何 斐 劉 歡 李 川 崔 鳴 魏夢(mèng)琳 丁龍飛 劉 斌 段 杉

（安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000）

魔芋（Amorphophalluskonjac）軟腐病是由胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum）［1］、環(huán)狀果膠桿菌（Pectobacterium aroidearum）［2］、迪基氏菌屬（Dickeyaspp.）［3］等病原菌侵染引起的土傳和種傳病害，危害極其嚴(yán)重，防治困難，至今未找到一種有效的防治方法。前人研究表明，作物土傳病害的發(fā)生與根際微生物相關(guān)，且一些有益微生物可以有效降低土傳病害的發(fā)病率［4］。Dong等［5］研究證實(shí)，芽孢桿菌（Bacillus）能降低檳榔芋（Colocasia esculenta）軟腐病的發(fā)病率；Dong 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，黃粘球菌（Myxococcusxanthus）作為潛在的生防制劑，可以通過(guò)捕食和分泌胞外裂解酶來(lái)有效防治番茄（Lycopersicon esculentum）細(xì)菌性青枯病；假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）中的許多菌株可以有效緩解病原細(xì)菌和病原真菌引起的土傳病害［7-8］。眾多研究表明，作物抵抗土傳病害的能力與其根際細(xì)菌群落的豐度和多樣性密切相關(guān)［9］。

間作是一種能有效抑制作物土傳病害的生態(tài)農(nóng)業(yè)種植制度。目前，間作控病機(jī)理特別是作物根際微生物層面的研究逐漸得到重視。間作能增加土壤生物多樣性以及有益微生物種類和數(shù)量，從而減輕土傳病害［10］。Jin 等［11］利用小麥（Triticumaestivum）與黃瓜（Cucumis sativus）間作，發(fā)現(xiàn)小麥間作促進(jìn)了黃瓜根際潛在有益微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而降低了黃瓜枯萎病的嚴(yán)重程度。Yu 等［12］研究表明，與西瓜（Citrullusvulgaris）單作相比，間作小麥的西瓜根際細(xì)菌群落更穩(wěn)定，其枯萎病發(fā)病指數(shù)更低。然而，根際微生物影響病原菌和間作作物的方式極其復(fù)雜，且不同間作搭配組合的抗病效果有所差異。因此有必要對(duì)特定作物間作模式下的根際微生態(tài)特征進(jìn)行深入研究。從微觀角度了解間作作物病害地下部機(jī)理有助于對(duì)特定作物間作控病的具體措施進(jìn)行宏觀調(diào)控，為優(yōu)化栽培管理措施及構(gòu)建可持續(xù)發(fā)展的間作技術(shù)體系提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

關(guān)于魔芋軟腐病與土壤微生物多樣性之間關(guān)系的研究已有相關(guān)報(bào)道。如何斐等［13］研究表明，魔芋軟腐病發(fā)病率和病情指數(shù)與魔芋根系和根際土壤叢枝菌根真菌總侵染率、侵染強(qiáng)度和孢子密度呈極顯著負(fù)相關(guān)；Yang 等［1］研究發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種侵染導(dǎo)致魔芋根際土壤細(xì)菌和真菌群落發(fā)生明顯改變。但有關(guān)魔芋軟腐病防治與土壤微生物多樣性之間關(guān)系的研究較少，特別是間作刺槐（Robiniapseudoacacia）對(duì)魔芋根際微生物多樣性影響的研究尚少見(jiàn)報(bào)道。長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐證明，間作刺槐能有效防控魔芋軟腐病的發(fā)生［14］，然而其微生態(tài)機(jī)理尚有待研究?；诖?，本研究借助Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)分析刺槐‖魔芋種間互作對(duì)魔芋根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響及其與軟腐病發(fā)病率之間的關(guān)系，旨在為通過(guò)間作套種等農(nóng)藝措施改善土壤微生態(tài)環(huán)境及土傳病害防控提供理論支撐，也為深入理解特定作物間作套種模式下的根際微生態(tài)特征提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施

試驗(yàn)于2021年5月3日在安康學(xué)院農(nóng)學(xué)大棚進(jìn)行。刺槐和魔芋根系分隔采用兩室根箱隔網(wǎng)裝置（圖1）設(shè)置3個(gè)處理：（1）塑料膜全隔單作（film complete separation，F(xiàn)）作為對(duì)照；（2）25 μm 尼龍網(wǎng)隔半間作（mesh semiseparation，M），水分和養(yǎng)分可穿過(guò)，但根系不能通過(guò)；（3）無(wú)隔間作（non-separation，N）。每處理重復(fù)3次。

圖1 刺槐（A）和魔芋（B）不同根系分隔處理模式圖Fig.1 Schematic diagram of R.pseudoacacia （A） and A.konjac （B） plants under different root separation treatments

以種植1 年魔芋的連作土壤（第一茬魔芋軟腐病平均發(fā)病率為3.7%）作為供試土壤，其類型為黃棕壤，基本理化性質(zhì)：pH 值7.07，全氮1.46 g·kg-1，全磷0.87 g·kg-1，全鉀20.05 g·kg-1，速效氮27.9 mg·kg-1，速效磷70.2 mg·kg-1，速效鉀108.4 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)14.69 g·kg-1。土壤去雜后添加有機(jī)肥50 g·kg-1，育苗基質(zhì)20 g·kg-1，充分混勻用作栽培基質(zhì)。

挑選飽滿的刺槐種子用10% H2O2消毒15 min，蒸餾水沖洗6 次、無(wú)菌水浸泡18 h，置于鋪有濕潤(rùn)紗布的托盤上，25 ℃光照培養(yǎng)箱中催芽，每天光照10 h、換1 次水。當(dāng)刺槐種子胚根生長(zhǎng)至約0.1 cm 時(shí)播種在A室根箱中，刺槐出苗后生長(zhǎng)至3 cm 時(shí)，各處理保留長(zhǎng)勢(shì)一致的5株幼苗。

挑選質(zhì)量為20 g、頂芽健康露白的魔芋球莖作為供試種芋，播種前用20%噻菌銅懸浮劑均勻噴霧消毒和晾曬。在A 室刺槐生長(zhǎng)30 d 后，將消毒晾曬處理后的魔芋播種至B 室中，各處理播種3 株。播種后將根箱置于透光率為50%的遮陽(yáng)網(wǎng)下，植株生長(zhǎng)期內(nèi)2 d澆1次水，澆至土壤相對(duì)含水量為75%。

于2021 年9 月10 日球莖膨大期采集各處理的魔芋根系，同時(shí)采用抖根法［15］收集魔芋根際土壤。每個(gè)處理各采集3 個(gè)根系（root，R）樣品和3 個(gè)根際土壤（soil，S）樣品，將采集的根系樣品用大量無(wú)菌水反復(fù)沖洗處理干凈后放入液氮速凍，再轉(zhuǎn)存于-80 ℃超低溫冰箱，用于分析細(xì)菌多樣性。土壤樣品剔除沙石等雜物后，部分土樣轉(zhuǎn)入無(wú)菌凍存管中，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，用于16S rDNA 測(cè)序分析土壤細(xì)菌多樣性及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因拷貝數(shù)；剩余土樣自然風(fēng)干后過(guò)0.25 或1 mm篩，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定 土壤理化性質(zhì)測(cè)定參考《土壤農(nóng)化分析》［16］，采用凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮（total nitrogen，TN）含量；通過(guò)堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮（alkali-hydrolyzable nitrogen，AN）含量；采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤全磷（total phosphorus，TP）含量；采用碳酸氫鈉-鉬銻抗分光光度法測(cè)定土壤速效磷（available phosphorus，AP）含量；采用氫氧化鈉熔融-火焰光度法測(cè)定土壤全鉀（total potassium，TK）含量；采用醋酸銨-原子吸收火焰分光光度計(jì)法測(cè)定土壤速效鉀（available potassium，AK）含量；采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測(cè)定土壤有機(jī)碳（soil organic carbon，TOC）含量；采用電位法（水土比2.5∶1）測(cè)定土壤pH值。

1.2.2 魔芋軟腐病病害調(diào)查 于魔芋播種后50（出苗期）、75（發(fā)病高峰期）和200 d（球莖膨大期）分別調(diào)查統(tǒng)計(jì)魔芋軟腐病害嚴(yán)重程度。發(fā)病程度分4個(gè)等級(jí)：0級(jí)，健康無(wú)發(fā)病癥狀；1級(jí)，＜25%植株出現(xiàn)軟腐病癥；2級(jí)，25%～75%植株出現(xiàn)軟腐癥狀；3級(jí)，＞75%植株受侵染。根據(jù)費(fèi)甫華等［17］的方法計(jì)算魔芋軟腐病病情指數(shù)（disease index，DI）和防治效果（control efficiency，CE）：

1.2.3 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增測(cè)序 按照FastDNA?Spin Kit for Soil 試劑盒（美國(guó)MPbio 公司）說(shuō)明書(shū)步驟分別提取魔芋根系和根際土壤總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性，使用NanoDrop 2000 核酸定量?jī)x（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）檢測(cè)DNA 濃度和純度。以細(xì)菌V3～V4 區(qū)的16S rDNA 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）［18］。

使用TransGen AP221-02試劑盒（北京全式金公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1三磷酸脫氧核苷酸2 μL，5 μmol·L-1上下游引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，1%牛血清白蛋白溶液（大連TaKaRa 公司）0.2 μL，DNA 模板10 ng，補(bǔ)ddH2O 至20 μL。PCR 程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，28次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，按照AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（美國(guó)Axygen 公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 產(chǎn)物純化，用QuantiFluorTM-ST（美國(guó)Promega 公司）進(jìn)行定量。通過(guò)Illumina NovaSeq 6000 PE250 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，由上海派森諾生物科技股份有限公司提供技術(shù)支持。

1.2.4 氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)固氮過(guò)程（nifH）、氨氧化過(guò)程（氨氧化古菌AOAamoA和氨氧化細(xì)菌AOBamoA）、反硝化過(guò)程（narG、nirS、nirK和nosZ）的7 個(gè)功能基因拷貝數(shù)。qRT-PCR 反應(yīng)在Light Cycler?480 thermocycler（美國(guó)Axygen公司）平臺(tái)進(jìn)行，定量引物序列及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR?Premix Ex Taq（大連TaKaRa 公司）10 μL，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，10 ng·μL-1土壤DNA 1 μL，1%牛血清白蛋白溶液（大連TaKaRa 公司）0.2 μL，ddH2O 6.8 μL。

表1 氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因qRT-PCR引物及反應(yīng)條件Table 1 qRT-PCR primers and reaction conditions for key functional genes related to nitrogen cycling

用插入目的片段且拷貝數(shù)已知的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過(guò)10 倍系列稀釋，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)3 次。質(zhì)粒的制作：采用表1 中相應(yīng)的引物對(duì)氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用膠回收試劑盒（大連TaKaRa公司）進(jìn)行目的基因回收純化。純化的目的基因連接到pMD18-T 質(zhì)粒載體上，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑出陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接LB 液體培養(yǎng)基37 ℃、160 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)18 h，部分菌液送至上海生工測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆菌落，用TIANprep Mini Plasmid Kit 質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取質(zhì)粒DNA。用Nanodrop 2000C 分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）測(cè)定質(zhì)粒濃度。基于測(cè)出的質(zhì)粒濃度，調(diào)整PCR 體系中模板的加入量。采用LightCycler?480熒光定量PCR儀（美國(guó)Axygen公司）進(jìn)行擴(kuò)增，以循環(huán)數(shù)閾值（cycle threshold，Ct）為橫坐標(biāo)，以標(biāo)樣拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值［log10（拷貝數(shù)）］為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

通過(guò)將土壤氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因Ct 值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，用獲得的拷貝數(shù)，參照文獻(xiàn)［25］的公式計(jì)算每克干土中的功能基因拷貝數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用QIIME 2 分析流程［26］進(jìn)行質(zhì)控、拼接和降噪處理，聚類為擴(kuò)增子序列變體（amplicon sequence variants，ASVs），比對(duì)Silva 138/16s_bacterial 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置閾值為0.7，按最小樣本序列抽平。生信分析在上海派森諾基因云平臺(tái)（https：//www.genescloud.cn/）中進(jìn)行，原始數(shù)據(jù)上傳至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）旗下的序列閱讀檔案（Sequence Read Archive，SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：PRJNA906959，各樣本序列登錄號(hào)SAMN31943274～SAMN31943291）。

使用Mothur 軟件［27］進(jìn)行細(xì)菌群落α 多樣性分析，利用基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）分析不同處理細(xì)菌β 多樣性，結(jié)合Adonis 分析進(jìn)行處理間差異檢驗(yàn)；使用Canoco 5 軟件進(jìn)行細(xì)菌群落與土壤因子之間的冗余分析（redundancy analysis，RDA）。運(yùn)用微科盟生科云平臺(tái)（https：//www.bioincloud.tech/）進(jìn)行細(xì)菌群落Circos圖的制作。在chiplot 在線網(wǎng)站（https：//www.chiplot.online/）進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析和繪圖。使用SPSS 22.0 軟件對(duì)不同處理間氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因拷貝數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，以Duncan 多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋根系和根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.1.1 α 多樣性指數(shù) 由表2 可知，無(wú)隔處理的魔芋根系和土壤細(xì)菌Observed species 和Chao 1 指數(shù)均最大，細(xì)菌物種最豐富，與全隔處理相比差異達(dá)到顯著水平。不同分隔處理魔芋根系細(xì)菌多樣性水平也存在一定的差異，無(wú)隔處理的魔芋根系細(xì)菌群落多樣性水平最高，其Shannon 指數(shù)顯著高于網(wǎng)隔和全隔處理。而魔芋根系和土壤細(xì)菌群落的Simpson 指數(shù)在不同分隔處理之間無(wú)顯著差異。

表2 不同分隔處理下魔芋根系和根際土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity indices of bacterial communities in A.konjac roots and rhizosphere soils under different separation treatments

2.1.2 β 多樣性指數(shù) 為明確各處理在細(xì)菌群落物種組成上的差異性，采用PCoA 比較不同分隔處理魔芋根系和根際土壤細(xì)菌群落的β多樣性差異。結(jié)果表明（圖2），主成分PCo1 和PCo2 分別解釋了41.2%和8.2%的群落結(jié)構(gòu)差異，兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)49.4%。無(wú)隔和網(wǎng)隔2種土壤樣品間的細(xì)菌群落存在重合，說(shuō)明2種土壤樣品中的細(xì)菌物種組成差異較??；結(jié)合Adonis分析表明，無(wú)隔、網(wǎng)隔和全隔魔芋根際土壤樣品中細(xì)菌群落的β 多樣性差異顯著（P=0.006，R2=0.313），3 個(gè)處理的魔芋根系細(xì)菌群落β 多樣性差異亦顯著（P=0.005，R2=0.393）。

圖2 基于Bray-Curtis距離的魔芋根系和根際土壤細(xì)菌群落β多樣性主坐標(biāo)分析（PCoA）Fig.2 Principal coordinates analysis （PCoA） of bacterial community beta diversity in roots and rhizosphere soils of A.konjac based on Bray-Curtis similarities

2.2 魔芋根系和根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

18 個(gè)樣本按最小樣本序列數(shù)抽平1 次，每個(gè)樣本得到34 675 條有效序列。ASV 稀疏曲線均趨于平緩（圖3-A），表明本研究中測(cè)序深度已基本覆蓋了樣品中所有物種，序列信息可以充分反映細(xì)菌群落的真實(shí)信息。不同處理魔芋根際細(xì)菌群落測(cè)序結(jié)果表明，無(wú)隔處理魔芋根系和根際土壤細(xì)菌的ASV 總數(shù)最大，分別為4 649 和7 346 個(gè)；全隔處理最少，分別為3 296 和6 713個(gè)（圖3-B）。

圖3 不同分隔處理下魔芋根系和根際土壤細(xì)菌群落稀疏曲線（A）和韋恩圖（B）Fig.3 Rarefaction curve （A） and Venn diagram （B） of bacterial communities in roots and rhizosphere soils of A.konjac under different separation treatments

2.2.1 門水平 由圖4-A可知，不同分隔處理細(xì)菌門水平的群落結(jié)構(gòu)組成相似，但細(xì)菌門相對(duì)豐度存在差異。6 個(gè)樣品中，相對(duì)豐度≥1.0%的已知優(yōu)勢(shì)細(xì)菌包括9 門，而相對(duì)豐度＜1.0% 的其他細(xì)菌門占比在0.67%～2.98%之間。

圖4 不同分隔處理下魔芋根系和根際土壤細(xì)菌門水平（A）和屬水平（B）的群落組成Fig.4 Bacterial community composition in roots and rhizosphere soils of A.konjac at the phylum （A） and genus （B） levels under different separation treatments

在魔芋根系中，放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）在全隔、網(wǎng)隔、無(wú)隔處理中所占比例均表現(xiàn)為依次降低的趨勢(shì)，分別為11.46%、10.32%、10.05%和21.79%、17.03%、16.14%；而綠彎菌門（Chloroflexi）和厚壁菌門（Firmicutes）在全隔、網(wǎng)隔和無(wú)隔處理中所占比例依次增加，分別為1.79%、2.21%、4.56%和0.36%、0.37%、1.07%。

在魔芋根際土壤中，變形菌門（Proteobacteria）和藍(lán)藻門（Cyanobacteria）在全隔、網(wǎng)隔、無(wú)隔處理中所占比例均依次降低，分別為35.40%、31.16%、30.35%和0.25%、0.09%、0.06%；厚壁菌門（Firmicutes）也表現(xiàn)出相同趨勢(shì)，在3 個(gè)處理中所占比例依次減少，分別為4.01%、3.93%和3.75%。

2.2.2 屬水平 不同分隔處理細(xì)菌屬水平群落組成見(jiàn)圖4-B。在相對(duì)豐度≥1.0%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中，相較于全隔處理，網(wǎng)隔和無(wú)隔條件下魔芋根系中細(xì)菌屬相對(duì)豐度均上升的有鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）、溶桿菌屬（Lysobacter）和Chryseolinea屬；根際土壤中細(xì)菌屬相對(duì)豐度均上升的有原小單孢菌屬（Promicromonospora）、戴沃斯菌屬（Devosia）、極地所菌屬（Pricia）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）、Galbibacter屬、申氏桿菌屬（Shinella）和溶桿菌屬（Lysobacter）。此外，藤黃單胞菌屬（Luteimonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）、溶桿菌屬（Lysobacter）和Chryseolinea屬相對(duì)豐度在無(wú)隔處理魔芋根系和根際土壤中最高，而獨(dú)島菌屬（Dokdonella）、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）和類土地桿菌屬（Parapedobacter）相對(duì)豐度在全隔處理魔芋根系和根際土壤中最高。

2.3 細(xì)菌屬組成與土壤因子的關(guān)系

為了分析不同分隔處理下魔芋根系和根際土壤細(xì)菌群落屬組成產(chǎn)生差異的關(guān)鍵土壤因子，對(duì)細(xì)菌群落屬組成與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行RDA 分析。結(jié)果顯示（圖5），RDA1 和RDA2 累計(jì)解釋魔芋根際細(xì)菌群落99.05%的變異量，其中AN 對(duì)魔芋根際細(xì)菌群落影響顯著（P＜0.05），解釋其群落結(jié)構(gòu)變異的67.43%。其他土壤因子對(duì)其無(wú)顯著影響。從圖5 也可看出，原小單孢菌屬（Promicromonospora）和Galbibacter屬相對(duì)豐度均與TN、TK、AN 和TOC 含量呈正相關(guān)；溶桿菌屬（Lysobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、根瘤菌屬（Rhizobium）和極地所菌屬（Pricia）相對(duì)豐度與TP、AK、AP 和TOC 含量呈正相關(guān)，極地所菌屬（Pricia）、藤黃單胞菌屬（Luteimonas）、Chryseolinea屬、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）和類土地桿菌屬（Parapedobacter）相對(duì)豐度與土壤pH值呈正相關(guān)；噬氫菌屬（Hydrogenophaga）和類土地桿菌屬（Parapedobacter）相對(duì)豐度與除pH 值之外的其他土壤理化性質(zhì)指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。其他如戴沃斯菌屬（Devosia）、申氏桿菌屬（Shinella）和獨(dú)島菌屬（Dokdonella）細(xì)菌相對(duì)豐度也與土壤理化性質(zhì)指標(biāo)表現(xiàn)出一定的相關(guān)關(guān)系。

圖5 魔芋根系和根際土壤細(xì)菌群落屬組成與土壤因子的冗余分析（RDA）Fig.5 Redundancy analysis （RDA） of bacterial community composition at the genus level in roots and rhizosphere soils of A.konjac in relation to soil factors

2.4 魔芋根際土壤氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因的表達(dá)豐度

通過(guò)qRT-PCR 對(duì)固氮微生物中編碼氮循環(huán)關(guān)鍵酶的7 個(gè)基因（nifH、AOAamoA、AOBamoA、narG、nirK、nirS和nosZ）豐度進(jìn)行絕對(duì)定量分析。結(jié)果顯示（圖6），網(wǎng)隔和無(wú)隔處理的nifH基因拷貝數(shù)分別較全隔處理顯著增加82.36%和19.73%（圖6-A）。反硝化微生物nosZ和nirS基因拷貝數(shù)變幅分別為8.52×107～12.16×107和2.39×107～3.62×107copies·g-1，均呈現(xiàn)出無(wú)隔＞網(wǎng)隔＞全隔的變化趨勢(shì)，且全隔和網(wǎng)隔處理間無(wú)顯著差異，但無(wú)隔處理的nosZ和nirS基因拷貝數(shù)分別較全隔處理顯著增加42.79%和51.54%（圖6-B 和6-C）。反硝化微生物nirK基因拷貝數(shù)變幅為9.21×108～13.96×108copies·g-1，呈現(xiàn)出全隔＞無(wú)隔＞網(wǎng)隔的變化趨勢(shì)，但全隔和無(wú)隔處理間無(wú)顯著差異（圖6-D）；narG基因拷貝數(shù)在全隔、網(wǎng)隔和無(wú)隔處理間無(wú)顯著差異（圖6-E）。在全隔處理中，硝化微生物AOBamoA基因拷貝數(shù)分別較網(wǎng)隔和無(wú)隔處理顯著增加59.16%和56.41%（圖6-F）； AOAamoA基因拷貝數(shù)呈現(xiàn)出無(wú)隔＞全隔＞網(wǎng)隔的變化趨勢(shì)（圖6-G）。

圖6 不同分隔處理下魔芋根際土壤中氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因qRT-PCR絕對(duì)定量分析Fig.6 Absolute quantification of nitrogen cycling-related key functional genes in rhizosphere soils of A.konjac under different separation treatments by qRT-PCR

2.5 魔芋軟腐病發(fā)病情況

魔芋播種50 d 時(shí)，魔芋‖刺槐無(wú)隔和網(wǎng)隔處理?xiàng)l件下，魔芋未發(fā)病，而全隔魔芋已開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀。魔芋播種75 和200 d 時(shí)，全隔魔芋軟腐病病情指數(shù)分別是網(wǎng)隔處理的2.4 和2.0 倍，而無(wú)隔魔芋仍未發(fā)?。ū?）。上述結(jié)果說(shuō)明根系互作和物質(zhì)傳遞在刺槐‖魔芋間作系統(tǒng)中發(fā)揮著推遲和控制發(fā)病程度的作用。

表3 不同分隔處理下魔芋軟腐病發(fā)病情況及防治效果Table 3 The disease index and control efficiency of A.konjac soft rot under different separation treatments

2.6 根際細(xì)菌群落與魔芋軟腐病的相關(guān)性

以圖4-B 中13 個(gè)相對(duì)豐度≥1%的優(yōu)勢(shì)屬為例，通過(guò)相關(guān)性圖可視化展示樣本中魔芋根際細(xì)菌多樣性、屬豐度以及氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因拷貝數(shù)與軟腐病發(fā)病程度之間的關(guān)系。由圖7 可知，播種50 d 的魔芋軟腐病病情指數(shù)與溶桿菌屬（Lysobacter）細(xì)菌相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與AOBamoA基因拷貝數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.000 1）。播種75 和200 d 的魔芋軟腐病病情指數(shù)與溶桿菌屬（Lysobacter）和鏈霉菌屬（Streptomyces）相對(duì)豐度以及nirS基因和nosZ基因拷貝數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，但與AOBamoA基因拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。與不同調(diào)查時(shí)間段魔芋軟腐病病情指數(shù)和其他因子的相關(guān)性趨勢(shì)相比，防治效果與其他因子的相關(guān)性均表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。

圖7 細(xì)菌群落多樣性、屬豐度及氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因拷貝數(shù)與魔芋軟腐病發(fā)生的Pearson相關(guān)性分析Fig.7 Pearson correlation analysis between bacterial community diversity，genus abundance，copy numbers of nitrogen cyclingrelated functional genes，and the development of A.konjac soft rot

3 討論

3.1 不同根系分隔方式對(duì)魔芋根際細(xì)菌多樣性和群落組成的影響

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)分析與刺槐不同根系分隔方式下的魔芋根際細(xì)菌多樣性。結(jié)果表明，與刺槐間作增加了魔芋根際細(xì)菌種類并豐富了其群落多樣性。一方面，與全隔相比，無(wú)隔處理改變作物覆被，使根系分布更為復(fù)雜，導(dǎo)致根際細(xì)菌與作物根系分泌物互作更頻繁［11-12］，從而改變了根際細(xì)菌代謝活性，促使間作魔芋根際細(xì)菌群落多樣性與單作產(chǎn)生差異。另一方面，豆科刺槐的固氮體系可以增加土壤氮素含量［28］，這也可能是影響魔芋根際細(xì)菌群落多樣性的原因。

在屬水平上，戴沃斯菌屬、極地所菌屬、藤黃單胞菌屬、鏈霉菌屬、溶桿菌屬5 類菌屬豐度值較大，在不同分隔處理樣品中的相對(duì)豐度≥1.0%；但未分類菌屬相對(duì)豐度最高，達(dá)68.25%～77.38%（圖4-B），說(shuō)明各樣品中仍存在大量未知細(xì)菌有待進(jìn)一步鑒定并探索其功能。無(wú)隔處理下魔芋根系和根際土壤鏈霉菌屬分布比例高于全隔處理。前人研究表明，有些鏈霉菌通過(guò)產(chǎn)生抗生素和水解酶類物質(zhì)抑制魔芋土傳病原菌的生長(zhǎng)［29］。根瘤菌可在非豆科植物中以內(nèi)生菌形式普遍存在［30］，其中健康魔芋根表土壤和根內(nèi)存在的放射型根瘤菌（Rhizobiumradiobacter）具有促生增產(chǎn)和抗魔芋軟腐病能力［31］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，與刺槐間作的魔芋根系和根際土壤中根瘤菌為較具優(yōu)勢(shì)的一類種群，相對(duì)豐度分別達(dá)2.94%和1.68%；溶桿菌屬細(xì)菌在與刺槐間作的魔芋根際大量存在。研究表明，溶桿菌屬細(xì)菌對(duì)多種植物病原真菌、卵菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及線蟲(chóng)均有顯著的拮抗作用，是具有重要生防前景的一類細(xì)菌［32-33］。例如，溶桿菌屬生防菌06-4 能在魔芋根際生態(tài)位點(diǎn)穩(wěn)定定殖，對(duì)魔芋軟腐病控制效果達(dá)58.92%［34］。Chryseolinea屬在與刺槐間作的魔芋根際也占有一定比例。有研究表明，Chryseolinea屬細(xì)菌在土壤氮循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［35-36］。上述菌屬細(xì)菌豐度的增加可能有利于間作魔芋植株的生長(zhǎng)并增強(qiáng)其抗病能力。

3.2 不同根系分隔方式對(duì)魔芋根際土壤氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因豐度的影響

本研究利用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)了7 個(gè)關(guān)鍵氮循環(huán)功能基因，以研究間作對(duì)參與反硝化、硝化和固氮作用微生物的影響。nifH是生物固氮的關(guān)鍵基因，主要編碼調(diào)控固氮酶鐵蛋白的合成；氨氧化古菌（ammoniaoxidizing archaea，AOA）的amoA基因編碼調(diào)控氨單加氧酶，參與調(diào)控硝化過(guò)程；nirS和nosZ是調(diào)控反硝化過(guò)程的關(guān)鍵基因。以上調(diào)控氮循環(huán)固氮過(guò)程（nifH）、硝化過(guò)程（AOAamoA）及反硝化過(guò)程（nirS和nosZ）的關(guān)鍵基因在無(wú)隔處理中的拷貝數(shù)顯著高于全隔單作（圖6），說(shuō)明間作刺槐改變了魔芋根際微生物群落結(jié)構(gòu)，尤其改變了氮循環(huán)相關(guān)微生物基因拷貝數(shù)，從而促進(jìn)整個(gè)氮循環(huán)過(guò)程。與前人研究結(jié)果類似，如楊亞?wèn)|等［37］研究表明，大豆‖燕麥和綠豆‖燕麥間作顯著提高了燕麥土壤固氮微生物nifH基因拷貝數(shù)，改變了固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)類群的相對(duì)豐度。

3.3 間作刺槐的魔芋根際細(xì)菌與軟腐病發(fā)生的關(guān)系

國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為，土傳病害的發(fā)生與土壤微生物多樣性相關(guān)［11-13，38］。一方面，土傳病害的發(fā)生會(huì)降低土壤微生物多樣性［29］，例如患有軟腐病的魔芋根系和根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變且多樣性指數(shù)較健康土壤明顯降低［39］。另一方面，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化也影響土傳病害的發(fā)生，例如微生物多樣性高的辣椒根際土壤枯萎病病原菌數(shù)量少且難以大量繁殖［40］。已有研究表明，魔芋軟腐病的發(fā)生及程度是病原菌與根際微生物互作的結(jié)果［41-43］。根際微生物在防控土傳病害和促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面具有重要作用［44］。本研究中，網(wǎng)隔和無(wú)隔處理下魔芋軟腐病發(fā)病率較全隔明顯降低，可能與溶桿菌屬、鏈霉菌屬、固氮和反硝化微生物比例增加有關(guān)，這些細(xì)菌種類增強(qiáng)了植株抵抗病原菌的能力，從而降低了魔芋軟腐病的發(fā)病率。

4 結(jié)論

隨著刺槐與魔芋種間根系互作強(qiáng)度的增強(qiáng)，即種間根系從完全隔離（單作）到不完全隔離（半互作）再到開(kāi)放無(wú)隔（互作）變化，魔芋根系和根際土壤細(xì)菌物種豐富度和α 多樣性指數(shù)依次增加。同時(shí)，間作改變了根際細(xì)菌和氮循環(huán)相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)，增加了一些有益細(xì)菌豐度，提高了植株對(duì)軟腐病菌的抵抗能力，從而降低了魔芋軟腐病的發(fā)病率。