王佳佳，徐慧敏，孟鑫

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）

豬油，是最常食用的動(dòng)物油脂之一，我國擁有豐富的豬油資源，因其含有多種人體必需脂肪酸和高級(jí)多烯酸[1]，是一種可供開發(fā)利用的優(yōu)質(zhì)油脂資源。然而，因豬油中富含飽和脂肪酸，長(zhǎng)期食用易引發(fā)高血脂、高血壓等疾病，常被認(rèn)為是一種不健康食用油。有研究證明，長(zhǎng)期只攝入植物油脂而不攝入動(dòng)物油脂會(huì)食欲不振，傷口不易愈合，增加患糖尿病、貧血和心血管疾病等慢性病風(fēng)險(xiǎn)[2]，豬油與大豆油搭配食用有顯著的抗肥胖[3]和降血壓的功效[4]。豬油中含量最高的單不飽和脂肪酸——油酸，以甘油酯的形式存在于天然動(dòng)、植物油中，是人體脂肪組織和血液中豐富的脂肪酸之一[5]。研究表明，在飲食中攝入適量的油酸可以減少由高脂血癥引起的心血管疾病發(fā)生的概率[6]，有助于維持心腦血管健康[7]。

為此，試驗(yàn)以豬油為原材料，采用尿素包合法對(duì)豬油中的油酸進(jìn)行富集，通過動(dòng)物試驗(yàn)，考察油酸對(duì)高脂血癥小鼠血脂代謝的影響，豐富單不飽和脂肪酸資源，為合理利用豬油資源提供新途徑，并為進(jìn)一步解析油酸降血脂機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬油（實(shí)驗(yàn)室自制）；氫氧化鈉、尿素、95%乙醇、硫酸、無水硫酸鈉、正己烷（均為分析純）；正己烷、甲醇（色譜純）。

60只雄性昆明小鼠（購于錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），體重20～25 g；甘油三酯（TC）試劑盒、總膽固醇（TG）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，南京建成生物研究所；膽固醇、膽酸鈉（食品級(jí)，佳味源實(shí)業(yè)有限公司）；豬油（自制）；蛋黃粉（食品級(jí)，萬邦化工科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

XD-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH-2A型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；GCMS6800氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）；Readmax1900型光吸收全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 油酸富集的工藝優(yōu)化

稱取30 g豬油，加入到一定濃度的氫氧化鈉-乙醇溶液中加熱回流，回流過程中加入蒸餾水，使皂化液充分溶解，待皂化液冷卻后，用20%硫酸調(diào)節(jié)pH 2～3左右，移入分液漏斗，加入正己烷萃取，萃取液沖洗至中性，加入無水硫酸鈉干燥過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸獲得混合脂肪[8]。

將95%乙醇與尿素添加到圓底燒瓶中，在80 ℃水浴鍋中加熱回流，待尿素全部溶解后，將混合脂肪酸加入其中，加熱回流40 min，待混合物冷卻到室溫，于低溫下包合一段時(shí)間[9]。包合結(jié)束后，迅速抽濾，取出濾液，旋蒸除去乙醇，用硫酸調(diào)節(jié)pH 2～3，加入正己烷萃取，將有機(jī)相調(diào)節(jié)至中性，用無水硫酸鈉干燥過濾，旋蒸后得到包合后的混合脂肪酸[10]。油酸得率按式（1）計(jì)算。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化油酸富集工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取包合時(shí)間（A）、脲酯比（B）、醇脲比（C）為考察因素，以油酸得率（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 13軟件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以油酸得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 油酸富集工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因子水平及編碼

1.3.2.2 脂肪酸甲酯化

取50 mg脂肪酸，加入5 mL正己烷，溶解后加入0.8 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，于30 ℃水浴15 min，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)樣分析。

1.3.2.3 GC-MS條件

色譜柱為J&W DB-5石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序：初始溫度150 ℃，持續(xù)1 min，以5 ℃/min升溫至210 ℃，持續(xù)3 min，以5 ℃/min升至250 ℃；流速1 mL/min；分流比10∶1，高純氦為載氣。電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃。脂肪酸相對(duì)含量由峰面積相對(duì)歸一法確定。

1.3.3 油酸對(duì)高脂血癥小鼠血脂代謝的影響

1.3.3.1 試驗(yàn)小鼠分組

60只昆明小鼠（SPF級(jí)）飼養(yǎng)在恒溫24 ℃環(huán)境中，每組10只，隨機(jī)分為6組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，1組作為空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，其他5組均飼喂高脂飼料（70%基礎(chǔ)飼料、15%豬油、10%蛋黃粉、3%膽固醇和2%膽酸鈉），飼喂4周后，采血獲得血清，檢測(cè)血脂水平，判斷高脂血癥模型建立是否成功。模型建造成功后，繼續(xù)高脂飼料飼喂，高脂模型組僅飼喂高脂飼料，低、中、高劑量油酸組每天分別灌胃2，4和8 g/kg油酸，陽性藥物組灌胃5 mg/kg辛伐他汀，連續(xù)灌胃4周。此期間小鼠自由飲食飲水直至灌胃結(jié)束。

1.3.3.2 小鼠指標(biāo)的檢測(cè)

灌胃結(jié)束后，所有小鼠禁食不禁水24 h，采血，靜置2 h后，按6 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，于-20 ℃保存。檢測(cè)血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。

1.3.3.3 小鼠肝臟組織切片觀察

小鼠肝臟組織經(jīng)多聚甲醛固定后，采用蘇木-伊紅染色后，通過熒光顯微鏡觀察小鼠肝組織病理變化。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 26.0、Design Expert 13數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 模型建立與數(shù)據(jù)分析

結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，依據(jù)Design-Expert 13軟件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以油酸得率（Y）為響應(yīng)值，包合時(shí)間（A）、脲酯比（B）、醇脲比（C）為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，進(jìn)行通過回歸分析，得到各因素與油酸得率方程式：油酸得率=55.85-2.48A-1.95B-0.450 0AB-0.742 5AC+2.04BC-5.68A2-4.10B2-5.06C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

方差分析結(jié)果如表3所示。該二次方程模型方差分析模型顯著（P＜0.05），失擬項(xiàng)P值為0.847 0，不顯著，證明該方程與試驗(yàn)的失擬較小，結(jié)果能夠較好反映出試驗(yàn)的真實(shí)性。由F值可知，各因素對(duì)油酸得率影響次序?yàn)锽＞A＞C。根據(jù)Design Expert 13給出的回歸方程，得出油酸富集的最佳工藝條件：包合時(shí)間8.00 h、醇脲比4.27∶1，脲脂比1.7∶1。在此條件下，油酸最大得率53.28%。

表3 回歸模型方差分析

2.1.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面線圖能直接反映兩因素交互影響的程度，2個(gè)因素之間交互作用越顯著，曲面圖變化幅度越大。油酸得率A、B、C之間兩兩交互作用的響應(yīng)面分析如圖1所示。與P值相結(jié)合可得，兩兩因素交互作用顯著程度順序?yàn)锽C＞AC＞AB。

圖1 響應(yīng)面交互作用分析圖

2.2 油酸對(duì)高脂血癥小鼠的血脂代謝影響

2.2.1 油酸對(duì)高脂血癥小鼠血脂代謝的影響

由圖2可知，高脂模型組小鼠血清中HDL-C含量極顯著低于空白組（P＜0.01），而TC、TG、LDL-C水平極顯著高于空白組（P＜0.01）。低、中、高灌胃劑量組TG、TC、LDL-C均有不同程度降低且呈現(xiàn)劑量-依賴性下降，3組均與模型組有極顯著差異（P＜0.01）。油酸低、中劑量組HDL-C含量極顯著高于高脂模型組（P＜0.01），高劑量組HDL-C水平略微低于中劑量組，但仍顯著高于高脂模型組。

圖2 油酸對(duì)小鼠血脂代謝影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，油酸能夠降低高脂血癥小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，從而改善高脂血癥小鼠的血脂代謝異常，對(duì)高脂食物誘導(dǎo)的代謝綜合征有一定治療作用，可以在降血脂方面提供新的選擇，并為進(jìn)一步研究油酸的降血脂機(jī)制提供方向。

2.2.2 油酸對(duì)高脂血癥小鼠肝臟組織的影響

對(duì)各組小鼠的肝臟切片觀察結(jié)果見圖3。空白組小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，未見脂肪空泡；高脂模型組小鼠肝臟組織細(xì)胞排列混亂，可見大滴脂肪空泡，脂肪化程度較高。藥物陽性對(duì)照組切片未見脂肪空泡，細(xì)胞排列整齊。與模型組相比，低中劑量組，脂肪空泡數(shù)量逐漸減少，偶可見較小脂滴，脂肪化程度減??；高劑量組改善效果尤為明顯，細(xì)胞邊界清晰，排列整齊，未見脂肪空泡，肝細(xì)胞基本恢復(fù)正常，與陽性藥物對(duì)照組接近。

圖3 小鼠肝臟組織HE染色切片觀察結(jié)果（200×）

試驗(yàn)證明肝臟病變程度隨油酸劑量增大而減小，油酸對(duì)高脂血癥小鼠肝臟具有一定保護(hù)作用，可以減小肝臟的病變程度。

3 結(jié)論

以豬油為原料，采用尿素包合法對(duì)豬油中的油酸進(jìn)行富集，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法相結(jié)合探究包合時(shí)間、脲脂比、醇脲比對(duì)油酸富集結(jié)果的影響。油酸富集最佳工藝條件為包合時(shí)間8.00 h、醇脲比4.27∶1，脲脂比1.7∶1，油酸得率最大（53.28%）。將優(yōu)化工藝獲得的油酸飼喂高脂血癥小鼠，能夠顯著降低高脂血癥小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，對(duì)飲食引起的血脂增高有較好的改善作用，對(duì)高脂血癥具有一定預(yù)防作用，可作為一種優(yōu)質(zhì)的具有降血脂功能的食品資源，為進(jìn)一步拓展豬油在食品加工中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。