡下觀察小鼠結(jié)腸的病理損傷程度。

1.2.7 免疫組化 建立DSS 模型后第9 天，將新鮮結(jié)腸組織標(biāo)本（0.5 cm）轉(zhuǎn)移到含4%多聚甲醛的離心管中固定后，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉后，分別加入鼠源Claudin?2、Claudin?3 和Claudin?4 一抗，并于37℃孵育1 h。經(jīng)PBST 洗滌3 次后，每張切片滴加HRP 標(biāo)記的二抗（抗鼠），室溫孵育30 min。使用DAB 法顯色5 min 后，經(jīng)過復(fù)染、脫色反藍(lán)后封片。

1.2.8 小鼠腸道組織緊密連接蛋白基因表達(dá)檢測 建立DSS 模型后第9 天，剪取結(jié)腸組織50 mg，利用Trizol?氯仿法提取組織總RNA。利用試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green 探針檢測8種緊密連接蛋白（Claudin?1、Claudin?2、Claudin?3、Claudin?4、Occludin、ZO?1、Jam 和Muc?1）的表達(dá)情況。RT?PCR 反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 35 s，60℃ 35 s，72℃ 35 s，共35 個循環(huán)；72℃ 10 min。引物序列見表1。

1.2.9 代謝組分析 收集第7 天的小鼠糞便，液氮速凍后，由天津諾禾致源公司（Novogene Co.Ltd）采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC?MS）進(jìn)行非靶向代謝組測序［20-21］。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 9（Version 9.5.0）統(tǒng)計軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。兩組間采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析。多組間比較采用One?way ANOVA 進(jìn)行方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett 方法。差異結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SEM）表示。P＜0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T6SS在擬桿菌細(xì)菌中廣泛存在

以B.fragilis T6SS 保守基因tssH 為模板在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對并構(gòu)建Neighbor?Joining 同源進(jìn)化樹，結(jié)果表明T6SS 在擬桿菌屬細(xì)菌中分布廣泛（圖1）。

圖1 基于擬桿菌屬細(xì)菌tssH 基因構(gòu)建的N-J 同源進(jìn)化樹Fig.1 Neighbor-Joining homogeneous phylogenetic tree based on tssH gene in Bacteroides genus

2.2 T6SS的缺失不影響B(tài).fragilis的生物活性

為了探討B(tài).fragilisT6SS 與腸道屏障之間的作用，本研究采用自殺質(zhì)粒pLGB13 定向敲除T6SS 分泌系統(tǒng)中的tssB?tssC?tssH 基因。細(xì)菌全基因組測序驗(yàn)證了在2365875-2370215 序列的缺失（圖2?A）。篩選得到的缺陷株B.fragilis ΔT6SS 失去了將效應(yīng)蛋白分泌到靶細(xì)胞中的能力，但是并不影響其在液體培養(yǎng)基的生長曲線（圖2?B），也不影響細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄組和代謝組（圖2?C-D）。

圖2 B.fragilis T6SS 缺陷株的構(gòu)建Fig.2 Construction of B.fragilis ΔT6SS strain

2.3 脆弱桿菌T6SS的缺失導(dǎo)致對DSS的保護(hù)性降低

隨著DSS 誘導(dǎo)腸炎的進(jìn)行，各組小鼠體重與初始相比均有所降低。在誘導(dǎo)后7 d，與對照組相比，B.fragilis WT 實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重下降趨勢有顯著改善；而B.fragilis ΔT6SS 實(shí) 驗(yàn) 組 體 重 與B.fragilis WT 組相比明顯降低（圖3?A）。第10 天處死小鼠，統(tǒng)計各組小鼠結(jié)腸長度。B.fragilis WT 組小鼠結(jié)腸長度比對照組（P = 0.025 0）和B.fragilis ΔT6SS 組（P =0.028 4）有明顯改善（圖3?C）。

圖3 B.fragilis T6SS 參與到對DSS 誘導(dǎo)腸道炎癥的保護(hù)性Fig.3 B.fragilis T6SS involved in protection on DSS-induced colitis

2.4 B.fragilis T6SS有助于DSS誘導(dǎo)腸道損傷的保護(hù)性

DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎病變以盲腸和遠(yuǎn)段結(jié)腸為著。因此，選擇小鼠結(jié)腸進(jìn)行病理切片觀察。與對照組相比，B.fragilis WT 組小鼠結(jié)腸組織病理得到明顯改善，而B.fragilis ΔT6SS 組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)了和對照組類似的嚴(yán)重組織學(xué)損傷，具體表現(xiàn)為隱窩細(xì)胞和杯狀細(xì)胞減少，腸道上皮損傷和炎性細(xì)胞浸潤（圖4?A）。此外，在第9 天給小鼠灌服熒光素葡聚糖后，收集血清檢測熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，B.fragilis WT 組小鼠血清中熒光素葡聚糖濃度顯著低于對照組和B.fragilis ΔT6SS 組，而對照組和B.fragilis ΔT6SS 組小鼠血清中熒光素葡聚糖濃度無顯著差異（圖4?B）。

圖4 B.fragilis T6SS 有助于DSS 誘導(dǎo)腸道炎癥中腸道屏障的維持Fig.4 B.fragilis T6SS contributes to the maintenance of the intestinal barrier in the DSS-induced colitis

2.5 B.fragilis T6SS 有助于上調(diào)腸道細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)

上皮屏障功能的喪失可能是由于細(xì)胞旁緊密連接通透性的變化造成的。第9 天收集小鼠的大腸，提取RNA 后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。結(jié)果顯示，B.fragilis WT 組相比于其他兩組，上皮細(xì)胞緊密連接 蛋 白Claudin?2、Claudin?3、MUC?1 和Occludin的mRNA 水平更高（圖5?A）。免疫組化也表明B.fragilis WT 組小鼠腸道組織中Claudin?2、Claudin?3和Claudin?4 有更高的表達(dá)量（圖5?B）。對照組和B.fragilis ΔT6SS 組小鼠腸道組織中緊密連接蛋白的表達(dá)無顯著差異。

圖5 B.fragilis T6SS 有助于上調(diào)腸道細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)Fig.5 B.fragilis T6SS upregulates the expressions of intestinal tight junction proteins

2.6 代謝組測序

腸道菌群的代謝產(chǎn)物對腸道屏障有直接的作用，因此，我們進(jìn)一步采用代謝組測序來探索B.fragilis T6SS 參與的菌種競爭對腸道代謝組的影響。結(jié)果表明，灌服B.fragilis WT 和B.fragilis ΔT6SS 小鼠糞便的代謝組有明顯區(qū)別（圖6?A）。與B.fragilis ΔT6SS組相比，灌服B.fragilis WT 的小鼠糞便有96 個顯著差異代謝產(chǎn)物，其中上調(diào)代謝產(chǎn)物86 個，下調(diào)代謝產(chǎn)物10 個（圖6?B）。差異代謝產(chǎn)物見圖6?C，其中上調(diào)最為顯著的代謝產(chǎn)物為甘氨酸（Glycitein）、D?泛黃酸鈣（calcium D?panthotenate）和大豆黃酮（daidzein）。KEGG 通路富集分析表明，差異代謝產(chǎn)物集中在膽堿能突觸（cholinergic synapse）和甘油磷脂代謝（glycerophospholipid metabolism），且均為上調(diào)（圖7）。

圖6 T6SS 對腸道代謝組學(xué)的影響Fig.6 Effect of T6SS on intestinal metabolome

圖7 差異代謝物的KEGG 富集結(jié)果Fig.7 KEGG enrichment of differentially expressed metabolites

3 討論

腸道微生物與腸道屏障的相互作用，以及其在人類健康中的病理生理作用一直是研究的活躍領(lǐng)域。由于頻繁使用廣譜抗生素和放化療，血液病和腫瘤學(xué)疾病患者的腸道通透性增加的風(fēng)險尤其高。靶向腸道屏障穩(wěn)態(tài)已成為診斷和治療大量疾病的挑戰(zhàn)。通過FMT 或者定向補(bǔ)充特定益生菌是提高腸道屏障功能的潛在途徑［22］。安全性方面研究最充分的產(chǎn)品是乳酸桿菌、雙歧桿菌和布拉酵母。它們通過增加緊密連接蛋白的表達(dá)、減少腸道炎癥和調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)來發(fā)揮其活性［23］。深入探索腸道微生物與腸道屏障之間的作用機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的具有生物活性的細(xì)菌產(chǎn)物，并應(yīng)用到臨床實(shí)踐。

本研究表明，作為主要的腸道共生細(xì)菌之一，擬桿菌B.fragilis 的蛋白分泌系統(tǒng)T6SS 有助于上調(diào)腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善腸道屏障的通透性，減輕DSS 誘導(dǎo)的腸炎。在腸道炎癥患者中，腸道屏障可能由于黏膜損傷、細(xì)胞分子變化或自身免疫性疾病引起的免疫反應(yīng)失調(diào)而被破壞，而腸道通透性的增加會導(dǎo)致細(xì)菌、毒素等入侵黏膜層，進(jìn)一步損害屏障的完整性［24-25］。已有研究表明，B.fragilis 單個菌株可以調(diào)節(jié)腸道T 細(xì)胞炎癥因子的釋放和短鏈脂肪酸（SCFAs）的含量來減輕腸道炎癥反應(yīng)，提高腸道的完整性［26］。本研究表明B.fragilis利用其T6SS 提高腸道屏障的完整性，為其作為益生菌改善腸道炎癥提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

此外，小鼠腸道非靶向代謝組分析表明，B.fragilis T6SS 能顯著影響腸道代謝組，上調(diào)甘氨酸、D?泛黃酸鈣和大豆黃酮等96 個代謝產(chǎn)物，且多個代謝產(chǎn)物富集到膽堿能突觸代謝和甘油磷脂代謝相關(guān)通路。由于后生素進(jìn)一步避免了細(xì)菌通過胃腸道屏障或者抗生素耐藥的風(fēng)險，同時保留了益生菌的功效，被認(rèn)為是對易受感染的患者（例如免疫功能低下或重病兒童和早產(chǎn)兒）使用活菌更安全的替代品［27-29］。深度測序的發(fā)展有助于進(jìn)一步揭示特定腸道微生物群落及其代謝產(chǎn)物與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。已有研究表明腸道微生物可以分解膳食中的碳水化合物產(chǎn)生丁酸鹽等，有助于修復(fù)腸道屏障并抑制IEC 細(xì)胞凋亡，也可能通過降低IEC 組蛋白乙?；?，從而減輕aGVHD［5］。丁酸鹽還具有抗炎特性，可以調(diào)節(jié)局部入侵細(xì)菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究表明B.fragilis T6SS 顯著改變腸道代謝組，這或許是由于T6SS 對菌群結(jié)構(gòu)數(shù)量的改變所引起的。本研究篩選到的差異代謝產(chǎn)物，是否對腸道屏障起到直接的保護(hù)作用，還需要進(jìn)行深入的機(jī)制研究和功能驗(yàn)證。

在營養(yǎng)和空間有限的腸道環(huán)境中，微生物必須使用各種策略與宿主和其他細(xì)菌共存或競爭。T6SS在腸道細(xì)菌中普遍存在，是影響微生物群組成的相互作用力之一。T6SS 最初被認(rèn)為是革蘭氏陰性菌中的一種接觸依賴性殺菌機(jī)制［30］。然而，近年的研究極大擴(kuò)展了其功能靶標(biāo)和分泌機(jī)制［31］。病原菌可以利用T6SS 促進(jìn)人類腸道中宿主細(xì)胞的相互作用和發(fā)病機(jī)制，而共生生物可以通過菌群競爭殺傷其他細(xì)菌來定殖特定的生態(tài)位。每分鐘每克結(jié)腸內(nèi)發(fā)生超過109次T6SS 分泌事件，表明T6SS 在多種水平上調(diào)節(jié)和塑造腸道菌群的穩(wěn)定性［32］。目前，通過表達(dá)針對靶標(biāo)的納米抗體，構(gòu)建了具有增強(qiáng)細(xì)胞黏附能力的程序化抑制細(xì)胞（PIC），可以增加T6SS 的殺傷能力和殺傷譜［33］。結(jié)合這些成功的嘗試和本研究的結(jié)果，對T6SS 進(jìn)行利用和工程化改造，是對腸道菌群進(jìn)行定向干預(yù)的方法之一。

B.fragilis T6SS 對腸道屏障的保護(hù)性是通過直接的蛋白分泌，或是通過間接的菌種競爭尚需進(jìn)一步地探索。對共生菌T6SS 作用機(jī)制的深入研究能夠進(jìn)一步剖析腸道微生物及細(xì)菌產(chǎn)物與人類細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，可以為腸道精準(zhǔn)改造治療提供更為安全有效的備選工程菌，具有重大的臨床意義。

4 結(jié)論

本研究表明擬桿菌B.fragilis T6SS 顯著改變腸道代謝組，并影響腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，保護(hù)腸道屏障的完整性，減輕DSS 誘導(dǎo)的腸炎。