王穎 矯健鵬 徐晶鈺 劉煊 王曉煒 岳小強(qiáng)**

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355;2.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院,上海 200003)

胃癌(Grastic Cancer,GC)是全球第三大癌癥,更是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。根據(jù)國(guó)家癌癥中心的數(shù)據(jù),2020年我國(guó)癌癥新發(fā)病例數(shù)中胃癌48萬(wàn)、死亡人數(shù)37萬(wàn),分別位于第三位和第二位。胃癌前病變(precancerous lesions of gastric cancer,PLGC)是指一類(lèi)容易發(fā)生癌變的胃黏膜病理組織學(xué)變化,主要包括胃黏膜上皮異型增生和腸上皮化生兩種類(lèi)型,多伴存于慢性萎縮性胃炎中。PLGC是胃癌發(fā)生前的一個(gè)重要階段,加強(qiáng)對(duì)其相關(guān)研究,積極進(jìn)行早診早治,對(duì)于降低我國(guó)胃癌發(fā)病率、改善患者預(yù)后至關(guān)重要。近年來(lái),中醫(yī)藥在參與胃癌前病變防治中的作用和地位越來(lái)越受到重視[2]。辨證論治是中醫(yī)藥的特色與優(yōu)勢(shì),病證結(jié)合動(dòng)物模型則是在中醫(yī)藥理論、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)等知識(shí)的相結(jié)合下,在動(dòng)物身上模擬出與疾病和證候相類(lèi)似的特征[3],非常適合進(jìn)行中醫(yī)藥相關(guān)的胃癌前病變研究。本文就胃癌前病變研究中病證結(jié)合動(dòng)物模型的制備方法做一總結(jié)。

1 模型動(dòng)物的選擇

因?yàn)镻LGC造模時(shí)間較長(zhǎng),大鼠為最常用的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,品系主要為Wistar和SD大鼠,多選擇雄性或雌雄各半。近年來(lái),基因敲除小鼠也被引入到PLGC動(dòng)物模型中,如胃泌素敲除小鼠(GAS-/)、IL-1β轉(zhuǎn)基因小鼠(C57 BL/6品系)、K-ras轉(zhuǎn)基因小鼠、Tff 1基因敲除小鼠(Tff 1-/)、p53基因敲除小鼠、Klf4基因敲除小鼠都以C57 BL/6品系小鼠為主,胰島素胃泌素轉(zhuǎn)基因小鼠(INS-GAS,FVB/N品系)、Apt4a基因敲除小鼠(H+/K+-ATP酶缺失,C57)等[4-5]?；蚯贸齽?dòng)物模型雖然成模效果顯著,但對(duì)于模型小鼠要求較高,且制作成本高,目前實(shí)際應(yīng)用仍較少。

2 PLGC疾病模型

疾病造模是病證結(jié)合動(dòng)物模型的基礎(chǔ)。目前學(xué)者針對(duì)PLGC多以復(fù)合因素造模,通過(guò)化學(xué)誘變劑甲基硝酸亞硝酸胍(1N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)自由飲用或灌胃誘發(fā)黏膜病變,配合饑飽失常、乙醇(白酒)灌胃、瀉下藥物、高熱食物(60℃熱面糊)、情緒刺激(夾尾)、勞累刺激等方式,來(lái)模擬人PLGC的發(fā)生機(jī)制。MNNG是一種N-亞硝基化合物,作用機(jī)制為分解成短壽命、高反應(yīng)的親電試劑,最終的誘變劑被認(rèn)為是堿離子。Sugimura等于1967年首次發(fā)現(xiàn)將飲用水混合MNNG溶液喂養(yǎng)大鼠會(huì)誘發(fā)胃腺癌[6]。大鼠前胃對(duì)MNNG有很高的親和力,MNNG直接作用于胃黏膜而引起癌變,致癌機(jī)制為損傷細(xì)胞DNA,故常應(yīng)用于胃癌及癌前病變中[7]。MNNG的給藥方式分為自由飲用和灌胃,并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果與濃度相關(guān),其中自由飲用的濃度為60～180 μg·mL-1,灌胃的濃度為80～250 μg·mL-1,造模時(shí)間大約在20～24周不等[8-9]。

3 病證結(jié)合動(dòng)物模型

目前中醫(yī)學(xué)者根據(jù)胃癌前病變患者的典型表現(xiàn),認(rèn)為其臨床證候主要有脾胃虛弱、胃陰不足、肝胃氣滯、脾胃濕熱和胃絡(luò)瘀血證五大類(lèi)型[10]。

3.1脾胃虛弱病證結(jié)合模型 “脾胃虛弱”為CAG及其癌前病變的發(fā)病之本[11],也是其核心病機(jī)與證候。鄭嘉怡等[12]采用200 μg·mL-1MNNG自由飲用配合饑飽失常法(隔日禁食)復(fù)制PLGC脾虛證大鼠模型,在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn),造模18周后雄性SD大鼠出現(xiàn)食欲不振、精神萎靡、便溏等癥狀,與臨床PLGC脾虛證表現(xiàn)相似。病理顯示腸上皮化生、異型增生,黏膜下血管密布,出現(xiàn)擴(kuò)張微血管,甚至一只大鼠出現(xiàn)原位癌病變。朱萱萱等[13]通過(guò)每周兩次采用170 μg·mL-1的MNNG溶液和40%乙醇對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃,并給予150 μg·mL-1的MNNG溶液自由飲用,造模10周,采用破氣苦降(耗氣瀉下藥)、第五周饑飽失常(單日禁食、雙日飽食)和大鼠疲勞儀(大鼠每天跑步30 min)建立CAG脾氣虛模型。10周后SD大鼠體重和體溫明顯降低,攝食量和飲水量降低不明顯,提示脾虛證成模,而在第4周就會(huì)開(kāi)始出現(xiàn)腸化生、不典型增生等PLGC病理。張宏等[14]使用過(guò)食酸味而致脾虛的方法進(jìn)行造模[15],饑餓48 h后灌胃山西白醋(首次每日15 mL·kg-1,以后每日10 mL·kg-1),10 日后以酸度3.5 g·100 mL-1的2-乙基亞硝胺(每日2.8 mg·kg-1)灌胃,每日1次,連續(xù)灌胃4個(gè)月,120天后NIH小鼠出現(xiàn)體重減輕、食欲減退,活動(dòng)量減少,大便溏泄或成小干顆粒狀等表現(xiàn)。

3.2胃陰不足病證結(jié)合模型 李明等[16]和張楊等[17]都以100 μg·mL-1MNNG溶液灌胃,配合35%的無(wú)水乙醇每周一、四灌胃,60℃熱面糊每周二、五灌胃,含0.3 g·kg-1雷尼替丁飼料喂養(yǎng)來(lái)構(gòu)建PLGC胃陰不足證候模型。16周后模型組多數(shù)Wistar大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)欠佳,行動(dòng)遲緩,被毛疏松暗淡,食欲較差、形體偏瘦,大便時(shí)有不成形等胃陰不足的癥狀,肉眼觀察到胃壁彈性較差,顏色偏白,病理檢測(cè)出現(xiàn)腸化生。沈琪等[18]予100 μg·mL-1MNNG溶液自由飲用,以含0.03%雷尼替丁飼料喂養(yǎng),加以饑飽失常法(飲食2天,禁食1天)、禁食下午灌胃40%乙醇10 mL·kg-1、下午灌胃0.017 濃度MNNG溶液1 mL·kg-1造模,12周后模型組SD大鼠出現(xiàn)了精神萎靡、形態(tài)偏瘦、行動(dòng)遲緩、噯氣等表現(xiàn),病理顯示胃黏膜較薄,光澤度不夠,彈性較差,病理顯示出現(xiàn)不同程度的異型增生,成功地建立了PLGC胃陰不足證大鼠模型。

3.3肝胃氣滯病證結(jié)合模型 PLGC發(fā)病與情緒明顯相關(guān),肝胃氣滯證動(dòng)物模型的建立多通過(guò)夾尾刺激或慢性束縛來(lái)進(jìn)行證候造模。胡運(yùn)蓮[19]予Wistar雄性大鼠自由飲用100 μg·mL-1MNNG,以含0.03%雷尼替丁的飼料喂養(yǎng),采用饑飽失常法,進(jìn)食2天,禁食1天。以10 mL·kg-1為計(jì)量標(biāo)準(zhǔn),灌胃56℃15%鹽水,進(jìn)食下午灌胃20 mmol(0.85%)脫氧膽酸鈉溶液,禁食下午灌胃40%的酒精。每周用鉗子夾大鼠尾部30分鐘,使之保持憤怒狀態(tài)。連續(xù)造模24周,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠體型偏瘦,食欲減退,大便質(zhì)稀。病理上出現(xiàn)2例增生結(jié)節(jié),組織學(xué)檢查分別為早期腺癌和增生性息肉,提示肝胃氣滯成模。

3.4脾胃濕熱病證結(jié)合模型 近年來(lái),由于生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變,人們嗜食肥甘厚味,濕熱交阻而導(dǎo)致脾胃濕熱證胃癌前病變患者日益增多。脾胃濕熱證動(dòng)物模型的建立多模擬濕熱環(huán)境或高脂高糖飲食來(lái)造模,以大鼠出現(xiàn)大便時(shí)溏時(shí)結(jié)、臭穢,且有生化指標(biāo)改變來(lái)提示造模成功。黃琴等[20]通過(guò)15日的“濕熱環(huán)境加高脂高糖飲食和白酒綜合法”來(lái)復(fù)制脾胃濕熱證模型,再進(jìn)行12周的灌服150 g·L-1濃度的55 ℃ 熱鹽水10 mL·kg-1,2%水楊酸(10 mL·kg-1,日1次)、飲用20 mmol·L-1脫氧膽酸鈉,加以饑飽失常綜合法(進(jìn)食2日,禁食1日)來(lái)復(fù)制胃癌前病變模型。結(jié)果顯示,12周后SD大鼠喜靜,食欲下降,反應(yīng)緩慢,大便時(shí)干時(shí)稀、臭穢難聞,胃黏膜腺體出現(xiàn)大部分萎縮消失的狀況,可見(jiàn)腸上皮化生,提示造模成功。

3.5胃絡(luò)瘀血證病證結(jié)合模型 中醫(yī)認(rèn)為“久病必有瘀”,PLGC多由CAG發(fā)展而來(lái),病程時(shí)間較長(zhǎng),久病易使氣血運(yùn)行不暢,出現(xiàn)瘀血證候。旲佳慧[21]以150 μg·mL-1MNNG溶液予SD大鼠自由飲用,15%濃鹽水灌胃(禁食日、2 mL·只-1),配合饑飽失常(2天進(jìn)食1天禁食)和0.03%雷尼替丁飼料喂養(yǎng),建立PLGC大鼠模型。24周后,模型組大鼠精神較差,糞便不成形,胃黏膜充血水腫,甚至黏膜下血管分布,與中醫(yī)血瘀證候相似,且大量炎性細(xì)胞被浸潤(rùn),可見(jiàn)不典型增生細(xì)胞,提示造模成功。劉慶生等[22]]以167 μg·mL-1MNNG溶液自由飲用,以0.017 mol·L-1濃度的MNNG溶液灌胃,1 mL·只-1,復(fù)制PLGC大鼠模型,12周后模型組SD大鼠皮毛暗淡,易受刺激,胃黏膜色暗發(fā)灰、少澤,部分出現(xiàn)出血糜爛點(diǎn),與中醫(yī)血瘀證候中出血癥狀相似。封慧等[23]采用以10 mL·kg-1的大鼠體重為計(jì)量標(biāo)準(zhǔn),每周灌胃1次含0.03%雷尼替丁的MNNG溶液170 mg·L-1、每周2次400 mL·L-1乙醇,通過(guò)用這種綜合造模法建立PLGC模型,造模12周后模型組SD大鼠體重明顯減輕,增長(zhǎng)速度緩慢,胃黏膜明顯變薄,顏色偏白灰色,有散在出血點(diǎn),部分水腫糜爛,舌質(zhì)出現(xiàn)紫暗,并發(fā)血瘀證候。

4 病證結(jié)合動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)

在PLGC的動(dòng)物模型中,以胃黏膜出現(xiàn)萎縮并伴有腸上皮化生或異型增生為主要的疾病成模標(biāo)準(zhǔn)。脾胃虛弱證的成模標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠食欲不振,大便溏,喜靜,苔薄白;胃黏膜蒼白或灰白,黏膜變薄,黏液量多稀薄,胃蠕動(dòng)變?nèi)酢Ｎ戈幉蛔阕C的成模標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠形體消瘦,大便干結(jié),舌紅少苔;胃黏膜表面不平變薄,黏液減少,皺襞變細(xì)或消失,呈龜裂樣改變。肝胃氣滯證的成模標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠表現(xiàn)為易激惹;胃黏膜呈急性活動(dòng)性炎性反應(yīng),胃蠕動(dòng)較快。脾胃濕熱證的成模標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠大便黏膩或稀滯,舌紅苔黃膩;胃黏膜糜爛、充血紅腫,黏液渾濁黏稠。胃絡(luò)瘀血證的成模標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠表現(xiàn)為舌暗紅,有瘀斑、瘀點(diǎn);胃黏膜存在出血點(diǎn),血管呈暗紅色[24]。

5 問(wèn)題與展望

在病證結(jié)合動(dòng)物模型中,疾病造模多以MNNG水溶液予動(dòng)物自由飲用或灌胃為主,證候造模則在中醫(yī)理論指導(dǎo)下進(jìn)行。MNNG因其造模操作相對(duì)簡(jiǎn)便、成模率較高,因而在目前多數(shù)胃癌前病變研究中被廣泛應(yīng)用;其雖然作為常用的PLGC造模試劑,但目前文獻(xiàn)中對(duì)于造模周期、死亡率的研究較少,使得MNNG造模技術(shù)運(yùn)用中仍存在很多懸而未決的實(shí)際問(wèn)題;而且,MNNG的發(fā)病機(jī)制與人類(lèi)發(fā)病機(jī)制存在較明顯的差別,使得其用于對(duì)PLGC疾病分子機(jī)制探討上可能還存在一定問(wèn)題[25-29]。

在中醫(yī)證候造模中,雖然病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究取得了一定的進(jìn)展,但在模型判定上大致符合人體證候表現(xiàn),而人體與動(dòng)物發(fā)病機(jī)制存在顯著差異,故此類(lèi)造模方法未得到眾多研究人員認(rèn)同;并且不同病證結(jié)合的造模方法不盡相同,未明確統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)證候動(dòng)物模型的診斷依據(jù)應(yīng)包括癥狀(本證)、病因(正證)、治療(反證)、相關(guān)因素(佐證)、客觀指標(biāo)(佐證)五個(gè)方面[30],但目前多數(shù)證候動(dòng)物模型尚不能滿足以上全部五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。另外,病證結(jié)合動(dòng)物模型由于干預(yù)措施復(fù)雜、步驟較多,客觀上導(dǎo)致造模的可重復(fù)性較差。

總之,PLGC的發(fā)病周期長(zhǎng)、機(jī)制復(fù)雜,其病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究雖然取得了一定進(jìn)展,但還存在諸多實(shí)際問(wèn)題,需要廣大科研工作者在不斷的實(shí)踐中,不斷發(fā)現(xiàn)并加以改進(jìn)。