焦穎，張彥，楊黎燕，劉樂樂，郭文皓

西安醫(yī)學(xué)院（西安 710021）

肉豆蔻和花椒均為“藥食同源”品種且性溫。肉豆蔻能逐氣行滯、開胃消食，對胃腸功能不佳、食欲不振、脾胃虛弱等癥狀有一定的改善作用[1]?；ń穭t具有溫中降逆的作用，能夠改善胃腸不適、腹脹腹痛等不良癥狀，同時(shí)也具有一定的殺菌消炎作用[2-3]。這兩種揮發(fā)油成分豐富且藥理活性廣泛，肉豆蔻具有抗菌、抗氧化、抑制炎癥功效，可有效地預(yù)防皮膚感染、保護(hù)皮膚，促進(jìn)傷口愈合[4]?；ń穭t具有較好的麻醉和消炎作用，可減輕透皮吸收時(shí)的不適感和透皮過程中的炎癥反應(yīng)[5]。

苦參堿是濕疹膏、苦參洗劑等外用制劑中苦參的主要成分，但其堿性較大，親脂性和透皮吸收作用較差，通常會加入促滲劑使藥物透皮吸收率增加[6]。植物揮發(fā)油成分復(fù)雜，具有多種生物活性成分，有分子量小、脂溶性強(qiáng)、易透過體內(nèi)生物膜和生物利用度高等特點(diǎn)，通常被作為促滲劑加入外用化妝品及外用藥中改善活性成分的透皮吸收效果[7]。但單一植物的活性成分有限，很難達(dá)到理想效果，復(fù)配能實(shí)現(xiàn)功能上的協(xié)同、互補(bǔ)[8]，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域。

此試驗(yàn)將肉豆蔻和花椒揮發(fā)油進(jìn)行復(fù)配，采用Franz擴(kuò)散池法，以大鼠腹部皮膚為模擬皮膚，進(jìn)行體外透皮試驗(yàn)，探究其透皮促滲的效果，有望為肉豆蔻和花椒復(fù)配揮發(fā)油在透皮促滲作用提供理論依據(jù)和試驗(yàn)依據(jù)，擴(kuò)大其在食品香料、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料

肉豆蔻（廣東）；花椒（陜西太白縣綠潤生態(tài)農(nóng)產(chǎn)品有限公司）。

1.2 試劑

純化水（四川卓越水處理設(shè)備有限公司）；苦參堿（≥98%，批號HR21415S1，寶雞辰光生物科技有限公司）；卡波姆940（99%，廣州市歐研化妝品有限公司）；氮酮[含量≥97%，國藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司]；0.9%生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）；乙腈（色譜純≥99.9%）、無水乙醇（色譜純≥99.7%）、正己烷（色譜純≥99.5%）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸（含量≥85%，茂名市雄大化工有限公司廣州分公司）；異丙醇（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醛（分析純，西安富力化學(xué)廠）。

1.3 主要儀器與設(shè)備

RYJ-6B型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；安捷倫1220LC型高效液相色譜儀（AgiLent TechnoLoies System G42868）；JA2003型分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；揮發(fā)油提取器、EP管等。

1.4 動物

SD大鼠，體重200 g，動物證號：SCXK（川）2022-030（成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司），SPF級西安醫(yī)學(xué)院基轉(zhuǎn)所飼養(yǎng)，使用許可證編號：SYXK（陜）2022-004。

1.5 方法

1.5.1 水蒸氣蒸餾法提取植物揮發(fā)油

參考文獻(xiàn)[4]肉豆蔻碾碎并稱取50 g加入10倍量水浸泡2 h，用揮發(fā)油提取器提取8 h，得透明色具有清香氣味的肉豆蔻揮發(fā)油。參考文獻(xiàn)[5,8]將100 g花椒碾碎，加入500 mL純水，用揮發(fā)油提取器提取4 h得淺黃色具有清香氣味的花椒揮發(fā)油。

1.5.2 供試品凝膠的制備

精密稱取75 mg苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品，置于250 mL的容量瓶中，加水使之溶解并定容，得0.3 mg/mL的苦參堿溶液。稱取4 g卡波姆940凝膠基質(zhì)放入200 mL燒杯中，加入5 mL甘油，攪拌使甘油與卡波姆混勻，再緩慢分次加入200 mL 0.3 mg/mL的苦參堿溶液，攪拌混勻，密封放置，使之充分溶脹，制成200 mL苦參堿凝膠[9-10]。

每份10 mL苦參堿凝膠，共17份。其中，4份加入2%，4%，6%和8%的氮酮，4份加入2%，4%，6%和8%的肉豆蔻揮發(fā)油，4份加入2%，4%，6%和8%的花椒揮發(fā)油，4份加入2%，4%，6%和8%的肉豆蔻、花椒1∶1復(fù)配揮發(fā)油，剩余一份作為空白對照，攪拌均勻，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 體外透皮擴(kuò)散試驗(yàn)

離體鼠皮的制備：將大鼠處死，去除其腹部的毛，迅速剝?nèi)「共科つw，去除皮下脂肪等組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗直至洗液澄清，剪成面積約5 cm2大小，置于盛有0.9%生理鹽水的燒杯中備用[9-10]。

在接收池中加入30%的乙醇生理鹽水作為接收液，將處理好的鼠皮固定在擴(kuò)散池的供給池與接受池之間，用手術(shù)剪剪去多余皮膚，真皮一側(cè)與接收液接觸，傾斜排盡氣泡，并在供給池（擴(kuò)散面積為3.14 cm2，容積為8 mL）的供給面上均勻涂上供試凝膠。將接收池置于恒溫（37±1 ℃）調(diào)控磁力攪拌器上，并以恒定的速度攪拌接收液，平行做三組。每隔一定時(shí)間從接收池中取出1 mL接收液，并向接收池中補(bǔ)加等量的接收液[9-10]。

1.5.4 高效液相色譜測定苦參堿含量

苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：精密稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，加入乙腈-無水乙醇（80∶20，V/V）溶液使之溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

色譜條件[10]：選用色譜柱Kromasil NH2柱（5 μm，100 A，250×4.6 mm）；乙腈-無水乙醇-3%磷酸（80∶10∶10，V/V）作為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫：室溫，檢測波長220 nm；進(jìn)樣量10 μL。

由1.5.3小節(jié)得到的接受液作為樣品經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后，供HPLC進(jìn)樣分析。測定峰面積值，計(jì)算樣品中苦參堿的濃度。

1.5.5 高效液相方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密稱取0.02 g苦參堿溶于100 mL的容量瓶，用乙腈-無水乙醇定容，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的苦參堿溶液，再分別吸取5，10，15，20和25 mL 0.2 mg/mL的苦參堿溶液至100 mL容量瓶，加乙腈-無水乙醇稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL的苦參堿溶液，搖勻。吸取上述苦參堿溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程[10]。

精密度試驗(yàn)：精密吸取1.5.4小節(jié)中質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.5.4小節(jié)中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）[10]。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取含有肉豆蔻揮發(fā)油和花椒揮發(fā)油各0.3 mL的接受液，與室溫下放置，分別在0，4，6，8，10和12 h后按1.5.4小節(jié)中的色譜條件進(jìn)樣，記錄其峰面積。計(jì)算SRSD[10]。

重復(fù)性試驗(yàn)：取6份含有濃度為6%的復(fù)配揮發(fā)油的接受液，1 h后按1.5.4小節(jié)中的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，記錄峰面積。計(jì)算SRSD[10]。

1.5.6 累積透過量及透皮速率

將1.5.4小節(jié)所得各樣品的苦參堿濃度代入式（1）和（2）計(jì)算苦參堿單位面積累計(jì)透過量Qr（μg·cm-2）和透皮速率Js（μg·cm-2·h-1）[9,11]。

式中：C為t時(shí)間的濃度測量值，mg/mL；V為每次取樣的體積 mL；S為擴(kuò)散池有效面積，cm2；T為取樣總的時(shí)間間隔，h。

1.5.7 皮膚滯留量Qs的測定

按1.5.3小節(jié)試驗(yàn)進(jìn)行4 h后，取下擴(kuò)散池上的皮膚，用棉簽蘸取無水乙醇溶液，擦凈表面及背面殘留的藥物，再將皮膚用剪刀剪碎，用10 mL乙腈-無水乙醇（80∶20，V/V）浸泡3 h，超聲提取30 min后，抽濾，濃縮至3 mL，濾液過0.45 μm濾膜，利用HLPC測定峰面積值，計(jì)算樣品中苦參堿的濃度，即得皮膚滯留量[9,11]。

1.5.8 HE染色觀察促滲劑對皮膚組織的影響

將1.5.3小節(jié)所得皮膚浸入甲醛固定液中浸泡24 h，乙醇脫水（70% 24 h，80% 24 h，95% 2 h，無水乙醇1.5 h）后，氯仿透明24 h，浸蠟Ⅰ（50～55 ℃）1 h，浸蠟Ⅱ（58～62 ℃）1 h，石蠟包埋（65～70 ℃），冷卻凝固成塊。將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)，切成薄片，用乙醇伊紅染色液染色2 min，倒置顯微鏡下觀察氮酮與不同濃度、不同種類的揮發(fā)油促滲劑對皮膚表皮細(xì)胞與細(xì)胞間隙的影響[9,11]。

1.5.9 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較在進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 累積透過量

由表1和圖1可知，苦參堿的累積透過量均大于空白組，且隨透過時(shí)間的增加而增加。當(dāng)促滲劑濃度為6%時(shí)，累積透過量最大。不同濃度的氮酮，肉豆蔻揮發(fā)油，花椒揮發(fā)油，肉豆蔻與花椒1∶1復(fù)配揮發(fā)油對苦參堿的透皮吸收均有促進(jìn)作用。當(dāng)促滲劑濃度為6%或8%時(shí)，促滲能力由強(qiáng)到弱依次是肉豆蔻與花椒1∶1復(fù)配揮發(fā)油＞肉豆蔻揮發(fā)油＞花椒揮發(fā)油＞氮酮。當(dāng)促滲劑濃度為2%或4%時(shí)，促滲能力由強(qiáng)到弱依次是：肉豆蔻與花椒1∶1復(fù)配揮發(fā)油＞花椒揮發(fā)油＞肉豆蔻揮發(fā)油＞氮酮。

圖1 累積透過量（μg·cm-2）與濃度，時(shí)間關(guān)系

表1 累積透過量與濃度、時(shí)間關(guān)系 單位：μg·cm-2

以滲透時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，累積透過量（μg·cm-2）為縱坐標(biāo)做苦參堿累積透過量與肉豆蔻揮發(fā)油濃度及時(shí)間關(guān)系圖，結(jié)果見圖2。

圖2 苦參堿累積透過量與肉豆蔻揮發(fā)油濃度及時(shí)間關(guān)系圖

由圖2可知，肉豆蔻揮發(fā)油濃度為6%時(shí)，苦參堿的累積透過量最大，證明此濃度下的肉豆蔻揮發(fā)油透皮促滲作用最強(qiáng)，相比較之下，濃度為2%時(shí)，累積透過量最小，促滲作用最弱。當(dāng)濃度為4%和8%時(shí)，苦參堿的累積透過量未見明顯差距。

以滲透時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，累積透過量（μg·cm-2）為縱坐標(biāo)做苦參堿累積透過量與花椒揮發(fā)油濃度及時(shí)間關(guān)系圖，結(jié)果見圖3。

圖3 苦參堿累積透過量與花椒揮發(fā)油濃度及時(shí)間關(guān)系圖

由圖3可知，隨著時(shí)間的變化，苦參堿累積透過量不斷增加，前3 h透皮效果有明顯差異，3 h后，濃度為2%和8%的花椒揮發(fā)油促滲效果未見明顯差距，濃度為4%和6%的花椒揮發(fā)油促滲效果也接近，但促滲作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于濃度為2%和8%的花椒揮發(fā)油。

以滲透時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，累積透過量（μg·cm-2）為縱坐標(biāo)做苦參堿累積透過量與肉豆蔻，花椒1∶1復(fù)配揮發(fā)油濃度及時(shí)間關(guān)系圖，結(jié)果見圖4。

圖4 苦參堿累積透過量與肉豆蔻，花椒1∶1復(fù)配揮發(fā)油濃度及時(shí)間關(guān)系圖

由圖4可知，隨著時(shí)間的變化，苦參堿累積透過量不斷增加，且當(dāng)肉豆蔻與花椒1∶1復(fù)配揮發(fā)油濃度為6%時(shí)，累積透過量最大。當(dāng)濃度為8%時(shí)，累積透過量雖有所減少，但仍比其他濃度的累積透過量大。

以滲透時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，累積透過量（μg·cm-2）為縱坐標(biāo)做苦參堿累積透過量與氮酮濃度及時(shí)間關(guān)系圖，結(jié)果見圖5。

圖5 苦參堿累積透過量與氮酮濃度及時(shí)間關(guān)系圖

2.2 透皮速率

由表2可知，透皮1 h后，透皮速率均呈現(xiàn)下降趨勢。不同種類的促滲劑均在濃度為6%時(shí)，透皮速率最快。當(dāng)加入促滲劑的濃度大于6%時(shí)，不同種類促滲劑的透皮速率由快到慢的順序是肉豆蔻與花椒1∶1復(fù)配揮發(fā)油＞肉豆蔻揮發(fā)油＞花椒揮發(fā)油＞氮酮；當(dāng)加入促滲劑的濃度小于6%時(shí)，不同種類促滲劑的透皮速率由快到慢的順序是肉豆蔻與花椒1∶1復(fù)配揮發(fā)油＞花椒揮發(fā)油＞肉豆蔻揮發(fā)油＞氮酮，且不同濃度促滲劑的透皮速率均大于空白組。

表2 透皮速率與濃度、時(shí)間關(guān)系 單位：μg·cm-2·h-1

2.3 皮膚滯留量QS

以促滲劑濃度為橫坐標(biāo)，皮膚滯留量（μg/mL）為縱坐標(biāo)做圖，結(jié)果見圖6。

圖6 苦參堿皮膚滯留量與促滲劑種類及濃度關(guān)系圖

圖7 不同促滲劑對大鼠腹部皮膚的影響（HE染色，x100）

由表3與圖6可知，不同濃度揮發(fā)油、氮酮的皮膚滯留量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于空白組。當(dāng)加入花椒揮發(fā)油的濃度為2%，6%和8%時(shí)，苦參堿的滯留量與其他促滲劑相比有顯著的差距，從減少苦參堿滯留量方面考慮，花椒揮發(fā)油具有較好的促滲作用。

表3 皮膚滯留量與濃度關(guān)系 單位：μg/mL

2.4 促滲劑對皮膚組織的影響

空白組皮膚結(jié)構(gòu)完整，角質(zhì)層完好無損，表皮細(xì)胞排列緊密[13]。與空白組相比，加入促滲劑可以增大細(xì)胞間隙，對角質(zhì)層有明顯作用，植物揮發(fā)油對角質(zhì)層破壞遠(yuǎn)低于化學(xué)促滲劑氮酮。花椒揮發(fā)油，肉豆蔻揮發(fā)油，復(fù)配揮發(fā)油均可使皮膚角質(zhì)層細(xì)胞間隙明顯增大，花椒揮發(fā)油使細(xì)胞間隙略有增大但角質(zhì)層脂質(zhì)仍排列整齊，故花椒揮發(fā)油促滲對皮膚角質(zhì)層破壞較小?；ń窊]發(fā)油和肉豆蔻揮發(fā)油復(fù)配后細(xì)胞間隙增大最為明顯，且角質(zhì)層結(jié)構(gòu)較為完整，并未完全破壞角質(zhì)層的有序排列[7]，故肉豆蔻與花椒復(fù)配揮發(fā)油可提高皮膚通透性，促進(jìn)藥物透皮吸收。

2.5 高效液相方法學(xué)考察

加樣回收率試驗(yàn)：取已知含有量的接受液6份，精密量取1 mL，加入0.1 mg/mL的苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL，混勻，量取10 μL按1.5.4小節(jié)中的色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按1.5.5小節(jié)線性關(guān)系考察方法依次進(jìn)行測定，繪制苦參堿標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。

由圖8知，苦參堿回歸方程為Y=4 143.1X+1.277 2，R2=0.999 3線性范圍0.01～0.05 mg/mL，在線性范圍內(nèi)線性良好。

精密度試驗(yàn)：按1.5.5小節(jié)精密度試驗(yàn)方法依次進(jìn)行測定，得到苦參堿峰面積分別為415.096 3，425.456 8，424.783 5，408.658 4，401.845 9和406.485 6，苦參堿平均峰面積為413.721 1，SRSD為2.16%。結(jié)果表明該儀器具有良好的精密度。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按1.5.5小節(jié)穩(wěn)定性試驗(yàn)方法依次進(jìn)行測定，苦參堿峰面積分別為17.045 3，16.048 2，23.453 6，22.387 5，19.483 1和24.987 5，12 h內(nèi)苦參堿平均峰面積為20.567 5，SRSD為1.75%，表明接受液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：按1.5.5小節(jié)重復(fù)性試驗(yàn)方法依次進(jìn)行測定，苦參堿含量分別為0.015 7%，0.015 2%，0.016 3%，0.015 5%，0.015 4%和0.014 9%，苦參堿的平均含量為0.015 5%，SRSD為2.81%，表明重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：按1.5.5小節(jié)加樣回收率試驗(yàn)方法依次進(jìn)行測定，苦參堿的回收率分別為100.6%，98.55%，97.25%，98.90%，101.55%和98.95%，其平均回收率為99.30%，SRSD為1.54%。表明該方法回收率好。

3 結(jié)論與討論

此研究發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油能夠大幅改善苦參堿的透皮效果，顯著地提高藥物在皮膚中的滲透速率，這可能與其改變皮膚角質(zhì)層的通透性有關(guān)。皮膚角質(zhì)層致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是活性成分經(jīng)皮吸收的主要屏障，當(dāng)其所含脂質(zhì)成分及角蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象等發(fā)生變化時(shí)，可導(dǎo)致其通透性及屏障作用改變[12]。王茵等[8]通過對比不同濃度、不同種類的植物揮發(fā)油對苦參堿透皮促滲效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉豆蔻和花椒揮發(fā)油復(fù)配使用后的促滲效果顯著優(yōu)于單一使用。有人研究溫?zé)崴幮詫]發(fā)油透皮促滲劑皮膚毒性的影響及其機(jī)制研究，指出熱性藥揮發(fā)油的皮膚細(xì)胞毒性顯著大于溫性藥揮發(fā)油，皮膚刺激性卻沒有顯著性差異，但兩者均遠(yuǎn)低于經(jīng)典的化學(xué)促滲劑氮酮[12]。采用揮發(fā)油復(fù)配的思路即可提高透皮促滲的效果，又可避免細(xì)胞毒及刺激性的問題[8]。此研究提出的肉豆蔻和花椒揮發(fā)油復(fù)配的解決方法具有一定的創(chuàng)新性。

此研究確定了肉豆蔻揮發(fā)油和花椒揮發(fā)油對苦參堿透皮促滲吸收的最佳濃度，有較強(qiáng)的應(yīng)用推廣和深入研究的價(jià)值。肉豆蔻和花椒藥食同源，安全無毒[14]，其揮發(fā)油可作為原料添加到化妝品，及外用藥中做促滲劑。故未來研究仍需進(jìn)一步探索肉豆蔻、花椒揮發(fā)油復(fù)配后透皮促滲的作用機(jī)制及成分變化，也需從抗炎、抗感染、擴(kuò)張皮膚血管等多角度深入研究復(fù)配揮發(fā)油的生物活性[13-14]。將植物復(fù)配揮發(fā)油用于食品添加劑和化妝品中促滲，是一種可提高治療效果的有效策略。