陳坤林 李祥 何思思 康芳芳 胡宇軒 史靜怡 沈勇根

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.03.004

引文格式：陳坤林，李祥，何思思，等.響應面法優(yōu)化芡實粉復合酶酶解工藝及多糖抗氧化性研究[J].中國調味品，2024，49（3）：20-27.

CHEN K L， LI X， HE S S， et al.Optimization of compound enzymatic hydrolysis process of Euryale ferox powder by response surface methodology and study on antioxidant activity of polysaccharides[J].China Condiment，2024，49（3）：20-27.

摘要：為確定復合酶法酶解芡實粉的最佳工藝及芡實多糖的抗氧化活性，以優(yōu)質產地的芡實粉為原料，通過單因素試驗、Box-Behnken試驗設計及響應面分析研究復合酶添加量、pH、酶解溫度、酶解時間對水解程度（dextrose equivalent，DE值）的影響；并通過測定酶解后芡實多糖對DPPH自由基的清除能力評價其抗氧化活性。結果表明，復合酶法酶解芡實粉的最佳工藝參數為復合酶（普魯蘭酶∶α-淀粉酶）的質量比5∶6、酶添加量0.3%（以原料質量為基準）、pH 6.5、酶解溫度56 ℃、酶解時間45 min。該條件下生產的芡實粉基料水解度可達20.25%，且酶解后芡實多糖具有一定的抗氧化活性。該研究結果為芡實相關產品的開發(fā)利用提供了理論依據及方法基礎。

關鍵詞：芡實粉；復合酶酶解；響應面法；酶解工藝；抗氧化性；DE值

中圖分類號：TS210.1????? 文獻標志碼：A????? 文章編號：1000-9973（2024）03-0020-08

Optimization of Compound Enzymatic Hydrolysis Process of Euryale ferox

Powder by Response Surface Methodology and Study on Antioxidant

Activity of Polysaccharides

CHEN Kun-lin1，2， LI Xiang1， HE Si-si1， KANG Fang-fang1，

HU Yu-xuan1， SHI Jing-yi1， SHEN Yong-gen1*

（1.School of Food Science and Engineering， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China;

2.Seed Service Center， Agriculture and Rural Bureau of Nanjing County， Zhangzhou City，

Zhangzhou 363600， China）

Abstract： To determine the optimal compound enzymatic hydrolysis process of Euryale ferox powder and the antioxidant activity of Euryale ferox polysaccharides， with Euryale ferox powder from high-quality places of origin as the raw material， the effects of the addition amount of compound enzymes， pH， enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on the hydrolysis degree （dextrose equivalent， DE value） are studied through single factor test， Box-Behnken test design and response surface analysis. After enzymatic hydrolysis， the antioxidant activity of Euryale ferox polysaccharides is evaluated by measuring their DPPH free radical scavenging capacity. The results show? that the optimal process parameters for enzymatic hydrolysis of Euryale ferox powder using compound enzymes method are as follows： the mass ratio of compound enzymes （pullulanase∶α-amylase） is 5∶6， the addition amount of enzymes is 0.3% （based on the mass of raw materials）， pH is 6.5， enzymatic hydrolysis

收稿日期：2023-09-04

基金項目：江西省研究生創(chuàng)新專項資金項目（YC2021-S369）；芡實相關地方標準的起草（2021JXAUHX08）；江西主栽食用菌貯藏保鮮及加工技術研究（JXXTCX2018-03-04）

作者簡介：陳坤林（1999—），男，碩士，研究方向：果蔬貯藏與加工。

*通信作者：沈勇根（1971—），男，教授，碩士，研究方向：果蔬貯藏與加工。

temperature is 56 ℃ and enzymatic hydrolysis time is 45 min. Under these conditions， the hydrolysis degree of Euryale ferox powder basic material can reach 20.25%， and after enzymatic hydrolysis， Euryale ferox polysaccharides have certain antioxidant activity. The research results have provided theoretical and methodological basis for the development and utilization of products related to Euryale ferox.

Key words： Euryale ferox powder; compound enzymatic hydrolysis; response surface methodology; enzymatic hydrolysis process; antioxidant activity; DE value

芡實（Euryale ferox）俗稱雞頭米、雞頭子，為睡蓮科（Nymphaeaceae）芡屬（Euryale Salisb.ex DC.）水生草本植物，在植物學上被稱為歐洲黑麥草、狐貍堅果[1-3]。芡實含大量淀粉、多糖、脂肪油及鈣、磷、鐵、核黃素、維生素C等，氨基酸種類齊全[4-5]。芡實粉具有降低體內自由基數量和細胞分裂時染色體損傷的作用，能夠防止氧化損傷，從而延長細胞壽命，具有抗衰老、抗氧化、抗疲勞等功效[6-8]。芡實粉還具有改善食品品質的作用，如在面包中加入芡實粉可以減少面包中快消化淀粉（RDS）含量，提升慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）含量，有利于維持血糖的穩(wěn)定，適合糖尿病患者、肥胖癥患者和中老年人等特殊人群食用[9]。

在21世紀初期，我國芡實種植面積約為10 000 hm2，平均每公頃干芡米產量為330～350 kg。近年來，隨著芡實品種的引進和不斷改良，我國芡實的栽培面積和產量逐步上升[10]。目前國內芡實粉加工技術基本采用普通粉碎技術結合其他生產工藝生產干制品和初加工產品，而深加工產品較少，產品的附加值較低，嚴重限制了芡實的大規(guī)模生產加工[11]。并且由于芡實中特殊的淀粉結構，初加工后的芡實粉沖調性能不佳，出現分層、結塊現象，食用后不易消化[12]；高溫高壓的加工過程會破環(huán)芡實粉自身的營養(yǎng)成分，極大地限制了芡實產品的發(fā)展。因此，通過適宜的處理方式改善芡實粉的品質和性能尤為重要。同時，目前國內對于芡實多糖的研究大多集中在提取方法及其抗氧化性，但對于加工處理后芡實的抗氧化性鮮有報道。

本研究選擇江西余干優(yōu)質芡實粉為原料，使用α-淀粉酶和普魯蘭酶雙酶法對芡實粉進行水解，在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken試驗設計及響應面法對芡實粉的酶解工藝進行優(yōu)化，并測定芡實多糖的抗氧化活性。本研究旨在改善芡實粉的品質，增強芡實粉單位體積的能量，并通過試驗驗證，經過酶解后的芡實多糖具有抗氧化活性，從而實現對芡實的綜合開發(fā)利用。

1? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

芡實：由江西明湖農業(yè)發(fā)展有限公司提供；α-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、普魯蘭酶：南寧龐博生物工程有限公司；葡聚糖苷酶：邢臺萬達生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：合肥千盛生物科技有限公司；甲醛、乙醇、氫氧化鈉、氯化氫：均為國產分析純。

Q500B高速粉碎機? 永康市鉑歐五金制品有限公司；GL-20A型冷凍高速離心機? 上海市菲恰爾分析儀器有限公司；101-1BS電熱鼓風干燥機? 上海一恒科學儀器有限公司；JYC-1102C立式單開門恒溫搖床? 上海錦玟儀器設備有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋? 深圳市國華電器有限公司；BS210S電子分析天平? 上海浦春計量儀器有限公司；SHP-250型智能生物培養(yǎng)箱? 上海鴻都電子科技有限公司；WFJ-2100型可見分光光度計? 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 芡實粉制備和酶解工藝

具體工藝流程：優(yōu)質芡實（干品）→挑選→反復清洗去雜質→蒸煮（150 ℃，30 min）→勻漿處理→按料液比1∶10（g/mL）加水→添加復合酶酶解、調節(jié)pH→置于智能生化培養(yǎng)箱中充分酶解（調控溫度、時間）→沸水浴滅酶15 min→烘箱干燥（75 ℃，6 h）→粉碎過篩（80目）→芡實粉基料。

1.2.2? 水解度的測定

DE值也稱為葡萄糖值，代表糖化液中還原糖（以葡萄糖計算）占干物質的百分比，工業(yè)上表示為淀粉的水解程度或糖化程度[13]。 DE值越高，則淀粉的水解程度越完全，糖漿質量也越高[14]。本試驗采用DNS法測定還原糖含量，準確稱取1.0 g樣品稀釋50倍，使樣品中的還原糖濃度為0.1～1.0 mg/mL。取1 mL稀釋溶液于25 mL試管中，加入1.5 mL二硝基水楊酸試劑，在540 nm波長處測得吸光度A，參照標準曲線中還原糖含量，求得DE值（X）[15]，公式如下：

X=m1×V×NVS×m×1 000×100%。

式中：m1為從標準曲線查得的葡萄糖質量，mg；V為樣品提取液的總體積，mL;N為樣品提取液的稀釋倍數；VS為測定時所取樣品提取液的體積，mL;m為樣品的質量，g；1 000為換算系數。

1.2.3? 不同種類酶對芡實水解度的影響

基于盧美娟等[16]的試驗研究以及實際生產用酶，選取α-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、普魯蘭酶和葡聚糖苷酶5種酶，在酶添加量0.3%、酶解溫度55 ℃、酶解時間50 min、pH 6的條件下，測定其水解后的DE值，從中篩選出2種最適的酶，進行下一步復合酶質量比的確定。

1.2.4? 復合酶質量比對芡實水解度的影響

在酶添加量0.3%、酶解溫度55 ℃、酶解時間50 min、pH 6的條件下，測定在不同復合酶的質量比下水解后的DE值，其中芡實與水的比例為1∶10（g/mL），篩選出最優(yōu)的復合酶質量比。

1.2.5? 酶解芡實粉生產工藝優(yōu)化單因素試驗

以芡實粉的DE值為指標，固定酶解溫度為55 ℃、酶解時間為50 min、pH為6，分析酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對芡實粉水解度的影響；固定酶添加量為0.3%、酶解時間為50 min、pH為6，分析酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃）對芡實粉水解度的影響；固定酶添加量為0.3%、酶解溫度為55 ℃、pH為6，分析酶解時間（30，40，50，60，70 min）對芡實粉水解度的影響；固定酶添加量為0.3%、酶解溫度為55 ℃、酶解時間為50 min，分析pH（4，5，6，7，8）對芡實粉水解度的影響。

1.2.6? 響應面法優(yōu)化酶解芡實粉生產工藝

通過Box-Behnken試驗設計確定最佳芡實粉復合酶酶解工藝參數。以單因素試驗為基礎，以酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）、pH（D）為影響因素，以DE值為響應值，設計四因素三水平響應面試驗，見表1。

1.2.7? DPPH自由基清除率的測定

當芡實與水的比例為1∶10 （g/mL）、復合酶（普魯蘭酶∶α-淀粉酶）的質量比為5∶6時，以原料質量為基準，設置酶添加量為0.3%、pH為6.5、酶解溫度為56 ℃，酶解45 min后提取酶解液，并將酶解液中提取的多糖[17]配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的芡實多糖溶液，分別先加入0.1 mL芡實酶解液，再加入3.9 mL 0.04 mmol/L的DPPH-乙醇溶液。充分混合后在37 ℃下水浴加熱并且在避光條件下存放1 h。最后測定每個樣品在517 nm波長處的吸光度，平行測定3次。

DPPH自由基清除率（%）=1-AiA0×100%。

式中：Ai為測定樣品管的吸光度；A0為以乙醇作為空白對照管的吸光度。

1.3? 數據處理

使用Design Expert 11.0進行Box-Behnken試驗設計和響應面試驗數據的優(yōu)化，使用SPSS 20.0進行數據分析，整理分析后通過Origin 2019進行圖形的繪制。

2? 結果與分析

2.1? 不同種類酶對芡實水解度的影響

注：不同小寫字母表示有顯著性差異（P<0.05），下圖同。

由圖1可知，α-淀粉酶和普魯蘭酶對芡實DE值的影響程度比纖維素酶、果膠酶和葡聚糖苷酶高，芡實淀粉分子結構中，直鏈淀粉和支鏈淀粉的質量分數分別為18.37%～23.06%和37.66%～48.30%，支鏈淀粉與直鏈淀粉的比值為1.63～2.55[18]。普魯蘭酶作用于支鏈分子的α-1，6糖苷鍵，酶解后產支鏈淀粉的分支數顯著降低，同時產生大量的短直鏈分子[19-20];α-淀粉酶可以從淀粉分子內部切開α-1，4糖苷鍵，生成糊精和還原糖[21]。普魯蘭酶與α-淀粉酶對芡實粉的酶解效果明顯，酶解后的DE值比其他酶類酶解的DE值高。因此選取α-淀粉酶和普魯蘭酶進行復合配比，研究復合酶對芡實DE值的影響。

2.2? 不同復合酶質量比對芡實水解度的影響

在復合酶適宜的條件下酶解植物淀粉底物，植物淀粉被復合酶通過各自的作用機制酶解[22]。由圖2可知，隨著普魯蘭酶比例的下降及α-淀粉酶比例的上升，復合酶對芡實的酶解效果呈現先上升后下降的趨勢。其中，復合酶質量比達到5∶6時，復合酶對芡實酶解效果的影響最大，DE值達到16.62%；當超過這一比例時，DE值開始呈現下降趨勢。這可能是因為當普魯蘭酶含量過多時，普魯蘭酶的各亞位點區(qū)域關鍵的底物結合位點分別與α-淀粉酶的相對應酶切結合點相結合，從而阻礙酶與底物分子的結合[23]，抑制α-淀粉酶的活性，導致芡實短直鏈分子釋放減少，DE值降低；當α-淀粉酶含量增多時，會抑制普魯蘭酶的活性，從而影響酶解效率，使得DE值降低。因此，當普魯蘭酶與α-淀粉酶的比例達到5∶6時，能得到較好的酶解效果。

2.3? 酶解芡實粉生產工藝優(yōu)化單因素試驗

2.3.1? 酶添加量對DE值的影響

由圖3可知，隨著酶添加量的增加，DE值呈現先上升后下降的趨勢，當酶添加量達到0.3%時，DE值為19.04%，此后再增大酶添加量，DE值呈緩慢下降的趨勢。這是因為在底物一定的條件下，增加酶的使用量可以有效提高反應速率。而當底物不斷被酶分解后，底物濃度降低，酶解速率增長較慢[24]。當達到某一個平衡點時，酶的濃度達到飽和狀態(tài)，反應速率達到平衡狀態(tài)，此時DE值處于較高水平。李楊等[25]研究復合酶水解玉米粉工藝優(yōu)化時，發(fā)現隨著酶用量的增加，DE值先上升后下降，與本試驗結果基本相同。因此，酶的最適添加量為0.3%。

2.3.2? 酶解溫度對DE值的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，DE值變化明顯。當酶解溫度為30～50 ℃時，DE值隨著溫度的升高而增大，在50 ℃時達到最大，為16.38%。當酶解溫度超過50 ℃后，隨著溫度的繼續(xù)升高，DE值明顯下降。原因在于溫度能明顯影響酶的活性和酶解效率，最適溫度范圍決定了酶的活性形式和可逆失活形式之間的平衡，在最適溫度范圍內，逐漸升高溫度，反應能量增加，單位時間內的有效碰撞數增加，反應速度加快[26-27]。且酶的本質是蛋白質，當溫度過高或者過低時，酶活性降低或失活且酶的結構性質發(fā)生改變，反應速率降低，酶解不充分。因此，當酶解溫度處于50 ℃左右時，能夠有效提高復合酶的酶解效率。丁霄霄等[28]在利用復合酶提取靈芝多糖時，發(fā)現在30～50 ℃的酶解溫度下，多糖的提取率逐漸上升，而高于50 ℃時多糖的提取率下降，分析可能是溫度過高導致酶變性并失活，與本試驗結果相似。綜上，選擇酶解溫度為50 ℃較適宜。

2.3.3? 酶解時間對DE值的影響

由圖5可知，隨著酶解時間的增加，DE值出現明顯的上升趨勢，當酶解時間達到50 min時，DE值達到最大值，為15.53%，此時為反應初期，增加酶解時間能夠促進酶與底物充分反應；但此后再延長酶解時間，反而使得DE值下降?？赡苁怯捎诋敺磻_到最大時，酶解底物消耗充分并且一部分酶的活性逐漸降低，反應產物對酶活性有一定的抑制作用，這也說明酶解時間越長，復合酶酶解底物的效率不一定越高。裴若楠等[29]通過響應面試驗，在利用復合酶對石花菜粗多糖提取工藝優(yōu)化的單因素試驗中發(fā)現：在采用復合酶酶解石花菜的前120 min，多糖提取率逐漸增加，但當酶解時間延長至120 min后，多糖提取率不升反降，推測可能是在酶解120 min時多糖得到最大程度的溶出，而酶解時間過長，底物充分消耗且酶活性下降，致使多糖提取率下降。因此，選擇酶解時間為50 min較適宜。

2.3.4? 酶解pH對DE值的影響

由圖6可知，隨著pH的增大，DE值呈先上升后下降的趨勢，當pH達到6時，DE值達16.21%，此后再增大pH值，DE值大幅度降低。普魯蘭酶和α-淀粉酶屬于溫和酶類，當pH過低或過高時，等電點偏離，影響復合酶的酶活性和底物的空間結構，從而影響DE值[30]。蔣德旗等[31]通過響應面法進行金果欖多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究時，發(fā)現當pH為3～5時，金果欖多糖得率逐漸升高，當pH高于5時，金果欖多糖得率逐漸降低，分析原因可能是pH值過高或過低會影響酶活性，與本試驗結果相似。綜上，選擇酶解pH為6較適宜。

2.4? Box-Behnken試驗設計結果

根據單因素試驗結果，以芡實酶解后的DE值作為響應值[32]，考察酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）、pH（D）4個因素對水解程度DE值（Y）的影響，得出最優(yōu)的試驗方案。Box-Behnken試驗方案與結果見表2，方差分析結果見表3。

運用響應面軟件對試驗結果進行分析，經回歸擬合分析，得到芡實酶解DE值回歸方程：Y=21.79＋0.28A＋1.42B＋0.46C－1.95D＋0.31AB＋1.97AC＋0.42AD－0.33BC－0.55BD－2.04CD－2.61A2－1.90B2－4.82C2－1.83D2。

由表3可知，二次多項回歸模型的P<0.01，結果顯著，失擬項的P=0.089 4>0.05，結果不顯著，表明試驗結果與模型結果差異性小，擬合度高。回歸模型的R2=0.986 0，RAdj2=0.972 1，說明模型的擬合程度優(yōu)良，預測值與試驗值高度相關。殘差是由隨機誤差引起的，故可以用該模型進行理論分析和預測。一次項B、D，二次項A2、B2、C2、D2，交互項 AC、BD、CD影響極顯著（P<0.01），一次項C、交互項 AD影響顯著（P<0.05），一次項A，交互項 AB、BC影響不顯著。由此可得出，影響DE值的因素主次順序為pH>酶解溫度>酶解時間>酶添加量。

2.5? 各因素交互作用和響應面分析

由Design-Expert 12.0軟件對試驗結果進行響應面圖的繪制，通過3D響應面圖能較直觀地反映出各因素之間的交互作用對復合酶酶解芡實粉DE值的影響。響應面和等高線分析結果見圖7。

響應曲面越陡峭，顏色越深，表明該因素對酶解后DE值的影響越大。在三維曲面圖中，坡面陡峭程度越大，表明兩因素的交互作用越強；在等高線圖中，等高線越密集且呈橢圓形時交互作用越強。因此，各因素對復合酶酶解芡實DE值的影響程度為pH>酶解溫度>酶解時間>酶添加量。

2.6? 最佳工藝條件的確定及驗證試驗

采用Design-Expert 12.0軟件，得出最佳工藝參數為pH 6.59、酶添加量0.34%、酶解溫度56.50 ℃、酶解時間45.18 min。該條件下DE預測值為20.64%。對優(yōu)化后的參數進行驗證試驗，為便于操作，將工藝參數調整為pH 6.5、酶添加量0.3%、酶解溫度56 ℃、酶解時間45 min，在該條件下重復試驗3次，測得酶解后的DE平均值為20.25%，與模型預測值無明顯差異，說明該模型優(yōu)化得到的芡實粉復合酶酶解工藝參數可靠。

2.7? 抗氧化性結果分析

選擇普魯蘭酶和α-淀粉酶在最佳酶解條件下對熟化后的芡實進行酶解，獲得芡實多糖，芡實多糖的DPPH自由基清除能力見圖8。

由圖8可知，隨著芡實多糖濃度的增加，DPPH自由基清除率呈增大趨勢。在0.2～0.4 mg/mL濃度范圍內，DPPH自由基清除率快速增加。然而，在0.4～1.0 mg/mL濃度范圍內，可能是由于酶解后芡實多糖的濃度升高，分散性降低，抑制了電子的轉移，使清除率的增長速率上升緩慢[30]。當濃度為1 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到了61.43%，說明酶解后的芡實多糖具有良好的抗氧化活性。

3? 結論

通過復合酶酶解技術酶解優(yōu)質產地的芡實粉，以單因素試驗為基礎，進行Box-Behnken試驗設計及響應面分析，從而獲得最優(yōu)工藝參數：在復合酶（普魯蘭酶∶α-淀粉酶）的質量比為5∶6、酶添加量為0.3%（以原料質量為基準）、pH為6.5、酶解溫度為56 ℃、酶解時間為45 min的條件下，生產的芡實粉基料水解度可達20.25%，說明復合酶酶解技術有效增強了單位體積的能量;體外抗氧化活性試驗表明，酶解后芡實多糖能顯著清除DPPH自由基，具有一定的抗氧化活性。酶解后的芡實多糖有更好的抗氧化活性，可以廣泛用于食品添加劑及保健食品中[33]，該研究也為芡實多糖的生產制備與醫(yī)藥應用提供了相關的理論和數據依據[34]。

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