陳 菲,李 麗,包春娟

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是一種由細(xì)胞分泌到胞外間質(zhì)構(gòu)成3D復(fù)雜網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的大分子物質(zhì),主要作用是支持和連接組織的結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動,其主要成分聚糖和纖連蛋白構(gòu)成結(jié)構(gòu)支架[1]。組織經(jīng)過復(fù)雜的脫細(xì)胞過程可獲得天然的ECM支架,常用于組織工程學(xué)與再生醫(yī)學(xué)的器官重建。作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,目前ECM成為研究熱點(diǎn),但有關(guān)腫瘤ECM的制備鮮有報道,主要原因是樣本量少、制作難度大。目前,組織脫細(xì)胞方法有物理、化學(xué)和酶解等方法。本文介紹一種冷凍切片聯(lián)合石蠟切片,使用化學(xué)方法制作脫細(xì)胞支架材料的簡單方法,效果較好,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備人肝腫瘤(含癌旁)組織(樣本通過四川大學(xué)華西醫(yī)院生物標(biāo)本庫申請,本研究所使用的患者信息和生物樣本均獲得患者本人或直系親屬的同意,相關(guān)實(shí)驗(yàn)經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn))、冷凍組織OCT包埋劑(epredia NEG50)、一次性刀片(epredia MX35 Ultra)、蘇木精(epredia Hematoxylin 7211)、伊紅(epredia 7111)、天狼星紅試劑盒(Sbjbio BP-DL030)、檸檬酸組織抗原修復(fù)液(福州邁新MVS-0101)、羊血清(北京中杉金橋公司,#ZLI-9021)、驢血清(ImmunoReagents,#SP-072-VX2)、兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(Dako K5007)、Fibronectin抗體(ab2413)、Collagen Ⅰ抗體(ab34710)、Alexa Fluor594 donkey anti-rabbit IgG(invitrogen A21207)、DAPI(sigma D9542)、防淬滅封片劑、冷凍切片機(jī)(epredia NX70)、石蠟切片機(jī)(epredia HM340E)、自動封片機(jī)(epredia Clearvue)、光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51)、熒光顯微鏡(Leica 2000B)。

1.2 方法

1.2.1冷凍切片 將人肝腫瘤(含癌旁)組織切成大小1.5 cm×1.5 cm×1 cm(長×寬×高)的塊狀(如樣本小于該尺寸則不再修取),冷凍托盤涂抹少量OCT包埋劑后將組織黏合、冷凍;設(shè)置冷凍切片機(jī)溫度(樣本頭溫度-5 ℃,刀架溫度-25 ℃,切片厚400 μm),進(jìn)行冷凍切片(圖1),依次將切好的樣本放入6孔板內(nèi)(圖2),直至組織切完。在培養(yǎng)皿(直徑×高為10 cm×2 cm)內(nèi)加入0.1%曲拉通(Triton X-100)工作液搖床震蕩3 h(80 r/min)、去離子水搖床震蕩3 h、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)工作液搖床震蕩6 h、去離子水搖床震蕩3 h、0.1%Triton X-100工作液搖床震蕩3 h、去離子水搖床震蕩3 h、PBS搖床震蕩3 h。

1.2.2石蠟包埋和切片 選取1片脫細(xì)胞組織(圖3)放入墊硬紙板的包埋盒中,展平、加蓋,放入10%中性福爾馬林固定48 h,將樣本放入全自動脫水機(jī)中進(jìn)行脫水、透明、浸蠟處理(程序設(shè)置:55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各30 min,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各10 min,57 ℃石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ分別為15、30、30 min),石蠟包埋(圖4)、石蠟切片厚度為4 μm,貼于黏附載玻片上備用。

1.2.3常規(guī)HE、天狼星紅染色、免疫組化和免疫熒光染色 (1)HE染色:脫蠟后將切片放入蘇木精染液中3 min,1%鹽酸乙醇分化,流水返藍(lán),伊紅染色30 s,依次從80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ脫水和分色,二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明,Clearvue自動封片機(jī)封片。(2)天狼星紅染色:將切片脫蠟后滴加天狼星紅染液200 μL,常溫放置30 min,蒸餾水稍洗,常規(guī)脫水透明、封片。(3)免疫組化染色(本實(shí)驗(yàn)采用EnVision兩步法):脫蠟后的切片放入檸檬酸組織抗原修復(fù)液中,95 ℃水浴20 min,待冷卻后PBS清洗,0.3%H2O2孵育15 min阻斷過氧化物酶,清洗后甩掉組織周圍液體(組織切勿干燥),滴加10%羊血清和10%驢血清等體積混合液200 μL[2],室溫封閉20 min,甩掉后直接在組織上滴加200 μL一抗Fibronectin(稀釋比1 ∶100)工作液,4 ℃冰箱孵育過夜后PBS清洗,在組織上滴加200 μL兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒中的二抗(ChemMate EnVision+HRP),37 ℃孵育45 min,清洗后滴加顯色劑DAB工作液200 μL,光鏡下控制顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、Clearvue自動封片機(jī)封固。(4)免疫熒光染色:脫蠟后的切片放入檸檬酸組織抗原修復(fù)液中,90 ℃水浴20 min,待冷卻后PBS清洗,滴加10%羊血清和10%驢血清等體積混合液200 μL,室溫封閉20 min,甩掉后直接在組織上滴加200 μL一抗Collagen Ⅰ(稀釋比1 ∶200)工作液,4 ℃冰箱孵育過夜后PBS清洗,避光滴加200 μL二抗Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG(稀釋比1 ∶500),37 ℃孵育45 min,清洗后滴加200 μL DAPI,5 min后清洗3次,緩沖甘油封片。

2 結(jié)果

人肝腫瘤組織經(jīng)脫細(xì)胞化處理后,HE染色中細(xì)胞核無蘇木精著色,間質(zhì)呈紅色(圖5);天狼星紅染色可見大量膠原纖維成分,呈亮紅色(圖6);免疫組化Fibronectin抗體驗(yàn)證了大量纖連蛋白的存在,呈棕黃色網(wǎng)狀分布(圖7);免疫熒光Collagen Ⅰ抗體呈紅色絲狀廣泛分布(圖8)。脫細(xì)胞處理前人肝臟組織(對照組)經(jīng)DAPI染色,細(xì)胞核呈藍(lán)色球狀分布(圖9);脫細(xì)胞后經(jīng)DAPI染色已無藍(lán)色細(xì)胞核存在(圖10)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,新鮮組織冷凍后切成厚薄均一的片狀,經(jīng)脫細(xì)胞處理聯(lián)合使用石蠟包埋切片的方法,最終采用多種病理染色方法驗(yàn)證,脫細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)保持完整且染色效果良好。

3 討論

目前腫瘤仍是威脅人類健康的主要問題之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)公布的2020年度全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示,我國已成為“癌癥大國”,新發(fā)病例和死亡人數(shù)均位居全球首位。進(jìn)一步完善腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,有助于我們更深入地了解其生物學(xué)行為,同時為腫瘤患者的治療尋找新的契機(jī)。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管、淋巴管以及各種信號分子和ECM相互作用而形成的一個復(fù)雜的綜合系統(tǒng)[3]。ECM作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分,在腫瘤的全生命周期中扮演著重要角色[4]。通過對ECM的降解與重塑,改變其蘊(yùn)含的生物物理和生物化學(xué)信號,進(jìn)而為腫瘤的發(fā)展和侵襲奠定條件[5]。研究ECM在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的動態(tài)演變歷程,對完善腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制以及探索新型診斷和預(yù)后評估指標(biāo)具有重要意義。相比傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng),對于涵蓋復(fù)雜信號通路的三維體內(nèi)環(huán)境無法真實(shí)呈現(xiàn)。因此,保留天然的ECM并在其上培養(yǎng)細(xì)胞乃至類器官的優(yōu)勢凸顯,完全實(shí)現(xiàn)體內(nèi)微環(huán)境的模擬[6]。由于物種間存在差異和研究的深入,動物脫細(xì)胞支架已無法滿足人體內(nèi)環(huán)境的模擬;而人體組織或器官稀缺不易獲取,因此有關(guān)人脫細(xì)胞支架的報道并不多見。對于完整或較大的實(shí)質(zhì)性器官(如大鼠肝臟、腎臟,人脂肪肝[7-9]等)脫細(xì)胞支架材料的制備,通常運(yùn)用蠕動泵等設(shè)備進(jìn)行灌注、結(jié)合凍融及化學(xué)脫細(xì)胞處理;對于空腔器官組織(如豬結(jié)腸、血管、膽總管[10-12]等)脫細(xì)胞支架材料的制備,通常使用化學(xué)脫細(xì)胞和浸泡震蕩的方法進(jìn)行處理;另有文獻(xiàn)報道,使用切肉機(jī)將豬肝臟組織切成2 mm厚的切片,酶解聯(lián)合化學(xué)和浸泡振蕩方法處理[8],而對于臨床實(shí)質(zhì)性器官的腫瘤類手術(shù)樣本,考慮到體積小不宜使用插管灌注法,也不宜使用簡單的直接浸泡震蕩法,更無法使用如手動切肉機(jī)這樣的設(shè)備將組織進(jìn)行厚切片,只能另辟蹊徑尋求其他方案。本文介紹的將人肝腫瘤組織冷凍切片再進(jìn)行脫細(xì)胞處理的方法,優(yōu)勢在于其可以最大限度地保存樣本體積、切片連續(xù)且厚度均一,操作便捷。如何獲得理想效果總結(jié)如下:(1)將新鮮組織置于常溫軟化,在冷凍切片機(jī)底部涂抹少量的冷凍組織OCT包埋劑將其黏附在托盤上即可,避免包埋劑使用過量。(2)冷凍切片機(jī)的最佳溫度應(yīng)調(diào)至樣本頭溫度為-5 ℃、刀架溫度為-25 ℃,樣本頭溫度過高會導(dǎo)致組織黏附在切片板上皺縮,溫度過低會導(dǎo)致組織變硬、變脆斷裂;刀架溫度可以設(shè)置低溫,保證切片完整且連續(xù)。(3)組織脫細(xì)胞時應(yīng)注意充分震蕩,及時觀察樣本是否已經(jīng)變?yōu)榘咨胪该鳡?后期可行相關(guān)病理檢測來驗(yàn)證脫細(xì)胞的效果和成分。(4)本文選用其中的1片脫細(xì)胞支架即可進(jìn)行石蠟包埋及一系列的病理相關(guān)檢測,剩余脫細(xì)胞支架可繼續(xù)做體外細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)譜成像檢測等相關(guān)研究。目前本科室冷凍切片機(jī)的最大切片厚度為400 μm,實(shí)驗(yàn)中作者嘗試用100 μm、200 μm、300 μm和400 μm厚度的組織切片,結(jié)果發(fā)現(xiàn)400 μm厚度的組織切片效果適宜,不僅能夠徹底脫細(xì)胞,僅1張ECM支架材料就能夠滿足石蠟多張切片需求,最大程度節(jié)省了手術(shù)樣本的損耗。目前本科室已順利完成20余例手術(shù)樣本的脫細(xì)胞支架實(shí)驗(yàn)并獲得研究者的認(rèn)可,該方法可推廣應(yīng)用。