劉旭平 王浩楠 張茜 冷平生 胡增輝

摘 要 香葉基香葉基焦磷酸合酶（GGPPS）是調(diào)節(jié)萜類化合物生物合成的關(guān)鍵酶，為了研究GGPPS基因在百合萜類物質(zhì)合成中的作用，本試驗(yàn)以‘西伯利亞百合（Lilium ‘Siberia）為試材，克隆了GGPPS大亞基（LiGGPPS.LSU）和小亞基（LiGGPPS.SSU）基因，并分析其表達(dá)和功能。通過生物信息學(xué)分析、相對(duì)表達(dá)量分析、熒光定量PCR、亞細(xì)胞定位、基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）預(yù)測(cè)并驗(yàn)證其特征及功能，揭示其表達(dá)模式。結(jié)果表明，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分別為1 100 bp和1 040 bp，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU的氨基酸序列與其他物種的GGPPS.LSU和GGPPS.SSU的氨基酸序列具有較高的一致性，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示它們分別與薯蕷（Dioscorea cayenensis subsp. rotundata）和深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）親緣關(guān)系最近。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因均定位在葉綠體中，表達(dá)量隨百合的生長(zhǎng)發(fā)育呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。LiGGPPS.LSU在花被片中高量表達(dá)，LiGGPPS.SSU在花藥中顯著高量表達(dá)。VIGS試驗(yàn)顯示芳樟醇、羅勒烯、月桂烯釋放量下降。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因?qū)Π俸匣ㄏ銌屋祁愇镔|(zhì)合成具有重要作用，本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究百合GGPPS以及相關(guān)代謝途徑提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? ‘西伯利亞百合；GGPPS；萜烯化合物；基因克?。槐磉_(dá)分析

釋放花香是開花植物的重要特性［1］。花香在吸引傳粉者［2-3］和抵御病蟲害［4-5］等方面具有重要作用?；ㄏ阋彩腔ɑ苤匾挠^賞性狀，對(duì)于提升花卉的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要作用?；ㄏ阄镔|(zhì)由一系列低分子量揮發(fā)性有機(jī)化合物組成，包括萜烯類、苯環(huán)類/苯丙烷類、脂肪族類、含硫化合物和含氮化合物等 ［6］。萜烯化合物是植物產(chǎn)生的眾多化合物中最大的一類，如芳樟醇、羅勒烯和月桂烯等［7］，是許多植物花香的主要成分，揭示其合成機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步了解其功能，進(jìn)而進(jìn)行調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

目前已經(jīng)清楚，萜烯化合物源自異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和它的同分異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸 （dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），二者可通過位于質(zhì)體的甲基赤蘚糖醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑和胞質(zhì)中甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑合成［8］。這兩種途徑的類異戊二烯通量在多個(gè)層面受到嚴(yán)格調(diào)控，除受通路基因及其并行同源基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還受轉(zhuǎn)錄后/翻譯水平和反饋調(diào)節(jié)的控制［9］。香葉基香葉基焦磷酸合酶（farnesyl/geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）處于途徑下游，能夠催化1分子DMAPP和3分子IPP通過3個(gè)連續(xù)的縮合步驟形成GGPP ［10］。GGPPS負(fù)責(zé)類胡蘿卜素等的生物合成［11］，參與催化蛋白的異戊二烯化［12］，同時(shí)也是控制植物代謝中“碳流”方向的類異戊二烯化合物［13］。植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了同源和異源二聚體兩種類型的GGPPS，異源二聚體GGPPS由一個(gè)非活性小亞基（SSU）和一個(gè)大亞基（LSU）組成［14］。SSU自身不具有催化活性，不能通過形成同源二聚體催化反應(yīng)，但能夠與LSU或GPPS互相作用，調(diào)節(jié)后者發(fā)揮生物學(xué)功能，改變GGPP和GPP生物合成的比例［15］。目前，已在芒果（Mangifera indica）［16］、竹葉花椒（Zanthoxylum armatum）［17］、山雞椒（Litsea cubeba）［18］、茉莉花（Jasminum sambac）［19］、梔子（Gardenia jasminoides）［20］等植物中發(fā)現(xiàn)GGPPS基因?qū)葡┖铣删哂兄匾饔?，但GGPPS大亞基和小亞基基因在百合中尚未被克隆，在百合花香萜烯合成中的作用還不清楚。

萜烯是植物花香的主要成分［21］，也是多種百合花香的關(guān)鍵成分。由于在長(zhǎng)期育種過程中忽視花香［22］，造成不同品種百合間花香存在顯著差異，有些百合香氣過濃，有些過淡［23］，均影響其觀賞和應(yīng)用價(jià)值，因此改造花香，培育花香怡人的新品種是百合育種的熱點(diǎn)方向。萜烯化合物的差異釋放被認(rèn)為是造成百合花香差異的主要原因［24］，因此，查清萜烯合成調(diào)控機(jī)制是開展百合花香定向育種的基礎(chǔ)和依據(jù)。

本研究以東方百合‘西伯利亞（Lilium ‘Siberia）為材料，克隆LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因，通過生物信息學(xué)分析、相對(duì)表達(dá)量分析、熒光定量PCR、亞細(xì)胞定位、VIGS功能驗(yàn)證以及蛋白的互作分析，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證其特征及功能，揭示其表達(dá)模式，為揭示LiGGPPS基因大亞基和小亞基在‘西伯利亞百合單萜物質(zhì)合成中的作用和功能奠定基礎(chǔ)，為開展百合花香育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為‘西伯利亞百合實(shí)生苗（種球購自北京荷景良苑貿(mào)易有限公司），以盆播的方式種植于北京農(nóng)學(xué)院?jiǎn)纹旅鏈厥掖笈铮?0° 5′24″N， 116° 17′55″E）中，栽培基質(zhì)中草炭土與蛭石的體積比為2∶1，給予適當(dāng)?shù)奶镩g養(yǎng)護(hù)。

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、無病蟲害、均高1 m的植株，采集花蕾期、初開期、半開期、盛開期和衰敗期的花被片和盛開期百合的根、莖、葉、外花被片、內(nèi)花被片、子房、花藥、花柱和花絲，經(jīng)液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存。每組樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 使用RNA提取盒TransZol Up Plus RNA Kit（全式金，ET111- 01）分別提取5個(gè)花期的‘西伯利亞百合花被片和盛開期百合各組織的RNA，電泳后檢測(cè)該RNA的質(zhì)量及濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金，AT311-02）將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 基因全長(zhǎng)克隆 通過3代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因。使用SnapGene軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：FastHiFi PCR MasterMix?? 12.5 μL，cDNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)的條件為：98 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火? 30 s，72 ℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收、連接轉(zhuǎn)化、測(cè)序鑒定及比對(duì)分析。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用NCBI在線軟件CD-Search進(jìn)行基因保守結(jié)構(gòu)域檢索，通過BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)，從檢索結(jié)果中隨機(jī)下載若干序列。使用MEGA11軟件中的Muscle算法進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，步長(zhǎng)檢驗(yàn)（Bootstrap Replication）1 000次。使用WoLF PSORT在線軟件（https：∥wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.2.4 相對(duì)表達(dá)量分析 根據(jù)克隆得到的LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因，使用Primer Primier軟件設(shè)計(jì)熒光擴(kuò)增引物（表1），將9.5 μL ddH2O、1 μL Forward GSP、1 μL Reverse GSP、1 μL cDNA、12.5 μL 2× SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Takara，RR420A）注入八聯(lián)排管各孔中，進(jìn)行qRT-PCR分析。根據(jù)相對(duì)表達(dá)量公式2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，分析顯著性差異并作圖。

1.2.5 VIGS功能驗(yàn)證 選取LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因開放閱讀框200 bp序列插入到酶切后的pTRV2載體中，設(shè)計(jì)引物L(fēng)iTGGPPS.LSU-F/R和LiTGGPPS.LSU-F/R（表1）對(duì)目的基因片段進(jìn)行同源克隆。利用同源重組法構(gòu)建pNCTRV2-LiGGPPS.LSU和pNCTRV2-LiGGPPS.SSU沉默載體，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101細(xì)胞中。挑取轉(zhuǎn)化單菌落到Kan+和Rif+液體培養(yǎng)基中，菌液PCR檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)化菌株。制備農(nóng)桿菌VIGS菌液，采用注射法侵染‘西伯利亞百合花被片，同時(shí)以注射空載體pNC-TRV2菌液的植株和WT作為對(duì)照組。將處理后的植株于20 ℃培養(yǎng)間遮光處理12 h后轉(zhuǎn)為正常光照，培養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。采用固相微萃取方法采集花香物質(zhì)，通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定花香釋放量，使用MSD Productivity ChemStation的NIST14鑒定揮發(fā)物的成分［25］，使用Excel 2020統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

如圖 1所示，克隆得到的LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU片段分別為1 100 bp和? 1 040 bp。經(jīng)切膠回收，連接轉(zhuǎn)化，測(cè)序比對(duì)，確定目的基因的最終序列。

2.2 生物信息學(xué)分析

經(jīng)序列比對(duì)（圖2），LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU與其他物種的GGPPS.LSU和GGPPS.SSU序列具有較高一致性，可能具有相似的功能。系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）顯示LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分別與薯蕷（Dioscorea cayenensis subsp. rotundata）和深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）親緣關(guān)系較近。

2.3 花期表達(dá)特性分析

如圖4所示，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU在‘西伯利亞百合5個(gè)不同花期中的表達(dá)量具有顯著性差異（P<0.05），隨著百合的生長(zhǎng)發(fā)育，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。LiGGPPS.LSU的表達(dá)量在初開期達(dá)到峰值，在衰敗期的表達(dá)量最低；LiGGPPS.SSU的表達(dá)量在盛開期達(dá)到峰值，在花蕾期的表達(dá)量最低。LiGGPPS.LSU在初開期和半開期的表達(dá)量相近；LiGGPPS.SSU在初開期、半開期和衰敗期的表達(dá)量相近，是花蕾期表達(dá)量的3倍。

2.4 組織表達(dá)特性分析

如圖5所示，LiGGPPS.LSU在花被片中高量表達(dá)，LiGGPPS.SSU在花藥中顯著高量表達(dá)，在葉片和子房的表達(dá)量均最低。

2.5 VIGS功能驗(yàn)證

圖6-A顯示，沉默株系中LiGGPPS.LSU和GGPPS.SSU基因表達(dá)量顯著降低，沉默效率為89%和85%。圖6-B顯示，與對(duì)照組（pNC-TRV2侵染的花瓣和野生型正常生長(zhǎng)的花瓣WT）相比，發(fā)病植株花被片單萜釋放量大幅下降?；虺聊?，單萜物質(zhì)芳樟醇、羅勒烯、月桂烯較WT相比，分別下降了12.3、14和8.3倍和20、17.7和5倍。

3 討? 論

萜烯化合物是植物花香的主要成分，也是多種百合花香的關(guān)鍵成分。GGPPS家族中有部分同源基因?qū)祁惔x起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，能顯著影響植物體內(nèi)萜類化合物的合成［18］。但GGPPS基因大亞基和小亞基在百合中尚未被克隆，本試驗(yàn)利用‘西伯利亞百合克隆LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分別為1 100 bp和1 040 bp。LiGGPPS.LSU的表達(dá)量在初開期達(dá)到峰值，然后逐漸減小，于花被片中高量表達(dá)；LiGGPPS.SSU在盛開期表達(dá)量最高，在花藥中表達(dá)量? 顯著。

‘西伯利亞百合MEP途徑上游合成酶基因LiDXS與LiDXR在葉綠體中特異表達(dá)，在盛開期高量表達(dá)，在花被片中表達(dá)量顯著［26］。單萜合酶基因LiTPS基因在花被片中高量表達(dá)，在盛開期表達(dá)量最高［27］。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU與LiDXS、LiDXR、LiTPS存在于同一個(gè)通路中，且基因時(shí)空表達(dá)具有相同的特征，說明LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU可能在單萜合成中發(fā)揮重要作用。通過VIGS試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)病植株花被片單萜釋放量及其相關(guān)合成基因的表達(dá)量均顯著下降，證明LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU在單萜合成中具有重要作用。

水稻GGPPS的二聚狀態(tài)由GGPPS融合蛋白（GRP）控制，OsGGPPS1與OsGRP聚合形成的異源二聚體比OsGGPPS1同源二聚體的催化效率更高，說明它可能通過決定OsGGPPS1在葉綠體中的分配，影響GGPP向下游途徑的代謝流量［28］。對(duì)胡椒薄荷（Mentha piperita）和仙女扇（Clarkia breweri）的研究說明SSU和LSU/GGPPS的結(jié)合可以增強(qiáng)異源二聚體的GPPS催化特性［29］。啤酒花 （Humulus lupulus）中，SSU與HlGPPS.LSU形成異源二聚體，產(chǎn)生GPP和GGPP，且酶活性顯著高于? HlGPPS.LSU自身催化效率［30］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtGGPPS.LSU和AtGGPPS.SSU共同參與了單萜的生物合成［31］。在金魚草（Antirrhinum majus）中，單獨(dú)不具有活性的GGPPS.SSU在體內(nèi)可以和GGPPS.LSU以疏水作用結(jié)合形成異源二聚體調(diào)節(jié)GGPPS.LSU的活性［32］。煙草（Nicotiana tabacum）GGPPS.LSU能夠形成同源二聚體，催化GGPP的合成。但與AmSSU I結(jié)合后，轉(zhuǎn)基因煙草中單萜類物質(zhì)含量增加［33］。

4 結(jié)? 論

GGPPS.LSU和GGPPS.SSU是萜類化合物合成中重要的結(jié)構(gòu)基因，可能共同參與了MEP途徑中烯萜化合物的合成，對(duì)于調(diào)控‘西伯利亞百合花香物質(zhì)合成具有重要的作用。本研究對(duì)深入揭示百合萜類合成的分子機(jī)制有重要作用，為進(jìn)一步研究植物中GGPPS以及相關(guān)代謝途徑提供理論基礎(chǔ)，也為今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控植物萜烯化合物合成提供了研究思路。

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Cloning， Expression and Functional Analysis of LiGGPPS.LSU? and LiGGPPS.SSU Involved in Flower Fragrance Synthesis in Lilium

Abstract Geranylgeranyl pyrophosphate synthase（GGPPS） is a crutial enzyme that regulats terpenoid biosynthesis in plants. To investigate the role of GGPPS genes in lily terpenoid synthesis， we cloned LiGGPPS. LSU and LiGGPPS.SSU genes and analyzed their expression and function using ‘Siberian lily as test material. Bioinformatics analysis， relative expression analysis， fluorescence quantitative PCR， subcellular localization， VIGS（virus induced gene silencing） and yeast two-hybrid were used to predict and verify their characteristics and functions， and to reveal their expression patterns. Results showed that LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU were 1 100 bp and 1 040 bp，respectively， with the amino acid sequences that?? had high similarity with those of other species.Phylogenetic analysis showed that LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU had the closest relationship with DcGGPPS.LSU and AsGGPPS.SSU in Dioscorea cayenensis subsp.rotundata? and Apostasia shenzhenica. Both LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU were localized in the chloroplasts， and their expression showed an rising trend， followed by declining trend as the flower grew and developed. LiGGPPS.LSU was highly expressed in the tepals，while LiGGPPS.SSU was highly expressed in the anthers. The VIGS assay showed a decrease in the release of linalool， basilene and lauricene. The findings suggest that LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU genes play an important role in the synthesis of monoterpenes in lily flowers，providing a theoretical basis for further research on LiGGPPS and related metabolic pathways.

Key words? Lilium ‘Siberia; GGPPS; Terpene compounds; Gene cloning; Expression analysis