何靈芝，簡(jiǎn)顯瑀，王達(dá)川，金建

1.四川保寧醋有限公司（閬中 637400）；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院（綿陽 621000）

醬油因其特有的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到全球人民的追捧[1]。我國(guó)的醬油生產(chǎn)歷史十分悠久，國(guó)內(nèi)主要在生產(chǎn)工藝優(yōu)化[2-3]與新型原材料開發(fā)利用[4]、智能監(jiān)控醬油發(fā)酵[5-6]、優(yōu)良米曲霉菌株選育[7]和多菌種協(xié)同作用改善風(fēng)味[8-9]等方面探索醬油釀造的新方向。

醬油發(fā)酵過程中由米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶能有效分解原料中的蛋白質(zhì)大分子，使醬油中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更易被人體吸收，同時(shí)賦予醬油其獨(dú)特的風(fēng)味并保證醬油的品質(zhì)[10-11]。提高酶活性可以加速物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，國(guó)內(nèi)外開展了一系列處理技術(shù)的研究，如超聲波處理[12]、強(qiáng)電場(chǎng)處理[13]、輻照處理[14]、高壓處理[15]和化學(xué)試劑處理[16]。超聲波作為一項(xiàng)新興的物理加工處理技術(shù)，相對(duì)安全、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)環(huán)保，被廣泛運(yùn)用于活性產(chǎn)物輔助提取[17-18]和食品加工[19]。荊卉等[20]闡述了超聲波的物理、化學(xué)效應(yīng)以及蛋白質(zhì)改性相關(guān)方面的研究進(jìn)展。Tra等[21]研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化超聲波處理?xiàng)l件后，α-淀粉酶活性可提高47%，在一定程度上為米曲霉所產(chǎn)蛋白酶的超聲波處理提供了借鑒。

醬油生產(chǎn)工藝分為低鹽固態(tài)發(fā)酵和高鹽稀態(tài)發(fā)酵。在稀態(tài)發(fā)酵過程中，若采用新型物理加工技術(shù)，可縮短醬油發(fā)酵周期和提高原料利用率。因此，試驗(yàn)探討低強(qiáng)度雙頻超聲波處理對(duì)米曲霉代謝產(chǎn)生的蛋白酶活性影響，為新技術(shù)在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供一定借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉、麩皮、豆粕（四川保寧醋有限公司）；福林酚（生化試劑，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；三氯乙酸，分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇華特實(shí)驗(yàn)儀器有限責(zé)任公司）；KH-300SP雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器股份有限公司）；Centrifuge 5425R德國(guó)艾本德高速冷凍離心機(jī)（艾本德中國(guó)有限公司）；HZQ-160F全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；V-5600（PC）紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 米曲霉蛋白酶粗酶液的制備與提取

1.2.1.1 米曲霉的培養(yǎng)

制備PDA培養(yǎng)基，滅菌后趁熱倒平板。稱取0.1 g米曲霉菌粉于100 mL滅菌生理鹽水中，在無菌環(huán)境中振蕩20 min使之混合均勻，用移液槍吸取1 mL米曲霉液于9 mL生理鹽水的試管中，振蕩混合均勻后，重復(fù)上述操作步驟按梯度稀釋。取0.1 mL最終稀釋米曲霉酶液，用滅菌后的涂布器均勻涂抹平板，在30 ℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)3 d。

1.2.1.2 孢子懸浮液的制備

用100 mL在121 ℃下滅菌20 min的生理鹽水將平板上的成熟米曲霉孢子洗脫，并用滅菌脫脂棉進(jìn)行過濾，從而除去洗脫液中的菌絲體，將孢子懸浮液裝入無菌錐形瓶中，振蕩20 min使之達(dá)到混合均勻的效果。

1.2.1.3 米曲霉的搖瓶培養(yǎng)

取2 mL米曲霉孢子懸浮液入滅菌后的麩皮豆粕培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)4 d并每隔16 h抖動(dòng)錐形瓶進(jìn)行1次翻曲[22]。

1.2.1.4 蛋白酶粗酶液的提取

取100 mL磷酸緩沖液于麩皮豆粕培養(yǎng)基中，在40℃下恒溫水浴攪拌1 h，用濾紙過濾，并在4 000 r/min條件下離心20 min，取其上清液，即為米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶粗酶液。

1.2.2 蛋白酶活力的測(cè)定

1.2.2.1 蛋白酶活力單位的定義

蛋白酶在pH 7.5和溫度40 ℃條件下，1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)酶活力單位，用U表示。

1.2.2.2 蛋白酶活力的測(cè)定

移取1 mL蛋白酶液于試管中，在40 ℃下恒溫水浴5 min，加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的酪蛋白溶液，混勻并在40 ℃下恒溫水浴反應(yīng)15 min，加入3 mL 10%三氯乙酸，室溫靜置20 min后以4 500 r/min離心20 min（4℃）。吸取1 mL上清液，加入5 mL 0.55 mol/L碳酸鈉溶液和0.5 mL福林酚試劑，在40 ℃下恒溫水浴20 min顯色，并在波長(zhǎng)680 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.2.3 蛋白酶活力計(jì)算

蛋白酶活力按式（1）計(jì)算。

式中：X為蛋白酶活力，U/mL；A為試驗(yàn)組的吸光度；A0為空白對(duì)照的吸光度；0.002 9為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；0.010 4為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；15為酶解反應(yīng)時(shí)間，min；n為粗酶液稀釋的倍數(shù)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 超聲波處理時(shí)間對(duì)蛋白酶酶活的影響

取50 mL酶液于500 mL燒杯中，加入200 mL磷酸緩沖液（pH 7.5）。固定超聲處理溫度20 ℃、25 kHz與40 kHz超聲工作時(shí)間比10∶50（s/s）、超聲功率密度50 W/L，分別超聲處理0，5，10，15，20和30 min，處理結(jié)束后，取1 mL酶液測(cè)定酶活。每個(gè)水平重復(fù)3次試驗(yàn)，每次重復(fù)平行測(cè)定3次酶活。

1.2.3.2 超聲功率密度對(duì)蛋白酶酶活的影響

取50 mL酶液于500 mL燒杯中，加入200 mL磷酸緩沖液（pH 7.5）。固定25 kHz與40 kHz超聲工作時(shí)間比10∶50（s/s）、超聲處理溫度20 ℃，分別在超聲波功率密度25，50，100，125和150 W/L下處理10 min。其余操作同1.2.3.1。

1.2.3.3 超聲波處理介質(zhì)溫度對(duì)蛋白酶酶活的影響

取50 mL酶液于500 mL燒杯中，加入200 mL磷酸緩沖液（pH 7.5）。固定25 kHz與40 kHz超聲工作時(shí)間比10∶50（s/s）、超聲功率密度25 W/L，分別在介質(zhì)溫度15，20，25，30和40 ℃下超聲波處理10 min。其余操作同1.2.3.1。

對(duì)照組（恒溫水浴）：取50 mL酶液于500 mL燒杯中，加入200 mL磷酸緩沖液（pH 7.5），在恒溫（15，20，25，30和40 ℃）水浴下保溫10 min。

1.2.3.4 雙頻超聲波工作時(shí)間比對(duì)蛋白酶酶活的影響

取50 mL酶液于500 mL燒杯中，加入200 mL磷酸緩沖液（pH 7.5）。固定超聲溫度25 ℃、超聲功率密度25 W/L，分別在25 kHz與40 kHz超聲工作時(shí)間比10∶50，10∶20，20∶30，10∶10，30∶20，20∶10（s/s）的參數(shù)下處理10 min。其余操作同1.2.3.1。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于超聲處理各個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取單因素的優(yōu)水平及相鄰的2個(gè)水平，按照L9(34)正交表對(duì)超聲處理工藝參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，因素與相關(guān)水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.5 最佳超聲波處理工藝驗(yàn)證

試驗(yàn)組：取50 mL酶液于500 mL燒杯中，加入200 mL磷酸緩沖液（pH 7.5）。設(shè)定超聲波處理溫度20 ℃、超聲功率密度25 W/L、25 kHz與40 kHz超聲波工作時(shí)間比20∶30（s/s），處理10 min后，取1 mL酶液，測(cè)定吸光度并計(jì)算酶液的酶活力。

對(duì)照組以恒溫水浴代替超聲波處理。處理結(jié)束后，分別取1 mL酶液，按照酶活力的測(cè)定步驟進(jìn)行操作，測(cè)定吸光度并計(jì)算酶液的酶活力。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，每次重復(fù)平行測(cè)定3次。數(shù)據(jù)處理與圖形繪制采用Excel軟件，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)設(shè)定顯著性水平α=0.05（n=9）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲波處理時(shí)間對(duì)蛋白酶活性的影響

固定超聲處理溫度20 ℃、25 kHz與40 kHz超聲工作時(shí)間比10∶50（s/s）、超聲功率密度50 W/L，超聲波處理時(shí)間對(duì)蛋白酶活性的影響見圖1。

圖1 超聲波處理時(shí)間對(duì)蛋白酶活性的影響

隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶活性先增強(qiáng)后逐漸減弱。超聲波處理時(shí)間10 min時(shí)，酶活性到達(dá)最大值。超聲波空化效應(yīng)引起的綜合作用，如局部高溫高壓、微射流和剪切力等會(huì)導(dǎo)致蛋白酶催化活性中心暴露，進(jìn)而酶活性增強(qiáng)[12]。然而，長(zhǎng)時(shí)間的超聲波處理可導(dǎo)致蛋白酶的變性，從而酶活性減弱[23]。

2.1.2 超聲波功率密度對(duì)蛋白酶活性的影響

固定超聲處理溫度20 ℃、25 kHz與40 kHz超聲工作時(shí)間比10∶50（s/s）、超聲處理時(shí)間10 min，超聲波功率密度對(duì)蛋白酶活性的影響見圖2。

圖2 超聲波功率密度對(duì)蛋白酶活性的影響

隨著超聲波處理功率密度的增大，蛋白酶活性先增強(qiáng)后逐漸減弱，超聲波功率密度25 W/L時(shí)，酶活性達(dá)到最大值。超聲功率密度增大，超聲波引起的空化效應(yīng)足以使蛋白酶空間構(gòu)象發(fā)生變化，有利于酶與底物接觸，從而發(fā)揮催化作用，故而酶活性加強(qiáng)。然而，隨著超聲波處理功率密度繼續(xù)增大，蛋白酶的空間構(gòu)象朝著不利于催化的方向變化，或者酶分子發(fā)生變性，活性喪失，酶活減弱[20,24]。

2.1.3 超聲波處理介質(zhì)溫度對(duì)蛋白酶活性的影響

固定超聲波處理功率密度25 W/L、25 kHz與40 kHz超聲工作時(shí)間比10∶50（s/s）、超聲處理時(shí)間10 min，超聲波處理介質(zhì)溫度對(duì)米曲霉產(chǎn)的蛋白酶活性的影響見圖3。

圖3 超聲波處理介質(zhì)溫度對(duì)蛋白酶活性的影響

在相同溫度條件下，恒溫水浴下的蛋白酶活性隨溫度升高而增強(qiáng)，在恒溫水浴30 ℃條件下，蛋白酶活性趨于穩(wěn)定[25-26]。與恒溫水浴處理相比，相同介質(zhì)溫度下，超聲波處理后的酶活性先增強(qiáng)后逐漸減弱，超聲波處理溫度25 ℃時(shí)，蛋白酶活性最強(qiáng)且高于恒溫水浴處理下的酶活性。超聲波處理溫度低于25 ℃時(shí)，液體溫度越高，對(duì)空化效應(yīng)的產(chǎn)生越有利，蛋白酶空間構(gòu)象的變化越明顯，有利于酶與底物接觸，故而酶活性加強(qiáng)。但當(dāng)超聲波處理溫度高于25 ℃且溫度逐步上升時(shí)，液體氣泡中蒸汽壓增大，因此氣泡閉合時(shí)增強(qiáng)了緩沖作用而使空化效應(yīng)減弱[27]，蛋白酶空間構(gòu)象的變化減小，故而酶活性減弱。

2.1.4 雙頻超聲波工作時(shí)間比對(duì)蛋白酶活性的影響

固定超聲波處理功率密度25 W/L、超聲處理時(shí)間10 min、超聲波處理溫度25 ℃，雙頻率超聲波工作時(shí)間比對(duì)蛋白酶活性的影響見圖4。

圖4 雙頻超聲波工作時(shí)間比對(duì)蛋白酶活性的影響

25 kHz與40 kHz超聲工作時(shí)間比20∶30（s/s）處理蛋白酶活性高且穩(wěn)定，蛋白酶活性隨著25 kHz頻率超聲波時(shí)間占比的增加大體上符合先增強(qiáng)后逐漸減弱的趨勢(shì)。超聲波頻率越低，在液體中產(chǎn)生空化越容易[28]。頻率越高，空化氣泡越小，空化強(qiáng)度越弱[29]。隨著25 kHz超聲波時(shí)間占比的增加，空化強(qiáng)度增大[30]，蛋白酶空間構(gòu)象的變化越明顯，故而酶活性加強(qiáng)。但當(dāng)25 kHz超聲波時(shí)間占比繼續(xù)增大時(shí)，空化效應(yīng)產(chǎn)生的大氣泡更易形成表面振蕩，小空化泡的非球形擾動(dòng)主要發(fā)生在崩潰階段，易促使空化泡潰滅[31-32]，從而降低空化強(qiáng)度，蛋白酶空間構(gòu)象的變化減弱，故而酶活性減弱。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。各因素對(duì)蛋白酶活性的影響效果由大到小依次排序?yàn)槌暅囟龋ˋ）＞工作時(shí)間比（C）＞超聲時(shí)間（B）。直觀分析得出的最優(yōu)組合為A1B2C2，即超聲波處理溫度20 ℃，超聲波處理時(shí)間10 min，25 kHz與40 kHz超聲波工作時(shí)間比20∶30（s/s）。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)各因素方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明，超聲波處理溫度對(duì)蛋白酶活性影響極顯著（P＜0.01），25 kHz與40 kHz超聲波工作時(shí)間比對(duì)蛋白酶活性影響顯著（P＜0.05），超聲波處理時(shí)間對(duì)蛋白酶活性影響不顯著（P＞0.05）。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.3 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果

由圖5可知，基于最優(yōu)工藝參數(shù)[超聲波處理溫度20 ℃、功率密度25 W/L、處理時(shí)間10 min、25 kHz與40 kHz超聲波工作時(shí)間比20∶30（s/s）]處理下的蛋白酶，其活性較對(duì)照組的提高了5.68%，表明適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜梢蕴岣叩鞍酌傅幕钚?，這可能與超聲波的空化效應(yīng)引起酶分子空間構(gòu)象的變化有關(guān)[33]。

圖5 最佳超聲波處理與未超聲處理對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

蛋白酶分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和多肽是醬油釀造過程中的重要環(huán)節(jié)。以蛋白酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討雙頻超聲波處理蛋白酶提高活性的工藝條件，經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定出雙頻超聲波處理的最優(yōu)工藝參數(shù)，即超聲溫度20 ℃、超聲時(shí)間10 min、超聲功率密度25 W/L、5 kHz與40 kHz超聲波工作時(shí)間比20∶30（s/s），其活性較未經(jīng)超聲波處理的對(duì)照組提高了5.68%。試驗(yàn)結(jié)果表明雙頻超聲波對(duì)蛋白酶的酶解有促進(jìn)作用，說明超聲波處理是提升蛋白酶活性的一種有效途徑，可為醬油釀造傳統(tǒng)工藝現(xiàn)代化提供參考借鑒。