嚴(yán)其康，扈清云，孫 權(quán)，王彩霞，朱金玲

（1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154007）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，是顱內(nèi)腫瘤中最常見(jiàn)和最致命的類(lèi)型，生長(zhǎng)迅速，具有極強(qiáng)的侵襲性，病人預(yù)后差。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究和對(duì)其治療手段的探索一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。Na/K-ATP酶 由 催 化 亞 基α（100～112 kDa），調(diào) 節(jié)β（45～55 kDa）亞基和γ（FXYD2）（6.5～10 kDa）亞基組成［1］。已經(jīng)鑒定出β 亞基的3 種不同的同種型：β1（ATP1B1基因），β2（ATP1B2基因）和β3（ATP1B3基因）［2］。3 種β 亞基在細(xì)胞中的分布具有組織特異性。已有文獻(xiàn)說(shuō)明，Na/K-ATP 酶β 亞基參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附功能，特別是在癌癥進(jìn)展期間［3-6］。實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)CASPR1-ATP1B3 蛋白相互作用影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Na/K-ATP 酶的質(zhì)膜定位，但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中研究極少［7］。 并且有研究表明，ATP1B3基因在胃癌、肝癌中存在高表達(dá)，影響其發(fā)生發(fā)展，而在膠質(zhì)瘤中未見(jiàn)研究，因此本研究選Na/K-ATP 酶的核心蛋白ATP1B3 作為靶分子研究其在不同組織級(jí)別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討ATP1B3基因表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤患者總體生存率的影響及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移的影響。為尋找神經(jīng)腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物和治療的分子靶點(diǎn)提供試驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料來(lái)源

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（U87MG）及MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DAB 顯色液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自中國(guó)Takara 公司，單克隆ATP1B3 抗體（67554-1-lg）及GAPDH 抗體（60004-1-lg）購(gòu)自中國(guó)proteintech 公司，干擾RNA 購(gòu)自中國(guó)吉瑪基因公司。2 級(jí)、3 級(jí)、4 級(jí)膠質(zhì)瘤組織切片來(lái)自于佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院。1 級(jí)通常為低級(jí)-例如毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤；2 級(jí)為低度惡性腫瘤，如星形膠質(zhì)瘤或少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤浸潤(rùn)；3 級(jí)包括間變性星形細(xì)胞瘤，間變性室管膜瘤，間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和間變性少星形膠質(zhì)瘤；4 級(jí)通常為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM） 具有內(nèi)皮細(xì)胞增殖或腫瘤壞死。

1.2 方法

1.2.1 在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析ATP1B3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，及其與患者生存預(yù)后的關(guān)系 下載TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中膠質(zhì)瘤患者的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)數(shù)據(jù)集、臨床數(shù)據(jù)集并進(jìn)行整理。然后使用CGGA（http：//www.cgga.org.cn/）數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析ATP1B3在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，進(jìn)入官網(wǎng)，首頁(yè)選擇“Analyze”；點(diǎn)擊mRNA data；在 Distribution 處“gene”框 輸 入“ATP1B3”；點(diǎn)擊submit。對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過(guò)ATP1B3表達(dá)水平中位值將膠質(zhì)瘤患者分為兩組，分別為高表達(dá)ATP1B3組和低表達(dá)ATP1B3組。采用R 包"survival" "survminer"分析ATP1B3基因表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者生存率的關(guān)系，包括患者總生存期（overall Survival， OS），無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival， PFS）， ROC（receiver operating characteristic curve， ROC）生存分析。比較分析ATP1B3表達(dá)水平與癌癥患者臨床特征的相關(guān)性，包括分級(jí)、年齡和性別等。

1.2.2 免疫組化染色驗(yàn)證ATP1B3在膠質(zhì)瘤組織切片中的表達(dá) 對(duì)2 級(jí)、3 級(jí)、4 級(jí)膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行IHC 染色。常規(guī)石蠟切片后60 ℃烤片15 min，進(jìn)行二甲苯脫蠟與梯度酒精脫水，PBS 緩沖液沖洗，pH值8.0～8.5 的EDTA 抗原修復(fù)液100 ℃抗原修復(fù)，PBS 緩沖液沖洗，37 ℃過(guò)氧化氫甲醇消化內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS 緩沖液沖洗，加入5%BSA 封閉液封閉。滴加ATP1B3 抗體（1∶300）4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，PBS 緩沖液沖洗，羊抗鼠IgG 聚合物滴定及DAB 顯色，蘇木素染液襯染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后在顯微鏡下觀察。

1.2.3 體外細(xì)胞培養(yǎng) 將在MEM 完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清和1%雙抗）中的U87MG 細(xì)胞，放入6 孔板中培養(yǎng)，6 孔板置于5%CO2的恒溫37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 干擾RNA 序列由吉瑪基因公司設(shè)計(jì)，ATP1B3-Homo-336 序列為，S： CAUUCACGAUGUGGGUUAUTT AS： AUAACCCACAUCGUGAAUGTT；ATP1B3-Homo-530 序列為S：GAAGAACAGAAGAACCUCATT AS：UGAGGUUCUUCUGUUCUUCTT ；ATP1B3- Homo -976 序 列 為 S：GGGACGAGUUAUGUUCAAA TT AS：UUUGAACAUAACUCGUCCCTT；陰性對(duì) 照siRNA 序 列 為S：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT AS：ACGUGACACGUUCGGAGAATT；將培養(yǎng)細(xì)胞分為5 組，即空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（SI-NC）、si-ATP1B3-336 組、si-ATP1B3-530組、si-ATP1B3-976 組，當(dāng)6 孔板中細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)，配制轉(zhuǎn)染體系，加入125 μL OPTIMEM、100pmol si-RNA（陰性對(duì)照組加入陰性對(duì)照siRNA、si-ATP1B3-336 組 加 入ATP1B3-Homo-336、si-ATP1B3-530 組加入ATP1B3-Homo-530、si-ATP1B3-976 組加入ATP1B3-Homo-976）、4 μL Lipo-8000，混勻，室溫下靜置20 min?；旌虾蟮捏w系以點(diǎn)滴的方式將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入含有U87MG 細(xì)胞的6 孔板中，輕輕搖勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后以備用于RT-PCR 檢測(cè)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后以備Western blot 檢測(cè)。篩選敲減效率高的siRNA 以被后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 熒光定量PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞ATP1B3基因的mRNA 表達(dá)水平 用RNA 抽提試劑盒提取轉(zhuǎn)染后U87MG細(xì)胞中總mRNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試 劑 盒 進(jìn) 行RT-PCR 擴(kuò) 增，ATP1B3-S：ACGATGTGGGTTATGCTTCAGACTC；ATP1B3-AS：CCTGCATACGAAGTTGGATCAGACC；內(nèi)參GAPDH 序列為S：UGACCUCAACUACAUGGUUTT；AS：AACCAUGUAGUUGAGGUCATT。7300 檢測(cè)結(jié)果，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞ATP1B3基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（內(nèi)參為GAPDH）。

1.2.6 Western blotting 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ATP1B3 蛋白及相關(guān)通路蛋白MTOR、P-MTOR 表達(dá)量 收集轉(zhuǎn)染后U87MG 細(xì)胞，蛋白裂解液提取總蛋白，通過(guò)BCA 法測(cè)定提取蛋白質(zhì)的濃度。取50 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE（12%）電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，將膜置于相應(yīng)的ATP1B3鼠單克隆抗體（1∶1 500）、GAPDH 鼠 單 克 隆 抗 體（1∶10 000）中4 ℃過(guò) 夜，MTOR、P-MTOR（1∶1 500），TBS-T 洗去未結(jié)合的一抗，洗滌3 次，每次10 min。再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 37 ℃孵育1 h。TBS-T洗去未結(jié)合的二抗，洗滌3 次，每次10 min。利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，ImageJ 進(jìn)行分析。

1.2.7 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)照組及si-ATP1B3-336 組細(xì)胞接種于96 孔板（3×103個(gè)/孔），每組5 個(gè)復(fù)孔，每孔加入10 μL CCK-8 溶液（按試劑說(shuō)明書(shū)操作），于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的光密度值（OD 值）。在0、24、48 和72 h 連續(xù)記錄各個(gè)孔的數(shù)值。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深，OD 值越大。

1.2.8 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 收集對(duì)照組、si-ATP1B3-336 組細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的MEM 培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液（5×104個(gè)/mL），取200 μL 細(xì)胞懸液接種于transwell 上室，下室加入600 μL 含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，將小室放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，倒置顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞遷移結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的數(shù)據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果均通過(guò)R4.2.2 程序計(jì)算所得，CGGA 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析結(jié)果有網(wǎng)站內(nèi)部程序自動(dòng)生成。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果采用GraphPad Prism9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在線數(shù)據(jù)獲取和分析結(jié)果

從TCGA 數(shù)據(jù)中獲得神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本共704個(gè)，并對(duì)ATP1B3高、低表達(dá)兩組進(jìn)行獨(dú)立性檢驗(yàn)。CGGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析膠質(zhì)瘤患者癌組織中ATP1B3mRNA 的表達(dá)水平，隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別（2，3，4 級(jí)）的升高，ATP1B3的表達(dá)水平顯著升高，（P＜0.001）（圖1A）。通過(guò)R 軟件進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示：ATP1B3在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)水平與年齡和病理分級(jí)有關(guān)，差異有顯著性（P＜0.001）（圖2A、C），ATP1B3表達(dá)水平與性別無(wú)關(guān)（P＞0.05）（圖2B）。使用R 語(yǔ)言包計(jì)算ATP1B3表達(dá)水平對(duì)膠質(zhì)瘤患者總體生存率的影響，繪制生存曲線圖，ATP1B3低表達(dá)組生存率明顯高于ATP1B3高表達(dá)組（P＜0.001）（圖3）。

圖1 ATP1B3 在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)Fig 1 ATP1B3 expression in different grades of gliomas

圖2 ATP1B3 表達(dá)水平與臨床特征相關(guān)分析Fig 2 Correlation analysis between ATP1B3 expression level and clinical characteristics

圖3 ATP1B3 表達(dá)水平與患者生存率Fig 3 ATP1B3 expression level and patient survival rate

2.2 免疫組化檢測(cè)ATP1B3 在膠質(zhì)瘤組織切片中的表達(dá)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，2、3、4 級(jí)別膠質(zhì)瘤組織切片分別呈現(xiàn)淡黃色、黃褐色、棕色，印證了數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果（圖1B）。染色強(qiáng)度評(píng)分具體為-（無(wú)染色），+（弱染色為淡黃色），++（中等染色為黃褐色），+++（強(qiáng)染色為棕色）。

2.3 SI-ATP1B3-336 干擾效果明顯

敲減ATP1B3基因表達(dá)，RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，SI-ATP1B3-336 組mRNA 水平顯著降低（F=17.45，P＜0.01）（圖4A），western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明si-ATP1B3-336 組中ATP1B3的敲減效果（F=30.84，P＜0.000 1）（圖4B），因此將該干擾序列用于后續(xù)研究。

圖4 干擾RNA（ si-RNA）篩選Fig 4 Interfering RNA （Si-RNA） screening

2.4 敲減ATP1B3 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移的影響

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-ATP1B3-336組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少（t=6.254，P＜0.01）細(xì)胞遷移能力減弱（圖5A）。CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-ATP1B3-336 組細(xì)胞的增殖能力顯著低于對(duì)照組（t=9.812，P＜0.001）（圖5B）。

圖5 敲減ATP1B3 后 U87MG 細(xì)胞增殖、遷移能力Fig 5 Proliferation and migration ability of U87MG cells after knockdown of ATP1B3

2.5 敲減ATP1B3 對(duì)MTOR 信號(hào)通路蛋白的影響

與對(duì)照組相比敲減ATP1B3后，P-MTOR 蛋白表達(dá)量顯著下降（t=3.909，P＜0.05），P-MTOR/MTOR 比值顯著降低（t=3.132，P＜0.05）（圖6），表明ATP1B3可能通過(guò)影響細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路從而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

圖6 MTOR、P-MTOR 蛋白表達(dá)水平Fig 6 MTOR，P-MTOR protein expression levels

3 討 論

2021 年出版了第五版中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)（WHO-CNS5）。WHO-CNS5 將基因、分子及信號(hào)通路改變等特征納入分類(lèi)系統(tǒng)，并結(jié)合病理組織學(xué)特征、免疫組化等方法進(jìn)行整合和分層診斷［8，9］。根據(jù)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞特征，在顯微鏡下觀察術(shù)中或術(shù)后膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)。不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤治療方式有所不同，預(yù)后和生存情況也大不同。對(duì)于低級(jí)別膠質(zhì)瘤采用的是手術(shù)為主的治療。對(duì)于高級(jí)別膠質(zhì)瘤，無(wú)論術(shù)后是否達(dá)到了全切都必須進(jìn)行放療、化療等后續(xù)的輔助治療。多形性惡性膠質(zhì)瘤惡性程度高，GBM 最明顯的特征之一就是細(xì)胞增殖失控［10］，研究發(fā)現(xiàn)GBM 呈現(xiàn)表觀遺傳學(xué)和遺傳不同亞群的多態(tài)性特點(diǎn)，會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生和發(fā)展具有不同的機(jī)制，并導(dǎo)致治療的失?。?1］。目前越來(lái)越多的證據(jù)表明，在不同或同一細(xì)胞類(lèi)型中，相同的配體可能有不同的受體，進(jìn)而誘導(dǎo)不同的反應(yīng)［12］。動(dòng)物細(xì)胞中質(zhì)膜的嵌入蛋白，又稱(chēng)Na-K泵，通過(guò)水解ATP 轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)外的鈉鉀離子，維持細(xì)胞的電化學(xué)梯度［13］，并維持離子濃度的平衡。研究表明Na/K-ATP 酶是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子［14-17］，影響細(xì)胞增殖［18］，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［19］和細(xì)胞凋亡［20］。最近的綜述描述了Na/K-ATP 酶參與細(xì)胞增殖和肥大，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞粘附，細(xì)胞遷移，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和鈉泵結(jié)合藥物的相關(guān)分子基礎(chǔ)［21］。

最近有研究指出膠質(zhì)瘤在侵入腦實(shí)質(zhì)時(shí)，利用離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體維持它們的單一生長(zhǎng)和侵襲［22，23］，其中包括Na/K-ATP 酶，但其具體機(jī)制不詳。Li 等［24］研究表明，ATP1B3在胃癌細(xì)胞系中的mRNA 和蛋白質(zhì)水平均升高，并通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的進(jìn)展，敲減ATP1B3顯著抑制了人胃癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖、集落形成能力、遷移和侵襲能力以及增加細(xì)胞凋亡。Lu 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，ATP1B3在肝癌組織中高表達(dá)，敲減ATP1B3抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究結(jié)果顯示敲減U87MG 細(xì)胞中的ATP1B3后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力顯著下降。ATP1B3表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而升高，ATP1B3高表達(dá)不利于患者的生存、預(yù)后，下調(diào)ATP1B3減少了P-MTOR 的表達(dá)，推測(cè)其可能是通過(guò)影響MTOR 信號(hào)通路從而影響U87MG 細(xì)胞增殖、遷移。綜上所述，ATP1B3可能作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

嚴(yán)其康：課題的構(gòu)思與實(shí)驗(yàn)，撰寫(xiě)文章；扈清云、孫權(quán)、王彩霞： 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理，分析；朱金玲：論文指導(dǎo)與修改，經(jīng)費(fèi)支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。