包 凌，龔旋坤，龐 青，陳 曉

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，安徽 蚌埠 233000）

肝 細(xì) 胞 性 肝 癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤。肝細(xì)胞癌的相對 5 年生存率約為 18%［1］。目前已知肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素有慢性乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、黃曲霉素、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎和各種代謝性疾病［2］。不幸的是，由于腫瘤異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)微環(huán)境，患者對抗癌治療反應(yīng)較差［3-5］。

最近的證據(jù)表明，腫瘤異質(zhì)性是由具有干細(xì)胞或干細(xì)胞特征的細(xì)胞亞群驅(qū)動(dòng)的，稱為癌癥干細(xì)胞（cancer stem cells， CSCs）［6，7］。癌 癥 干 細(xì) 胞 也 稱 為腫瘤起始細(xì)胞，具有通過自動(dòng)修復(fù)進(jìn)行自我更新的能力。肝細(xì)胞與干細(xì)胞具有相似的特征，如在特定條件下自我更新和無限增殖［8-10］。重要的是，癌癥干細(xì)胞在肝細(xì)胞癌生長，復(fù)發(fā)和耐藥性中起著至關(guān)重要的作用［11］。此外，廣泛的研究表明，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment， TME）在促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲性和干性方面具有重要作用［12-14］。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞存在的周圍微環(huán)境，包括周圍的血管、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓源性炎性細(xì)胞、各種信號分子和細(xì)胞外基質(zhì)。CSCs 可以通過TME調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號通路來誘導(dǎo)非CSC 轉(zhuǎn)化為CSC，這一過程進(jìn)一步導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良［15］。此外，CSC的內(nèi)在信號可以重塑TME，導(dǎo)致血管生成，膠原蛋白重塑和PD-1 / PD-L1 介導(dǎo)的免疫逃逸［16］。因此，全面了解高度異質(zhì)的CSC 及其與TME 的動(dòng)態(tài)相互作用對于探索CSC 靶向治療策略和提高當(dāng)前免疫療法的有效性至關(guān)重要。

在這項(xiàng)研究中，利用ssGSEA 算法和26 個(gè)公共干性基因集來全面了解HCC 的干性景觀。通過無監(jiān)督聚類確定了兩種干性亞型。隨后采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 （weighted correlation network analysis，WGCNA）來鑒定與干性亞型和預(yù)后相關(guān)的基因?；贑ox 回歸和隨機(jī)森林生存分析，構(gòu)建了一個(gè)干性風(fēng)險(xiǎn)模型。此外，研究干性風(fēng)險(xiǎn)評分與預(yù)后、TME 模式以及化療和免疫治療對肝細(xì)胞癌的療效之間的相關(guān)性。總體而言，研究結(jié)果表明，干性風(fēng)險(xiǎn)評分可以有效預(yù)測HCC 患者預(yù)后和免疫治療反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 HCC 細(xì)胞系（Huh-7、SUN-449 和SMMC-7721）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，永生化正常肝細(xì)胞系LO2 購自上海通培生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 臨床樣本收集于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科2019 年1 月～2021 年12 月手術(shù)切除的所需樣本組織。細(xì)胞組織快速裂解液和蛋白酶抑制劑購自雅酶生物技術(shù)公司，BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒、1%青霉素-鏈霉素購自碧云天生物技術(shù)公司，兔多克隆抗體GSDMC 和抗兔IgG 抗體購自Proteintech 公 司，Dulbecco 的 改 良Eale 培 養(yǎng) 基、PMI-1640 培養(yǎng)基購自Gibco 公司，10%胎牛血清購自武漢普諾賽生命科技有限公司，Trizol 購自上海賽默飛世爾科技（中國）有限公司，cDNA 試劑盒購自維諾贊科技有限公司。該研究已獲得倫理學(xué)的批準(zhǔn)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院委員會（2023YJS12 0），并獲得了所有患者的個(gè)體同意。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備和預(yù)處理 從TCGA（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）獲 得 了HCC 樣 本 數(shù) 據(jù)集，TCGA 是一個(gè)公開可用的數(shù)據(jù)庫，可提供33 種癌癥類型的匹配正常樣本［17］。數(shù)據(jù)集包括HCC 樣本的臨床注釋和生存時(shí)間。

1.2.2 HCC 干性亞型的共識聚類 為了鑒定HCC中的干性亞型，采用了StemChecker，這是一種基于網(wǎng)絡(luò)的工具，用于探索基因集中的干性特征［18］。使用StemChecker 檢索了26 個(gè)干性基因集，并對其進(jìn)行了預(yù)處理以進(jìn)行后續(xù)分析。使用基因集變異分析GSVAR 包［19］進(jìn)行單樣本基因集富集分析，定量評估每個(gè)HCC 樣本中26 個(gè)基因集的干性富集評分。利用K-means 聚類方法進(jìn)行1 000 次迭代，然后使用ConsensusClusterPlus R 包執(zhí)行無監(jiān)督共識聚類，以確保可靠性。

1.2.3 TME 細(xì)胞組成和ESTIMATE 評分 采用CIBERSORT 用于 根據(jù)基因表 達(dá)譜［20］表征復(fù)雜組織中的細(xì)胞組成，以計(jì)算HCC 樣品中22 個(gè)免疫細(xì)胞的浸潤分?jǐn)?shù)。此外，使用“estimate”R 包［21］評估了每個(gè)HCC 樣本的免疫和基質(zhì)評分。

1.2.4 化療敏感性和免疫治療反應(yīng) 為了預(yù)測臨床化療反應(yīng)，使用“pRRophetic”R 包，它可以預(yù)測基線腫瘤基因表達(dá)的反應(yīng)［22］。通過 “pRRophetic”R 包計(jì)算半抑制濃度 （half maximal inhibitory concentration， IC50）來評估幾種藥物（吉西他濱、多柔比星、博來霉素、依托泊苷和米多龍林）的敏感性。為了評估免疫治療反應(yīng)，采用TIDE，這是http：//tide.dfci.harvard.edu/提供的在線工具，可根據(jù)基因表達(dá)預(yù)測免疫治療反應(yīng)。

1.2.5 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 選擇方差最高的前3 000 個(gè)基因，使用“WGCNA”R 包構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)［23］。使用適當(dāng)?shù)膬纾≧2=0.9）轉(zhuǎn)換為拓?fù)渚仃?，使用?dòng)態(tài)樹切割方法對模塊進(jìn)行劃分，并根據(jù)0.25高度的截止值合并類似的模塊。使用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)評估模塊與基因表達(dá)特征之間的關(guān)系。與基因表達(dá)特征相關(guān)性最高的模塊被選為使用“clusterProfiler”R 包進(jìn)一步進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）。

1.2.6 預(yù)后模型的構(gòu)建 進(jìn)行Cox 回歸分析，從關(guān)鍵模塊中識別總生存期相關(guān)基因。然后使用這些總生存期相關(guān)基因構(gòu)建隨機(jī)森林生存模型，以評估每個(gè)基因的重要性。根據(jù)相對重要性選擇前4 個(gè)基因進(jìn)行Cox 回歸分析，構(gòu)建預(yù)后模型。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Huh-7 和LO2 細(xì)胞在Dulbecco 的 改 良Eale 培 養(yǎng) 基 中 培 養(yǎng)，SUN-449 和SMMC-7721 細(xì)胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37.5 ℃和5%CO2中孵育。當(dāng)Huh-7 細(xì)胞密度在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中達(dá)到70%至80%時(shí)，在Huh-7 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GSDMC 過表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.8 RNA 提取和qRT-PCR 使用Trizol 試劑從Huh-7，SUN-449，SMMC-7721 和LO2 中 提 取 總RNA，然后根據(jù)制造商的說明使用cDNA 制備試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行定量PCR。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算靶基因的相對表達(dá)水平。用于檢測GSDMC和GAPDH表達(dá)如下：GSDMC前 引 物：5'-TCCATGTGTGGAACGCATTAGC-3'，GSDMC后 引 物：5'-CAAACTGACGTAATTTGGTGGC-3'；GAPDH前 引 物5'-CAA-TGACCCCTTCATTGACC-3'，GAPDH后引物5'-GACAAGCTTCCCGTTC-TCAG-3'。

1.2.9 Western Blot 從配對的HCC 和鄰近的正常組織中提取蛋白質(zhì)。使用BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。 取等量的蛋白樣品行SDS-PAGE 電泳，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用無蛋白快速封閉溶液密封30 min。加入一抗并在 4 ℃ 下孵育過夜。 然后用PBST 洗滌膜3 次與二抗稀釋室溫?fù)u床孵育2 h。ECL-plus 檢測 PVDF 膜上的蛋白信號，曝光并顯影。

1.2.10 免疫組織化學(xué) 將HCC 組織和配對的相鄰良性組織樣品置于二甲苯中并用梯度級乙醇水合進(jìn)行脫蠟，然后在檸檬酸鹽緩沖液中加熱以進(jìn)行抗原回收。淬滅過氧化物酶活性后，將切片與抗體在4 °C 下孵育過夜。次日將二抗在室溫下孵育1 h，然后脫水密封，最后在顯微鏡下檢查。

1.2.11 成球?qū)嶒?yàn) NC-Huh-7 細(xì)胞和OE-Huh-7 細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用PBS 洗滌，然后用無血清DMEM / F12 懸浮。每個(gè)孔用15 000 個(gè)細(xì)胞處理，最初僅加入1 mL 球形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將腫瘤細(xì)胞接種到6 孔康寧平板中，每2 天加入球形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基。第1 天、第3 天、第7 天、第14 天拍攝，14 d 后每孔計(jì)數(shù)腫瘤球狀體（直徑＞100 mm）。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R 軟件（版本4.1.0）進(jìn)行?！癵gplot2”R 包（版本：3.3.6）用于圖形表示。分別使用“生存”R 包（版本：3.4-0）和“randomForest”R 包（版本：4.7-1.1）進(jìn)行單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸和隨機(jī)森林分析。“glmnet”R 包（版本：4.1-4）用于構(gòu)建預(yù)后模型。GraphPad Prism 9.0用于分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并使用配對的t檢驗(yàn)分析組間的差異。每個(gè)測試重復(fù)3 次，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定HCC 的干性亞型

該研究共納入了328 個(gè)HCC 樣本。計(jì)算每位患者26 個(gè)干性基因集的富集評分，并通過共識聚類分析鑒定出兩個(gè)不同的干性集群，標(biāo)記為C1 和C2（圖1A，B）。與C2 集群相比，C1 集群中26 個(gè)干性基因集的富集得分顯著更高（圖1C）。

圖1 鑒定HCC 的干性亞型Fig 1 Identification of the stemness subtypes of HCC

2.2 C1、C2 生存分析

Kaplan-Meier 生存分析顯示，兩個(gè)集群之間的OS 存在顯著差異，C2 患者的OS 優(yōu)于C1（圖2A）。在調(diào)整年齡、性別和分期后，這種關(guān)系仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C2 患者的風(fēng)險(xiǎn)比低于C1（HR： 0.667 7，95% CI： 0.451 2 to 0.988 0）（圖2B）。

圖2 C1、C2 生存分析Fig 2 Survival analysis of C1 and C2

2.3 C1、C2 與TME 和ESTIMATE 分?jǐn)?shù)的相關(guān)性及化療敏感性和免疫治療反應(yīng)分析

通過使用CIBERSORT 算法評估22 種免疫細(xì)胞類型的浸潤水平，進(jìn)一步評估了TME。5 種免疫細(xì)胞（即肥大細(xì)胞靜息狀態(tài)、CD4+ T 記憶細(xì)胞靜息狀態(tài)、樹突狀細(xì)胞靜息狀態(tài)、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和肥大細(xì)胞活化狀態(tài)的浸潤水平在C1 和C2 之間差異顯著。C1 具有較高的浸潤水平的CD4+ T 記憶細(xì)胞靜息狀態(tài)，樹突狀細(xì)胞靜息狀態(tài)、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，C2具有較高的浸潤水平的肥大細(xì)胞靜息和活化狀態(tài)（圖3A）。此外，基于ESTIMATE 算法，與C1 相比， C2 的免疫評分，基質(zhì)評分和ESTIMATE 評分更高。（圖3B）。評估C1 和C2 亞型患者對通常用于HCC 治療的五種化療藥物的敏感性。吉西他濱、多柔比星、博萊霉素、依托泊苷和米哚妥林的半抑制濃度在C2 中顯著較高，表明C2 對這些化療藥物的敏感性高于C1（圖3C）。此外，該研究使用 TIDE算法評估了C1 和 C2 中患者的免疫治療反應(yīng)。與化療敏感性一致，與C1 相比， C2 免疫治療反應(yīng)更好（圖3D）。

圖3 C1、C2 與TME 和ESTIMATE 分?jǐn)?shù)的相關(guān)性及化療敏感性和免疫治療反應(yīng)分析Fig 3 Correlation of C1 and C2 with TME and ESTIMATE scores and analysis of chemotherapy sensitivity and immunotherapy response

2.4 識別 C2 相關(guān)模塊

C2 亞型患者化療藥物的敏感性高于C1，免疫治療反應(yīng)更好，因此進(jìn)行了WGCNA 以確定與該亞型相關(guān)的預(yù)后基因。使用方差最高的前3 000 個(gè)基因構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，β=4，R2=0.9（圖4A）。將模塊特征基因進(jìn)行聚類，截止高度為 0.25，總共生成了10 個(gè)模塊（圖4B）。洋紅色模塊與C2 負(fù)相關(guān)最強(qiáng)（r=-0.34，P=0.000 4）（圖4C），因此被確定為進(jìn)一步分析的關(guān)鍵模塊。

圖4 識別 C2 相關(guān)模塊Fig 4 Identification of C2-associated module

2.5 預(yù)后模型的構(gòu)建

洋紅色模塊總共包含117 個(gè)基因。單變量Cox回歸分析確定36 個(gè)基因?yàn)镺S 相關(guān)基因。在這些基因中，GSDMC、AOC1、OTX1和CASC9被隨機(jī)森林生存分析確定為最重要的基因（圖5A）?；趯@4 個(gè)基因的LASSO 回歸分析構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)評分模型。分析顯示與C1 相比， C2 的風(fēng)險(xiǎn)評分較低（圖5B）。使用中位風(fēng)險(xiǎn)評分作為臨界值，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier 生存分析表明，與高風(fēng)險(xiǎn)組相比，低風(fēng)險(xiǎn)組具有更好的OS（圖5C）。使用桑葚圖可視化基于風(fēng)險(xiǎn)評分的兩個(gè)集群中患者的分布（圖5D）。

2.6 風(fēng)險(xiǎn)評分與TME、ESTIMATE 評分和免疫治療反應(yīng)的相關(guān)性

與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高危組肥大細(xì)胞靜息狀態(tài)和M2 巨噬細(xì)胞的比例更高（圖6A）。相反，低風(fēng)險(xiǎn)組的濾泡輔助性T 細(xì)胞比例升高。此外，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高危組的基質(zhì)評分和ESTIMATE 評分更高（圖6B）。高危組和低危組對五種化療藥物的敏感性無顯著差異（圖6C）。然而，與高危組相比，低風(fēng)險(xiǎn)組的患者表現(xiàn)出更高的免疫治療反應(yīng)（圖6D）。

圖6 風(fēng)險(xiǎn)評分與TME、ESTIMATE 評分和免疫治療反應(yīng)的相關(guān)性Fig 6 Correlation of risk score and TME， ESTIMATE score， and immunotherapy response

2.7 GSDMC 在HCC 細(xì)胞和組織中下調(diào)

通過隨機(jī)森林生存分析將GSDMC確定為最重要的基因，因此研究了GSDMC對肝細(xì)胞癌細(xì)胞和肝癌組織的影響。為探究GSDMC在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，選取正常肝細(xì)胞系LO2 和3 個(gè)肝癌細(xì)胞系Huh-7、SUN-449 和SMMC-7721 進(jìn) 行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與正常肝細(xì)胞相比，Huh-7、SUN-449 和SMMC-7721 種肝癌細(xì)胞系的GSDMC mRNA 表達(dá)水平顯著降低（圖7A）， 結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001 3；P=0.003 7；P=0.002 6）。還發(fā)現(xiàn)，在這3 個(gè)肝癌細(xì)胞系中，GSDMC在SMMC-7721 中的表達(dá)最高，在Huh-7 中的表達(dá)最低。因此，選擇了Huh-7 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后，對4對HCC 組織樣品進(jìn)行WB 以檢測GSDMC 的蛋白質(zhì)水平。與癌旁組織相比，GSDMC在癌組織中的表達(dá)較低（圖7B），在4 例肝癌組織及配對的癌旁組織中，GSDMC在肝癌組織和癌旁組織的表達(dá)中位數(shù)分別為0.340 9 和0.809 1，其蛋白水平表達(dá)在肝癌組織中低于癌旁組織，P=0.048 4（圖7C），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用免疫組化檢測GSDMC在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)（圖7D），結(jié)果顯示GSDMC在肝癌組織中下調(diào)。

圖7 GSDMC 在HCC 細(xì)胞和組織中下調(diào)性Fig 7 GSDMC was downregulated in HCC cells and tissues

2.8 過表達(dá)GSDMC 抑制HCC 細(xì)胞的干性

隨后，進(jìn)一步評估了GSDMC對肝癌細(xì)胞干性的影響。使用qRT-PCR 分析評估轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果表明GSDMC 成功轉(zhuǎn)染到Huh-7 細(xì)胞中（P=0.002）（圖8A）。采用細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)評估GSDMC是否影響HCC 的干性，結(jié)果表明，與對照細(xì)胞相比，GSDMC在Huh-7 細(xì)胞中的過表達(dá)顯著降低了球體形成（圖8B）。進(jìn)一步的定量分析表明，GSDMC減少了球體/每個(gè)視野的數(shù)量（P=0.029）（圖8C），表明GSDMC抑制HCC 細(xì)胞的干性。

圖8 過表達(dá)GSDMC 抑制HCC 細(xì)胞的干性Fig 8 Overexpression of GSDMC attenuates CSC traits of HCC cells

3 討論

本研究對大規(guī)模肝細(xì)胞癌患者群體進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，旨在揭示與CSC 相關(guān)的26個(gè)基因集的分子特征，研究CSC 亞型相關(guān)的基因表達(dá)模式可能有助于患者的特異性療法。此外，通過隨機(jī)森林生存分析確定GSDMC是最重要的一個(gè)預(yù)后基因。后經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GSDMC在HCC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)降低，GSDMC抑制HCC 細(xì)胞的干性。

利用26 個(gè)干細(xì)胞基因集的ssGSEA 評分，進(jìn)行無監(jiān)督聚類以區(qū)分兩種的干細(xì)胞亞型。C2 亞型26個(gè)干性基因集的富集得分低，生存期更長，預(yù)后更好，肥大細(xì)胞浸潤更顯著，對免疫療法反應(yīng)率更高。C2 的生存結(jié)局明顯優(yōu)于C1。為探究化療和免疫治療對HCC 的聯(lián)合治療是否有更好的療效，以便進(jìn)一步研究。本研究分析了各種藥物對C1 和C2 患者的影響。結(jié)果表明，吉西他濱、多柔比星、博來霉素、依托泊苷和米哚妥林的IC50在C2 中顯著更高，表明與C1 相比，C2 患者對這些化療藥物更敏感。這意味著進(jìn)一步的研究可以集中在HCC 患者的聯(lián)合治療上。因此，隨后進(jìn)行了WGCNA 以確定與C2 亞型的關(guān)鍵模塊和基因。從該分析中，洋紅色模塊成為關(guān)鍵模塊，由117 個(gè)候選關(guān)鍵基因組成。然后進(jìn)行單變量Cox 和隨機(jī)森林生存分析，以搜索洋紅色模塊內(nèi)的預(yù)后基因，最后鑒定出具有預(yù)后相關(guān)性的4 個(gè)基因（GSDMC，AOC1，OTX1，CASC9）。

根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評分，肝癌患者隨后被分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組。高危組肥大細(xì)胞靜息狀態(tài)和M2 巨噬細(xì)胞的比例較高，而低危組的濾泡輔助性T 細(xì)胞水平升高。M2 巨噬細(xì)胞，在大多數(shù)實(shí)體惡性腫瘤中被稱為腫瘤浸潤細(xì)胞，在增殖、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用［24］。濾泡輔助性T 細(xì)胞來源或 B 細(xì)胞相關(guān)惡性腫瘤中濾泡輔助性T 細(xì)胞數(shù)量的增加通常與不良預(yù)后有關(guān)，而在各種非淋巴細(xì)胞來源的實(shí)體器官腫瘤類型中，它預(yù)示更好的預(yù)后［25］。關(guān)于本研究中確定的四個(gè)干性模型基因，GSDMC上調(diào)與結(jié)直腸癌，乳腺癌和黑色素瘤的不良臨床結(jié)果有關(guān)［26-28］。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GSDMC表達(dá)在幾種食管鱗狀細(xì)胞癌病例中受到抑制，這表明其作為腫瘤抑制基因的作用［29］。在本研究中，GSDMC在HCC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)降低。球體形成實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR 表明GSDMC抑制HCC 干細(xì)胞表型。

本研究有局限性。首先，研究中的數(shù)據(jù)是從公共數(shù)據(jù)庫而不是本研究數(shù)據(jù)中獲取。其次，基于生物信息學(xué)鑒定了與HCC 干性相關(guān)的模型基因，需要進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)來研究其作為靶標(biāo)的能力，以提高免疫治療和化療療效。

作者貢獻(xiàn)度說明：

包凌：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)執(zhí)行、數(shù)據(jù)庫檢索和論文撰寫；龔旋坤：參與部分?jǐn)?shù)據(jù)庫檢索及部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)；陳曉：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文撰寫指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。