徐曉惠，閆海琳，徐子萱，周姝含＊＊，呂文亮＊＊

（1.桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院 桐鄉(xiāng) 314500；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院 武漢 430061）

胃癌可分為兩種亞型，較多見的是由萎縮性胃炎和腸上皮化生演變而來即遵循Correa發(fā)展模式的腸型胃癌。幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是我國胃癌的最主要原因，存在Hp 感染的萎縮性胃炎（Chronic atrophic gastritis，CAG）患者是腸型胃癌的高危人群，Hp 陽性的輕/中度萎縮和重度萎縮患者比Hp陰性患者的胃癌發(fā)病率高6.4 倍和11.8 倍[1]。由于炎癥可控，而癌癥難控，對包括CAG 在內(nèi)的Hp相關(guān)性胃癌前病變的早期管理成了胃癌防控的著力點，對Hp相關(guān)性CAG的“炎癌轉(zhuǎn)化”機制研究顯得尤為重要。

目前，Hp 相關(guān)性CAG 的“炎癌轉(zhuǎn)化”機制的相關(guān)研究中，在哺乳動物體內(nèi)刺猬蛋白-細胞表面受體Ptch-G 蛋白偶聯(lián)受體樣蛋白Smo-膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白Gli（Hh-Ptch-Smo-Gli）構(gòu)成的信號通路（Hedgehog信號通路）異?；罨徽J(rèn)為與CAG 的“炎癌轉(zhuǎn)化”有關(guān)[2]。膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1（Gli1）在核內(nèi)促發(fā)Shh下游靶基因和自身Gli基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)DNA 的異常復(fù)制而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[3]，在包括胃癌在內(nèi)的多種癌癥中，均出現(xiàn)Hh-Ptch-Smo-Gli 通路的過度激活[4]。

此外，炎癥因子的釋放與“炎癌轉(zhuǎn)化”密切相關(guān)，NADPH 氧化酶（NOX）作用是在免疫防御中產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），抑制病原體入侵[5]，腫瘤細胞發(fā)育過程中會產(chǎn)生過量的ROS[6]，促進腫瘤新生血管的生成，誘發(fā)或啟動包括炎癥和腫瘤在內(nèi)的多種疾病[7-9]。NF-κB 信號通路與機體炎癥因子的釋放，腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移等多個過程密切相關(guān)[10]。轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子1（Signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）被認(rèn)為是一個抑癌因子，可促腫瘤細胞凋亡[11]，并可調(diào)控NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子的表達[12]，且NF-κB 和STAT1 信號通路的激活受ROS信號調(diào)控[13]。NF-κB/STAT1信號通路在萎縮性胃炎“炎癌轉(zhuǎn)化”過程中可能發(fā)揮著不可忽視的作用。

從中醫(yī)辨證的角度而言，Hp被認(rèn)為是一種濕熱性質(zhì)的病邪，Hp 感染與脾胃濕熱證關(guān)系最密切，因為飲食失節(jié)等使脾胃受損，濕熱內(nèi)生，更利于Hp 的定植，感染人體后造成黏膜損傷又會進一步加重“濕熱證”，課題組前期進行了慢性胃炎的病機轉(zhuǎn)化規(guī)律研究，發(fā)現(xiàn)脾胃濕熱-胃絡(luò)瘀血的病機轉(zhuǎn)化位于慢性萎縮性胃炎腺體萎縮-腸化生的關(guān)鍵節(jié)點。濕熱不去而釀毒損絡(luò)成瘀，胃黏膜病變漸生，瘀血與濕熱蘊結(jié)，久化瘀毒，瘀血證的出現(xiàn)常被認(rèn)為是黏膜惡變的重要標(biāo)志。

因此，本研究著眼于Hp 相關(guān)性CAG 和非Hp 感染的CAG 患者，運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測其胃黏膜中Hh-Ptch-Smo-Gli信號通路與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶/核因子κB/轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子1（NOX/NF-κB/STAT1）通路的關(guān)鍵因子，從濕熱致瘀角度探究Hp感染后CAG“炎癌轉(zhuǎn)化”的作用機制。

1 研究對象與方法

1.1 患者來源及分組

患者來源于2021 年8 月-2021 年12 月湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖北省中醫(yī)院脾胃病科CAG 患者，分為CAG 伴Hp 感染組（HP+CAG 組，n=21）與CAG 不伴Hp感染組（HP-CAG組，n=22）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參考《慢性萎縮性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見（2017 年）》[14]、《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》[15]、《成人幽門螺桿菌引起的胃炎中西醫(yī)協(xié)作診療專家共識（2020，北京）》[16]，根據(jù)臨床癥狀、胃鏡、病理活檢、尿素呼氣試驗、快速尿素酶試驗或Hp 培養(yǎng)等結(jié)果診斷。

1.3 倫理委員會批準(zhǔn)

本研究經(jīng)湖北省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（HBZY2021-C15-01）。參與者均詳細了解此項研究內(nèi)容及相關(guān)權(quán)利后簽署知情同意書。

1.4 胃黏膜樣本采集

胃鏡下使用一次性活檢鉗取約1 mm×1 mm×1 mm的距幽門2-3 cm 胃竇臨近胃小彎一側(cè)的黏膜組織3 塊，其中2 塊分別放入無菌的凍存管內(nèi)，迅速投入液氮中凍存，后存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫? 塊使用4%多聚甲醛以固定組織，常溫保存，后以石蠟包埋、切片備用。

1.5 RT-qPCR引物序列

具體引物序列見表1。GAPDH 表達做內(nèi)部參照，使用PCR 儀分析cDNA，并繪制溶解曲線，以QPCR 算法（相對定量，2-ΔΔCt法）進行數(shù)據(jù)分析。QPCR 算法公式：

表1 引物序列表

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分比表示，計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間的差異比較，若方差齊，采用T檢驗（Student'st-test）；若方差不齊，采用Wilcox 秩和檢驗（Wilcoxon rank-sum test），多組間均數(shù)行單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 研究對象分組情況基本資料

Hp+CAG 與Hp-CAG 組患者性別比例與年齡無統(tǒng)學(xué)差異（P>0.05），具體可見表2。

表2 研究對象分組情況基本資料（±s）

表2 研究對象分組情況基本資料（±s）

組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）性別男（n）11（52.4%）10（45.5%）女（n）10（47.6%）12（54.5%）年齡（歲）54.33±6.79 51.89±7.24

2.2 兩組患者胃黏膜病理表現(xiàn)

胃鏡下觀察兩組患者胃黏膜紅白相間、以白為主，粘膜變薄或粗糙不平，其中可見血管紋理，或伴有點、片狀紅斑或散在出血點，部分患者可見黏膜水腫。

蘇木精-伊紅（HE）染色后，在鏡下觀察各組患者黏膜組織病理情況，結(jié)果顯示：Hp+CAG組患者胃黏膜出現(xiàn)上皮細胞部分脫落，腺體數(shù)量減少，排列紊亂，可見明顯腸上皮化生及炎癥細胞浸潤；Hp-CAG 組患者胃黏膜腺體數(shù)量減少，排列紊亂，局部可見腸上皮化生，炎癥細胞浸潤程度較Hp+CAG組輕（見圖1）。

圖1 各組患者胃黏膜組織HE染色（×200）

圖2 兩組蛋白相對表達量

參照慢性胃炎新悉尼系統(tǒng)對胃黏膜炎癥程度和活動度進行分級（見表3，表4），統(tǒng)計兩組患者胃黏膜出現(xiàn)不同程度和活動度炎癥的例數(shù)并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明，Hp+CAG 組患者胃黏膜均出現(xiàn)不同程度的炎癥，且出現(xiàn)重度炎癥的比例明顯高于Hp-CAG組（P<0.05）；輕度或無炎癥患者的比例低于Hp-CAG組（P<0.05）；兩組患者中胃黏膜出現(xiàn)中度炎癥的比例相當(dāng)，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Hp+CAG 組患者胃黏膜出現(xiàn)重度和中度炎癥活動度的比例明顯高于Hp-CAG 組（P<0.05）；而出現(xiàn)輕度或無炎癥活動度的比例明顯低于Hp-CAG組（P<0.05）。

表3 兩組患者胃黏膜炎癥程度分級

2.3 RT-qPCR檢測結(jié)果

經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，兩組患者胃黏膜Gli1 mRNA、Gli2 mRNA、Gli3 mRNA 水平有顯著差異（P<0.01）（見表5）。兩組患者胃黏膜Shh mRNA、Smo mRNA、Ptch mRNA差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（見表6）。兩組患者胃黏膜NOX1 mRNA、NOX2 mRNA、NOX4 mRNA 與NFκB mRNA差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（見表7）。

表5 兩組患者胃組織Gli1、Gli2、Gli3 mRNA檢測結(jié)果（±s）

表5 兩組患者胃組織Gli1、Gli2、Gli3 mRNA檢測結(jié)果（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

Gli3 1.056±0.050 0.438±0.008**組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）Gli1 1.046±0.040 2.700±0.017**Gli2 0.985±0.048 0.463±0.011**

表6 兩組胃組織Shh、Smo、Ptch mRNA檢測結(jié)果（±s）

表6 兩組胃組織Shh、Smo、Ptch mRNA檢測結(jié)果（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

Ptch 1.052±0.045 2.719±0.026**組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）Shh 1.089±0.077 2.863±0.025**Smo 1.050±0.043 2.717±0.023**

表7 兩組胃組織NOX1、NOX2、NOX4、NF-κB mRNA檢測結(jié)果（±s）

表7 兩組胃組織NOX1、NOX2、NOX4、NF-κB mRNA檢測結(jié)果（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）NOX1 NOX2 NOX4 1.068±0.059 NF-κB 0.981±0.047 0.987±0.045 1.060±0.052 0.502±0.007**0.504±0.007**0.458±0.006**0.452±0.006**

2.4 Western blot檢測結(jié)果

兩組患者胃黏膜NOX1/GAPDH、NOX2/GAPDH、NOX4/GAPDH 相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（見表8）。兩組患者胃黏膜p-P65/GAPDH 相對表達量、STAT1/GAPDH 相對表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；兩組P65/GAPDH 相對表達量的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（見表9）。

表8 兩組NOX1/GAPDH、NOX2/GAPDH、NOX4/GAPDH相對表達量（±s）

表8 兩組NOX1/GAPDH、NOX2/GAPDH、NOX4/GAPDH相對表達量（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

NOX4/GAPDH 0.800±0.054 0.474±0.094**組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）NOX1/GAPDH 0.757±0.139 0.393±0.114**NOX2/GAPDH 0.561±0.073 0.231±0.029**

表9 兩組STAT1/GAPDH、P65/GAPDH、p-P65/GAPDH相對表達量（±s）

表9 兩組STAT1/GAPDH、P65/GAPDH、p-P65/GAPDH相對表達量（±s）

注：與Hp+CAG組比較，**P<0.01。

p-P65/GAPDH 0.599±0.163 0.265±0.149**組別Hp+CAG組（n=21）Hp-CAG組（n=22）STAT1/GAPDH 0.134±0.091 0.466±0.115**P65/GAPDH 0.851±0.055 0.780±0.078

3 討論與結(jié)論

本次研究重點觀察了幽門螺旋桿菌感染對慢性萎縮性胃炎患者胃黏膜炎癥程度的影響，顯而易見，Hp 感染明顯加重了CAG 患者胃黏膜炎癥程度，與此同時，Hp 感染后NOX/NF-κB 信號通路的異常激活及Hh-Ptch-Smo-Gli 信號通路的抑制，使“炎癌轉(zhuǎn)化”風(fēng)險增加。

Hp+CAG組患者胃黏膜出現(xiàn)中度及重度炎癥的比例明顯高于Hp-CAG 組，提示Hp 感染明顯加重了CAG 患者胃黏膜炎癥程度。有報道稱輕度、中度及重度胃黏膜炎癥患者的Hp 感染率逐漸升高[17]。Correa's Cascade 相關(guān)胃黏膜病變（包括萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生和胃癌）中Hp 感染率均高于非萎縮性胃炎組（P<0.01），且胃黏膜病變程度隨著Hp感染程度分級的增加而增加[18]，說明胃黏膜病變程度與Hp感染程度有關(guān)。

Hp通過釋放尿素酶來中和胃內(nèi)的酸性環(huán)境，在胃中長期存活[19]，同時利用鞭毛和趨化受體在胃黏膜上皮細胞定植，導(dǎo)致炎癥和中性粒細胞浸潤[20-21]。此外，Hp憑借其毒力因子細胞毒素相關(guān)蛋白A（CagA）、空泡毒素A（VacA）等，干擾宿主細胞內(nèi)信號通路，導(dǎo)致胃黏膜長期慢性炎癥，參與CAG 發(fā)生發(fā)展，驅(qū)動“炎癌轉(zhuǎn)化”[22-23]。例如，CagA 在感染的細胞中激活NF-κB 依賴的炎癥信號傳導(dǎo)，促進白細胞介素-8（IL-8）的產(chǎn)生[24-25]，導(dǎo)致中性粒細胞和巨噬細胞的招募，聚集的中性粒細胞、單核巨噬細胞會產(chǎn)生大量的NOX2，繼而生成過量的ROS[26]。由于Hp 菌體內(nèi)含有各種超氧化物還原酶，具有較強的抗氧化能力，更關(guān)鍵的是，Hp會破壞NOX 的靶向性[27]，使超氧陰離子釋放到細胞外環(huán)境中，而不會在Hp 吞噬體內(nèi)積累，所以Hp 感染導(dǎo)致的NOX2 異?；罨?，只會加速胃黏膜的氧化損傷而不影響Hp 的繼續(xù)定植。故宿主對其的氧化殺傷往往失敗，結(jié)果Hp 感染持續(xù)存在，而ROS 生成和釋放持續(xù)增多，導(dǎo)致胃黏膜上皮細胞持續(xù)損傷[28]。

NOX 的過度激活是導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平升高的重要機制，其中NOX2 在人胃黏膜的表達與胃黏膜的炎癥程度和萎縮損傷程度呈正相關(guān)[29]。有研究發(fā)現(xiàn)NOX4 通過產(chǎn)生ROS 和激活Gli1信號在胃癌細胞生長和凋亡中起重要作用[12]。NOX1、NOX2 與NOX4 也被認(rèn)為參與了血管生成的各個階段，在癌癥誘導(dǎo)的血管形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13]。NF-κB是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要因子，p65蛋白是NF-κB中的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為廣泛參與了細胞生長、分化、炎癥、免疫應(yīng)答等多方面的表達調(diào)控，其過度表達與多種慢性炎癥性疾病及腫瘤發(fā)病密切相關(guān)，磷酸化的p65蛋白（p-P65）是p65 蛋白的活化形式。有報道稱Hp 感染后NF-κB 呈激活狀態(tài)，且萎縮性胃炎患者胃黏膜萎縮病變程度與Hp 感染和p-P65 的表達呈正相關(guān)[30]，隨著胃黏膜病變程度的加重，胃黏膜中p-P65 表達及Hp 陽性率均增高[31]?；罨疦F-κB 的因素有很多，包含病原體、ROS等，其中NOX是一個關(guān)鍵的酶系統(tǒng)，NOX2等過表達會產(chǎn)生過量的ROS 激活NF-κB 信號通路，同時促進STAT 磷酸化。STAT1 已被證明通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和促進腫瘤免疫監(jiān)測來發(fā)揮抗腫瘤作用，是腫瘤血管發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移的負(fù)調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是潛在的腫瘤抑制因子，現(xiàn)多認(rèn)為其可促進腫瘤細胞凋亡，抑制胃癌細胞增殖及侵襲、遷移能力[32-33]，有研究顯示Hp 感染后明顯抑制STAT1 核易位[34]；且胃癌患者血清STAT1 表達水平顯著低于慢性胃炎組和健康對照組[35]。

如今人們居住條件和生活水平大大提高，過食肥甘厚味，腦力勞動偏多，脾氣不健，加之作息不規(guī)律，濕熱內(nèi)蘊常見。作為慢性萎縮性胃炎的重要致病因素，Hp 也被認(rèn)為是一種濕熱性質(zhì)的伏邪，正氣不甚虛時，其隱匿于胃部伏而不發(fā)，長期感染造成胃黏膜的持續(xù)炎癥，加重黏膜病理改變[36]。

濕邪日久傷陽，熱邪日久耗陰，濕熱膠結(jié)難化，纏綿體內(nèi)導(dǎo)致陰陽俱損，中氣更虛，氣血不榮則黏膜萎縮、納運失司，濕熱不去而釀毒損絡(luò)成瘀，胃黏膜病變漸生，瘀血與濕濁、濕熱蘊結(jié)，久化瘀毒，裹挾留滯[37]，瘀血證的出現(xiàn)常被認(rèn)為是黏膜惡變的重要標(biāo)志。

Hp+CAG 組患者胃黏膜NOX1 mRNA、NOX2 mRNA、NOX4 mRNA、NF-κB mRNA 與p-P65 水平顯著增高，STAT1 表達水平降低。說明Hp 感染后NOX/NF-κB 信號通路異常激活，促進組織損傷與促炎因子的釋放，使萎縮性胃炎患者胃黏膜炎癥程度和活動度增加，而STAT1 水平顯著降低，“炎癌轉(zhuǎn)化”風(fēng)險增加。此外，Hp 感染使CAG 患者胃黏膜Gli1 mRNA、Shh mRNA、Smo mRNA、Ptch mRNA 水平顯著降低，同時Gli2 mRNA 與Gli3 mRNA水平顯著增高，說明Hp感染后CAG 患者胃黏膜Hh-Ptch-Smo-Gli 信號通路可能受抑制。有研究表明Hp 感染后可能通過下調(diào)胃黏膜Shh 蛋白的表達導(dǎo)致胃黏膜萎縮及腸上皮化生（IM）[38]。Shh在CAG 腸化生組織中表達率低于在非萎縮性胃炎胃組織中的表達率[39-40]，也提示Shh分泌不足與胃黏膜腸上皮化生有關(guān)。

在CAG“炎癌轉(zhuǎn)化”過程中，不可忽視的環(huán)節(jié)是源自骨髓的間充質(zhì)干細胞（MSCs）被招募到組織損傷部位。Donnelly 等[41]發(fā)現(xiàn)MSCs 在Hp 感染的小鼠胃發(fā)育不良腺體中增殖，出現(xiàn)腸化生和異型增生。當(dāng)募集的MSCs 重新填充胃上皮時，炎癥細胞因子持續(xù)存在而缺乏足夠的Shh，導(dǎo)致胃上皮異常再生，出現(xiàn)異型增生和癌癥[42]。Hp感染誘導(dǎo)的慢性炎癥環(huán)境與Shh分泌不足或傳導(dǎo)抑制是在CAG 發(fā)生發(fā)展過程中的兩個關(guān)鍵因素。胃黏膜存在長期慢性炎癥的情況下，Shh 信號通路的失調(diào)會進一步導(dǎo)致胃上皮分化異常和胃癌。不少研究證實，益氣活血法可激活hedgehog 信號通路，對萎縮性胃炎癌前病變大鼠胃黏膜病變起到改善作用[43-44]。

總結(jié)而言，存在Hp 感染的萎縮性胃炎患者胃黏膜病變機率高，可能與胃黏膜長期炎癥，以及Hp 感染下調(diào)Shh、Gli1、Smo mRNA 表達水平，上調(diào)Gli3 表達水平，抑制Hh-Ptch-Smo-Gli 信號通路，同時使NOX/NF-κB/STAT1信號通路異?；罨嘘P(guān)。