王野諶 邱智東 張衍旭 王儷穎 王茂旭 董雪蓮

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 長春 130117）

薏苡竹葉散（Yiyi-zhuye powder， YZP）出自清代吳鞠通所著《溫病條辯》，由薏苡仁、淡竹葉、飛滑石、豆蔻仁、連翹、茯苓和通草7 味藥材組成，具辛涼解表、淡滲利濕之功，是除溫濕之名方，吳鞠通稱其為“雙解表里之妙法”［1］?，F(xiàn)代臨床主要用于治療濕疹、蕁麻疹、手足口病和帶狀皰疹等疾病［2-4］。散劑指由藥材或藥材與適宜輔料粉碎后混勻得到的干燥粉末狀制劑，是中醫(yī)重要傳統(tǒng)劑型之一［5］，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有述： “散者散也，去急病用之”，具有起效快、效果顯著和制作方法簡單等諸多優(yōu)勢，至今仍被廣泛應(yīng)用［6-7］。但由于散劑劑型原始、制劑工藝粗糙，加之研究基礎(chǔ)薄弱、研究進(jìn)展緩慢，散劑的現(xiàn)代發(fā)展與傳承舉步維艱［8-10］。

目前，有關(guān)YZP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究相對較少且對其臨床應(yīng)用的研究占絕大多數(shù)［3］，缺乏整體的指紋圖譜、含量測定以及制劑工藝研究，因此為了促進(jìn)YZP 復(fù)方的開發(fā)應(yīng)用，通過查閱古籍文獻(xiàn)確定YZP 的處方劑量和制備工藝，采用高效液相色譜（HPLC）法開展YZP指紋圖譜和含量測定研究，探究葒草苷、異葒草苷在淡竹葉飲片-YZP 復(fù)方的量值傳遞規(guī)律，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)闡明15 批YZP 的整體質(zhì)量和差異性成分，初步建立YZP質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以期為YZP后續(xù)制劑研究與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（HPLC，美國安捷倫科技有限公司）；EL204 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；MS105型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ZN-20L型小型粉碎機(jī)（北京中科耐馳技術(shù)有限公司）。

連翹苷對照品（批號： 110821-202117，純度94.9%）、連翹酯苷A 對照品（批號： 111810-202108，純度96.2%）和異葒草苷對照品（批號： 111974-201401，純度98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；葒草苷對照品（批號： G11N11L130730，純度98%）、牡荊素（批號： M12GB14216，純度98%）和異牡荊素（批號： 27GB165516，純度98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純（美國Fisher scientific公司）；磷酸為分析純，購自于天津市永大化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

YZP 中所涉及到的飲片均購自于各主產(chǎn)地，飲片的批號、產(chǎn)地等相關(guān)信息見表1。經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翁麗麗教授鑒定： 薏苡仁為禾本科植物薏米Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟種仁； 淡竹葉為禾本科植物淡竹葉Lophatherum gracileBrongn 的干燥莖葉；飛滑石為硅酸鹽類礦物滑石族滑石經(jīng)水飛法炮制后的粉末； 豆蔻仁為姜科植物白豆蔻Amomum kravanh Pierre exGagnep. 的干燥成熟果實(shí)； 連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.） Vahl 的干燥果實(shí)； 茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核；通草為五加科植物通脫木Tetrapanax papyrifer（Hook.） KKoch的干燥莖髓。

表1 YZP中飲片產(chǎn)地來源及批號Table 1 Origin and batch number of YZP Chinese decoction pieces

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 YZP制備工藝考證

《溫病調(diào)辯》［1］中記載薏苡竹葉散用法用量為： “薏苡五錢，竹葉三錢，飛滑石五錢，白蔻仁一錢五分，連翹三錢，茯苓塊五錢，白通草一錢五分，共為細(xì)末，每服五錢，日三服”。經(jīng)查閱《中國科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》［11］、《中國歷代度量衡單位量值表及說明》［12］等書籍文獻(xiàn)后確定，清代一錢約為今之3.73 g，一分約合0.373 g。

細(xì)末在古代口服散劑中應(yīng)用較多，張仲景《傷寒論》中五苓散原方粉碎粒度為“為細(xì)末”［13］，2020 版《中國藥典》中粉末粒度被分為最粗粉、粗粉、中粉、細(xì)粉、最細(xì)粉和極細(xì)粉6 個(gè)規(guī)格，其中五苓散制法為“粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻，分裝”。因此，根據(jù)古今對照建議原方中“細(xì)末”采用2020 版《中國藥典》中細(xì)粉規(guī)格，即過六號篩（150 μm）。

綜上所述，最終確認(rèn)YZP現(xiàn)代制備工藝為： 薏苡仁18.65 g，淡竹葉11.19 g，飛滑石18.65 g，豆蔻仁5.595 g，連翹11.19 g，茯苓18.65 g，通草5.595 g，粉碎后過六號篩（150 μm）篩，即得。

1.2.2 指紋圖譜測定方法

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取連翹苷、連翹酯苷A、葒草苷、異葒草苷、牡荊素和異牡荊素對照品適量，加入80 %甲醇溶液分別制成濃度為86.52、30.02、62.34、49.33、89.89和74.36 μg/mL的單一對照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取5.0 g YZP 樣品（S15），精密加入30 mL 80%甲醇，超聲處理30 min（500 W，40 kHz），冷卻至室溫后補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

1.2.2.3 各單味飲片溶液的制備

分別精密稱取YZP樣品（S1）中各單味飲片，即薏苡仁18.65 g，淡竹葉11.19 g，飛滑石18.65 g，豆蔻仁5.595 g，連翹11.19 g，茯苓18.65 g，通草5.595 g，精密加入30 mL 80%甲醇，超聲處理30 min（500 W，40 kHz），冷卻至室溫后補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，濾液濃縮至5 mL，過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

1.2.2.4 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse SB-C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）； 流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5% A； 20～30 min，5%～10% A； 30～40 min，10%～13% A； 40～60 min，13%～15% A； 60～80 min，15%～16% A； 80～110 min，16%～28% A； 110～130 min，28%～8% A）； 流速為0.8 mL/min；檢測波長為210 nm； 柱溫為30 ℃； 對照品及供試品溶液進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.3 葒草苷、異葒草苷含量測定方法

1.2.3.1 供試品溶液的制備

1）淡竹葉飲片： 精密稱取2.0 g淡竹葉飲片樣品（S1），置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 60%乙醇，超聲處理30 min（500 W，40 kHz），冷卻至室溫后用60%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2）YZP： 精密稱取5.0 g YZP樣品（S15），置具塞錐形瓶中，精密加入40 mL 60%乙醇，超聲處理30 min（500 W，40 kHz），濾過，容器洗滌3 次，合并溶液，蒸干，精密加入5 mL 60%乙醇溶解，過濾，續(xù)濾液過0.45 μm的微孔濾膜，即得。

1.2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取葒草苷、異葒草苷對照品，加入60%乙醇定容至20 mL，分別制備質(zhì)量濃度為33.20 和64.17 μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.3.3 陰性樣品溶液的制備

按處方比例稱取各藥材，按照1.2.3.1小節(jié)步驟2）制備不含淡竹葉的陰性樣品溶液。

1.2.3.4 色譜條件

色譜柱： Agilent Eclipse SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）； 流動相： 乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，8% A；7～17 min，8%～13% A； 17～30 min，13%～15% A； 30～45 min，15%～18% A； 45～50 min，18%～8% A； 50～56 min，8% A）； 流速： 0.8 mL/min； 檢測波長： 360 nm； 柱溫： 30 ℃； 進(jìn)樣量： 10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 15 批YZP指紋圖譜建立

2.1.1 相似度評價(jià)及色譜峰歸屬

取15批YZP樣品（S1-S15）以及各單味飲片按照1.2.2.2小節(jié)和1.2.2.3小節(jié)方法制備供試品溶液，按照1.2.2.4小節(jié)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件進(jìn)行分析，以S1 為參照圖譜，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正后匹配生成YZP 指紋圖譜，結(jié)果見圖1。21 個(gè)共有峰相似度為0.956～0.995，結(jié)果見表2 和表3，符合指紋圖譜要求，認(rèn)為15 批YZP 化學(xué)構(gòu)成相似。所得薏苡仁、淡竹葉、連翹、豆蔻仁、飛滑石、茯苓和通草各單味飲片圖譜見圖2。結(jié)果顯示，全方中21 個(gè)共有峰多數(shù)來自于淡竹葉、連翹、豆蔻仁和薏苡仁，而通草、滑石和茯苓3 味飲片色譜峰較少，這可能與飲片成分檢測特殊性關(guān)有。

圖1 15批YZP HPLC指紋圖譜和對照指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints and control fingerprints of 15 batches of YZP

圖2 YZP中單味飲片測定結(jié)果Fig.2 Results of single decoction pieces in YZP

表2 YZP指紋圖譜相似度值Table 2 Similarity value of YZP fingerprint

表3 15批YZP指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果Table 3 Similarity evaluation results of 15 batches of YZP fingerprint

將YZP 指紋圖譜與各對照品色譜圖比對，以保留時(shí)間是否相近為主要評判標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)結(jié)合色譜圖中其它信息，最終指認(rèn)出6 個(gè)成分，分別為9 號峰（異葒草苷）、10 號峰（葒草苷）、13 號峰（牡荊素）、14 號峰（異牡荊素）、15 號峰（連翹酯苷A）和20 號峰（連翹苷）。由于16 號峰分離度良好且峰面積適宜，因此選擇16號色譜峰為參照峰，計(jì)算出各共有峰的相對峰面積值，結(jié)果RSD值在12.2%～133.3%之間，反映不同批次YZP中各成分含量相差較大，質(zhì)量有明顯區(qū)別，具體結(jié)果見表4。

表4 15批YZP共有峰相對峰面積Table 4 Common peak-peak area of 15 batches of YZP

2.1.2 方法學(xué)考察

2.1.2.1 專屬性考察

取1.2.2.1 和1.2.2.2 小節(jié)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各10 μL，按1.2.2.4 小節(jié)色譜條件注入高效液相色譜儀測定，結(jié)果顯示各對照品峰形良好，分離度較高（R＞1.5），理論塔板數(shù)按連翹苷計(jì)不低于5000，表明該方法具有較強(qiáng)的專屬性，結(jié)果見圖3。

圖3 YZP指紋圖譜專屬性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test of YZP fingerprint

2.1.2.2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取1.2.2.2小節(jié)供試品溶液10 μL，按照1.2.2.4小節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，將22號峰（連翹酯苷A）作為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積值。結(jié)果顯示，RSD值均小于2%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取1.2.2.2 小節(jié)供試品溶液6 份，精密吸取10 μL 并按照1.2.2.4 小節(jié)色譜條件分別測定6 次，將22 號峰（連翹酯苷A）作為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積值。結(jié)果顯示，RSD值均小于2%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將1.2.2.2小節(jié)供試品溶液于室溫下放置0、2、4、6、8、12和24 h后，精密吸取10 μL，按照1.2.2.4小節(jié)色譜條件測定6 次，將22 號峰（連翹酯苷A）作為參照峰，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積值。結(jié)果顯示，RSD值均小于2%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 飲片-YZP中葒草苷、異葒草苷含量測定

2.2.1 淡竹葉飲片-YZP樣品葒草苷、異葒草苷含量對應(yīng)關(guān)系

將15批飲片按照表1排序依次搭配成15批YZP（S1-S15），按1.2.3.4小節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，測定淡竹葉飲片和YZP樣品的異葒草苷含量，考察淡竹葉飲片-方的質(zhì)量傳遞關(guān)系如公式（1）［14-15］所示：

結(jié)果見表5 和表6。15 批淡竹葉飲片中葒草苷、異葒草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2156%～0.9923%、0.530%～2.052%，15批YZP中葒草苷、異葒草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.022%～0.112%、0.065%～0.312%，飲片-YZP中葒草苷、異葒草苷轉(zhuǎn)移率為78.41%～119.54%、74.57%～127.96%，葒草苷、異葒草苷從飲片到處方的轉(zhuǎn)移率在平均值±30%范圍內(nèi)，未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)，符合相關(guān)規(guī)定，表明樣品的制備工藝穩(wěn)定可靠。

表5 飲片-YZP樣品葒草苷質(zhì)量傳遞結(jié)果Table 5 The mass transfer results of orientin between decoction pieces and YZP sample

表6 飲片-YZP樣品異葒草苷質(zhì)量傳遞結(jié)果Table 6 The mass transfer results of isoorientin between decoction pieces and YZP sample

2.2.2 方法學(xué)考察

2.2.2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

取1.2.3.2 小節(jié)2 種對照品溶液各10 μL，按照1.2.3.4 小節(jié)色譜條件分別進(jìn)行HPLC 測定，結(jié)果顯示葒草苷、異葒草苷峰形良好，分離度高（R＞1.5），理論塔板數(shù)不低于5000。

2.2.2.2 線性關(guān)系考察

1）淡竹葉飲片： 精密吸取濃度為0.5001 和0.4990 mg/mL 的葒草苷、異葒草苷對照品溶液，加甲醇制成一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照1.2.3.4 小節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表7。

表7 淡竹葉飲片與YZP中異葒草苷線性關(guān)系考察結(jié)果Table 7 Results of isoorientin linear relationship investigation between Lophatheri Herba and YZP

2）YZP： 精密吸取濃度為0.1227 和0.2466 mg/mL 的葒草苷、異葒草苷對照品溶液，加甲醇制成一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照1.2.3.4小節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表7。

2.2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取1.2.3.2 小節(jié)對照品溶液各10 μL，按照1.2.3.4 小節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次。飲片和處方中葒草苷、異葒草苷RSD 值分別為0.46%、0.26%（n=6）和0.77%、1.49%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取淡竹葉飲片和YZP樣品各6份，按1.2.3.1小節(jié)方法制備，依1.2.3.4小節(jié)色譜條件測定，計(jì)算平均含量及RSD 值。淡竹葉飲片、YZP中葒草苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5971%為0.0720%，RSD 值為0.43%、2.59%； 異葒草苷平均含量分別為1.201%、0.1885%，RSD 值為0.25%、2.94%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按1.2.3.1 小節(jié)方法制備溶液，分別在0、2、4、8、12 和24 h 進(jìn)樣，依法測定，考察樣品穩(wěn)定性。淡竹葉飲片、YZP 中葒草苷峰面積RSD 值為3.06%、2.69%，異葒草苷峰面積RSD 值為3.20%、1.14%，表明供試品溶液在制備24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2.6 加樣回收率

1）淡竹葉飲片： 精密稱取淡竹葉飲片樣品（S1）樣品0.5 g，共6 份，按1∶1 質(zhì)量比精密加入對照品，按1.2.3.1小節(jié)方法制備溶液，按1.2.3.4小節(jié)色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表8和表9。葒草苷平均加樣回收率為99.43%，RSD為1.53%； 異葒草苷平均加樣回收率為96.84%，RSD為0.69%，表明方法準(zhǔn)確性較好。

表8 葒草苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 8 Spike-and-recovery experiment of orientin

表9 異葒草苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 9 Spike-and-recovery experiment of orientin

2）YZP： 精密稱取YZP（S15）樣品2.5 g，共6份，按1∶1質(zhì)量比精密加入對照品，按1.2.3.1小節(jié)方法制備溶液，按1.2.3.4小節(jié)色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表8和表9。葒草苷平均加樣回收率為100.53%，RSD為1.60%； 異葒草苷平均加樣回收率為100.68%，RSD為1.16%，表明方法準(zhǔn)確性較好。

2.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.3.1 CA

將15 批YZP 樣品21個(gè)共有峰峰面積作為15×21階原始數(shù)據(jù)矩陣輸入到Origin 2019b（64 Bit）中，聚類方法選擇系統(tǒng)聚類分析法，度量標(biāo)準(zhǔn)選擇Euclidean 距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，15 批YZP 被分為A 類（1、3-6、9、11、13、14 批）和B 類（2、7、12、15 批），說明不同批次之間的YZP 間存在質(zhì)量差異。所采購的飲片多數(shù)有2 種以上的主產(chǎn)區(qū)，因此，由于氣候、土壤、水質(zhì)和采收時(shí)間等因素的不同，藥材的質(zhì)量也良莠不齊［16］。YZP屬B類的第2、7、12和15批次中相比于A類飲片來自道地產(chǎn)地的較多，與其它來源的藥材相比，其質(zhì)量更好，因此推測道地藥材的種類在方劑中所占的比例與復(fù)方整體質(zhì)量密切相關(guān)。

圖4 15批YZP聚類分析（CA）結(jié)果Fig.4 Results of 15 batches of YZP CA

2.3.2 PCA

以YZP指紋圖譜21個(gè)共有峰峰面積的15 × 21階原始數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析，共得到3 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率82.4%，表明這3 個(gè)主成分能夠體現(xiàn)出大部分信息； 15 批YZP 被劃分為兩類，印證了聚類分析結(jié)論。此外，解釋能力參數(shù)R2x和預(yù)測能力參數(shù)Q2兩個(gè)值分別為0.885 和0.61，均大于0.5，說明模型的穩(wěn)定性高、預(yù)測能力好［17］。PCA得分圖見圖5。

圖5 YZP主成分分析（PCA）得分圖Fig.5 PCA score chart of YZP

2.3.3 OPLS-DA

將15×21階原始數(shù)據(jù)矩陣輸入SIMCA 14.1中進(jìn)行OPLS-DA，其相關(guān)分析所得圖見圖6。其中，R2x、R2y和Q2值分別為0.629、0.997、0.994，均大于0.5，反應(yīng)模型本身具有較好的預(yù)測性、穩(wěn)定性［18］。圖6A進(jìn)一步印證了CA 和PCA 的結(jié)論； VIP 值（變量投影重要性值）反應(yīng)每一指標(biāo)對整體的貢獻(xiàn)度，一般認(rèn)為VIP 值≥1時(shí)具有參考意義［19］，另外VIP 值越大，其貢獻(xiàn)率越大，圖6B 中貢獻(xiàn)率由大致小分別為17、5、1、8、9（異葒草苷）、18、16、20（連翹苷）、21和13（牡荊素）號峰，貢獻(xiàn)率均具有參考意義； 另外，還考察了模型擬合程度，隨機(jī)排列200 次Y矩陣變量進(jìn)行permutation 實(shí)驗(yàn)，所得圖見圖6C，結(jié)果顯示R2截距0.358（一般R2＜0.4），Q2截距-0.705（一般Q2＜0.05），無過度擬合的情況［20］，適用于YZP 批次間質(zhì)量差異的判別與分析。

圖6 15批YZP OPLS-DA分析結(jié)果Fig.6 OPLS-DA analysis results of 15 batches of YZP

OPLS-DA中獲得了貢獻(xiàn)率較大10個(gè)差異性成分，其中包含了連翹苷、連翹酯苷A、異葒草苷和牡荊素等，與其能治療皮膚炎癥性疾病有密切關(guān)系，楊本軍等［21］認(rèn)為連翹苷能夠?qū)χ嗵钦T導(dǎo)的炎癥具有調(diào)控作用； Sung等［22］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)連翹中的連翹酯苷A、連翹苷、松脂醇二葡萄糖苷和連翹脂素4個(gè)成分通過抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞TARC、MDC和RANTES的產(chǎn)生進(jìn)而改善過敏性皮炎； Shi等［23］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)直接靜脈注射異葒草苷能夠有更好的提高生物利用度和維持更長時(shí)間的有效濃度，從而達(dá)到抗炎抗氧化的作用； Zhang等［24］認(rèn)為牡荊素能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞的凋亡，使炎癥因子水平正常化，對于炎癥治療有很好的療效。

2.4 供試品溶液制備方法考察

供試品溶液制備主要考察了不同提取溶劑（60%、80%、100%甲醇和乙醇）、不同提取時(shí)間和不同提取方法（回流30、60 和90 min； 超聲15、30 和45 min）3 個(gè)方面，通過比對色譜峰峰形、數(shù)量、峰面積和分離度等，最終認(rèn)為80%甲醇超聲提取30 min不僅提取時(shí)長適宜、提取方法易操作，而且色譜圖的整體效果最佳。除此之外，還考察了不同供試品溶液濃度，確定加入溶劑量為30 mL，分別稱取YZP樣品3.00、5.00 和8.00 g，觀察后確認(rèn)在取樣量為5.00 g時(shí)其峰面積大小與強(qiáng)度適中。

2.5 色譜條件考察

通過DAD檢測器對YZP供試品溶液進(jìn)行全波段掃描，在210 nm條件下指紋圖譜信息的完整性和基線平穩(wěn)程度較高，能夠使指紋圖譜信息最大化，同時(shí)也有適宜的色譜峰數(shù)量、峰形和分離度。考察了不同流動相對色譜圖的影響，分別為有機(jī)相（甲醇、乙腈）和無機(jī)相（水、0.05%及0.1%的甲酸水溶液、磷酸水溶液），梯度洗脫后確定流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液。另外，還對不同流速（0.8 和1.0 mL/min），不同柱溫（30、35和40 ℃），不同進(jìn)樣量（2、5和10 μL）進(jìn)行考察，確定最終條件為“流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣10 μL”。以上研究進(jìn)一步確定了YZP 指紋圖譜分析方法，方法學(xué)驗(yàn)證的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性RSD均小于2%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

2.6 指紋圖譜建立

本研究建立了YZP 的指紋圖譜，但對于處方中的礦物藥滑石粉和特殊質(zhì)地藥材通草無法檢測到相關(guān)色譜峰，后續(xù)應(yīng)采用液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)探究二者化學(xué)組成及檢測指標(biāo)。

滑石粉為硅酸鹽類礦物，主要成分為含水硅酸鎂，2020 版中國藥典中采用了滴定法對其中的可溶性鈣鎂進(jìn)行含量測定，除此之外有少量文獻(xiàn)報(bào)道了對滑石粉的質(zhì)量控制方法，多采用了粉末X射線衍射技術(shù)［25-26］，因此YZP中滑石粉的質(zhì)量控制方法需要后續(xù)單獨(dú)建立。

通草為五加科植物通脫木Tetrapanax papyrifer（Hook.） KKoch 的干燥莖髓，其本身質(zhì)地疏松輕盈，在稱量提取過程中存在體積大、易飛絮、吸水性強(qiáng)等問題，導(dǎo)致了含量測定困難。而2020版中國藥典中并未建立通草的含量測定方法，有文獻(xiàn)建立了通草水提液-三氯甲烷萃取部位的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜［27］，因此對通草的提取方法和測定方法應(yīng)重新進(jìn)行考察。

3 結(jié) 論

采用HPLC 法建立YZP指紋圖譜測定方法和YZP中葒草苷、異葒草苷含量測定方法，輔以化學(xué)計(jì)量學(xué)分析篩選出導(dǎo)致組間差異的主要成分，實(shí)現(xiàn)了YZP 的外部質(zhì)量控制及內(nèi)部影響質(zhì)量因素探究，同時(shí)通過對淡竹葉飲片-YZP復(fù)方的量值傳遞規(guī)律的把握，進(jìn)一步確定了YZP “外部質(zhì)量控制-內(nèi)部質(zhì)量探究-制備工藝確認(rèn)”的質(zhì)量評價(jià)體系，為后續(xù)YZP的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。