張巧艷,方維煥,鄭蔚然,王夏君,劉超綱, 王 強,

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所,浙江 杭州 310021; 2.浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058; 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所,浙江 杭州 310021)

2017年,瑞士等15個歐盟國家和中國香港相繼在雞蛋中檢測出氟蟲腈,“毒雞蛋”事件發(fā)酵成為全世界范圍內(nèi)的重大食品安全事件[1]。氟蟲腈曾是一種使用廣泛的苯基吡唑類殺蟲劑,因?qū)γ鄯?、水生生物等造成?yán)重毒害作用而被禁用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和畜禽養(yǎng)殖[2]。雞蛋中氟蟲腈的來源可能是養(yǎng)雞場非法使用氟蟲腈殺滅跳蚤、虱子而導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境污染;或者農(nóng)田長期殘留氟蟲腈引起農(nóng)作物污染,通過飼料進(jìn)入蛋雞體內(nèi),然后轉(zhuǎn)移至雞蛋中。研究發(fā)現(xiàn),氟蟲腈在雞蛋中的殘留標(biāo)示物主要是其代謝物氟蟲腈砜,在殘留消除過程中氟蟲腈砜的含量常常遠(yuǎn)高于氟蟲腈[3]。而且,氟蟲腈砜對肝細(xì)胞的毒性也強于原藥氟蟲腈。在降低細(xì)胞活力上,氟蟲腈砜比氟蟲腈強54倍;用乳酸脫氫酶(LDH)漏出率評估細(xì)胞損傷程度,氟蟲腈砜毒性是氟蟲腈的37倍[4]。雞蛋中氟蟲腈砜的精準(zhǔn)檢測結(jié)果一定程度上可以反映氟蟲腈的污染水平和潛在風(fēng)險。

方法驗證、不確定度評估和質(zhì)量控制是確保可靠測量的關(guān)鍵,是檢測實驗室質(zhì)控體系的重要組成部分[5]。檢測結(jié)果的不確定度來源于測量過程,體現(xiàn)測量值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的統(tǒng)計學(xué)差異。一般認(rèn)為,不確定度越小,所述結(jié)果與被測量的真值愈接近[6]。評估測量不確定度最常見的方法是“自上而下”法(Top-down)和“自下而上”法(Bottom-up)。前者主要使用實驗室現(xiàn)有的檢測數(shù)據(jù)和信息評定不確定度;后者需要對測量過程所有可能影響結(jié)果的因素進(jìn)行系統(tǒng)的分析和不確定度評估[7]。國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確、可靠的量值和計量溯源性,可用于測量不確定度評估、檢測質(zhì)控和方法優(yōu)化[8]。浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院通過藥代動力學(xué)實驗獲得天然的含氟蟲腈砜的雞蛋液,經(jīng)冷凍干燥、磨粉過篩、輻照滅菌等步驟將其加工成雞蛋粉,經(jīng)均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗、多家實驗室聯(lián)合定值,以及不確定度分析,研制了雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該產(chǎn)品已獲批為國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),編號為GBW(E)100779。

鑒于高通量凈化設(shè)備設(shè)計需求,浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院開發(fā)了一種多功能凈化柱(PAC柱),可實現(xiàn)雞蛋提取液的一步直通式凈化,并基于同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ID-LC-MS/MS)建立了氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈同步快速檢測方法,方法的準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度能夠滿足雞蛋樣品氟蟲腈及其代謝物殘留檢測需求[9]。同位素稀釋質(zhì)譜法是國際計量組織公認(rèn)的基準(zhǔn)測量方法之一,可用于提供較高準(zhǔn)確度和精密度,以及較小不確定度的檢測結(jié)果。它測量的不是單純的濃度,而是樣液中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的摩爾數(shù)量的比值[10]。本研究以GBW(E)100779為測試樣,先加水復(fù)原成雞蛋液,再用乙腈提取,用PAC柱凈化,結(jié)合ID-LC-MS/MS法進(jìn)行氟蟲腈砜的殘留檢測,基于“自下而上”法開展測量不確定度評估,詳細(xì)探討影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素,為雞蛋精準(zhǔn)檢測的質(zhì)量控制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)100779]來自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/浙江大學(xué);乙腈中氟蟲腈砜溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)084271]來自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;將氟蟲腈砜-13C6標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%,上海安譜實驗科技股份有限公司)用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1的穩(wěn)定同位素稀釋劑(內(nèi)標(biāo)溶液);甲醇、乙腈(色譜純,德國默克集團(tuán));氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);PAC多功能凈化柱(200 mg,3 mL,自制)[9];萬分之一天平(美國康州HZ電子有限公司);UltiMate 3000液相色譜-TSQ Quantum Discovery三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科技)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備

用1 mL移液槍準(zhǔn)確吸取1.00 mL氟蟲腈砜溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于100 mL容量瓶中,用乙腈定容,搖勻,從中準(zhǔn)確吸取0.50 mL置于另一100 mL容量瓶中,用乙腈定容,搖勻,獲得氟蟲腈砜質(zhì)量濃度為5.00 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。接著,用10 mL移液管分2次準(zhǔn)確吸取20 mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液置于棕色樣品瓶中,用100 μL移液槍準(zhǔn)確吸取50 μL內(nèi)標(biāo)溶液加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中,搖勻,配制成同位素稀釋的氟蟲腈砜單點校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

將雞蛋粉從冰箱中取出,恢復(fù)至室溫。用萬分之一天平稱取1.25 g雞蛋粉(精確到0.000 1 g)置于50 mL塑料離心管中,加入3.75 g純凈水,渦旋振蕩1 min,超聲10 min,30 ℃避光水浴1 h,復(fù)原成5 g雞蛋液。

用10 mL移液管分2次準(zhǔn)確吸取20 mL乙腈加入雞蛋液中,渦旋振蕩1 min,超聲30 min。用100 μL移液槍準(zhǔn)確吸取50 μL內(nèi)標(biāo)溶液加入提取液中,渦旋振蕩30 s。加入2 g 氯化鈉和6 g無水硫酸鈉,渦旋振蕩1 min,6 200×g離心5 min,獲得上清液。用移液槍吸取2 mL上清液,利用重力作用通過PAC柱,加壓擠干填料,完全收集流出液,過0.22 μm微孔濾膜,待上機測定[9]。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱:ACE Excel 2 C18柱(2.1 mm×100 mm,2 μm);柱溫:35 ℃;流動相:A相為水,B相為甲醇,梯度洗脫,0～4.0 min(40% A～ 10% A),4～5.5 min(10% A),5.5～7.0 min(10% A～40% A),7.0～10.0 min(40% A);流速0.25 mL·min-1,進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜系統(tǒng)使用電噴霧離子源,負(fù)離子模式掃描(ESI-),氬氣為碰撞氣,氮氣為鞘氣和輔助氣。毛細(xì)管電壓3 800 V,鞘氣25 arb,輔助氣4 arb,碰撞氣2 mTorr,離子源溫度320 ℃。采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM),氟蟲腈砜:m/z450.9>281.8(10 eV)、m/z450.9>243.8(66 eV);氟蟲腈砜-13C6:m/z456.9>287.8(10 eV)、m/z456.9>249.8(66 eV)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量不確定度評估

雞蛋液加工成雞蛋粉,實測脫水率為75%,即1.25 g雞蛋粉[GBW(E)100779]加入3.75 g水可復(fù)原成5 g雞蛋液。在前處理過程中,雞蛋液中的水分經(jīng)氯化鈉鹽析后與乙腈相分離,被無水硫酸鈉吸附,將氟蟲腈砜及其內(nèi)標(biāo)物轉(zhuǎn)移至乙腈相中。在優(yōu)化條件下,雞蛋粉中的氟蟲腈砜被乙腈充分提取,通過單點比較法可以獲得提取液中氟蟲腈砜的濃度,從而計算出雞蛋粉中氟蟲腈砜的殘留量。計算公式推導(dǎo)如下:

(1)

(2)

檢測結(jié)果以雞蛋粉計,雞蛋液中的水分對量值無影響。由公式(2)可知,在定值過程中,同位素內(nèi)標(biāo)濃度c和樣品提取溶劑體積V沒有參與結(jié)果的計算。峰面積的測量重復(fù)性是由儀器的隨機誤差造成的。針對某次測量,當(dāng)檢測儀器固定時,檢測質(zhì)量主要依賴于前處理過程。在儀器條件滿足檢測要求且氟蟲腈砜完全提取的前提下,測量不確定度主要由以下4部分引入,按JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[11]進(jìn)行各部分的不確定度評定。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度引入的不確定度

氟蟲腈砜溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)084271具有相對較小的不確定度,其量值可溯源至澳大利亞國家計量研究院的氟蟲腈砜純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NMIA P1731。檢測過程以GBW(E)084271[相對擴展不確定度為2%(k=2)]為參考物質(zhì),由此引入的相對不確定度為:

稀釋過程帶來的不確定度主要來自各種移液器具的承載體積。本研究所用的容量瓶和移液管均為A級器具,其他移液器具均檢定合格。按JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[12]和JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[13]確定容量允差,重復(fù)測定10次獲得重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差,由各種體積引入的不確定度分量匯總于表1中。容量瓶體積帶來的不確定度主要來源于溫度變化對溶劑乙腈的影響。制備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液或者溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時,選擇室溫變化較小的實驗環(huán)境,有利于縮小不確定度。通過兩步稀釋將參考物質(zhì)(100 μg·mL-1)制備成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(5 μg·L-1),稀釋過程引入的相對不確定度計算如下:

表1 各種體積引入的不確定度及其來源匯總Table 1 Uncertainties caused by volumes and their sources

氟蟲腈砜標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度引入的相對不確定度來自參考物質(zhì)及其稀釋過程,合成如下:

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液移取體積引入的不確定度

單點校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由20 mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和50 μL內(nèi)標(biāo)溶液混合制備而成,兩者的體積比是400∶1。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液移取體積的少量偏差(±0.5 mL)對單點校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中氟蟲腈砜的濃度幾乎無影響,但會通過影響內(nèi)標(biāo)的濃度影響最終檢測結(jié)果。制備時,選擇實驗室常用的10 mL分度移液管,分2次吸取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,合成的相對不確定度為:

2.1.3 內(nèi)標(biāo)溶液添加體積引入的不確定度

同位素稀釋質(zhì)譜法是在試樣中加入已知量的、與被測元素相同但同位素豐度不同的物質(zhì)(簡稱“稀釋劑”),混合均勻達(dá)到平衡后,用質(zhì)譜測量混合試樣中被測元素的同位素豐度比值,由此計算出被測元素的含量。雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用ID-LC-MS/MS法檢測時,在20 mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品乙腈提取液中分別加入50 μL穩(wěn)定同位素稀釋劑,由此引入的相對不確定度為:

2.1.4 雞蛋粉樣品稱樣量引入的不確定度

2.1.5 關(guān)鍵控制點分析

在測量不確定度評估中,通常使用石川圖(Ishikawa diagram),又名魚骨圖(Fish-bone diagram),詳盡展示測量不確定度分量的來源,反映可能影響整個檢測過程的潛在參數(shù)[14]。由圖1可見,雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留檢測的不確定度主要有4個分量,定值結(jié)果的測量不確定度計算模型及其結(jié)果如下:

圖1 ID-LC-MS/MS法檢測雞蛋粉中氟蟲腈砜的不確定度評估魚骨圖Fig.1 Fish-bone diagram of uncertainty evaluation on determination of fipronil-sulfone in egg powder by ID-LC-MS/MS

k為包含因子,對應(yīng)置信概率95%,一般取k=2。則檢測結(jié)果的相對擴展不確定度為:

U定值,rel=k×u定值,rel=2×3.6%=7.2%。

以每個分量的平方占所有分量平方和的百分比計算各不確定度分量的貢獻(xiàn)率。由圖2可見,檢測結(jié)果的主要不確定度來源于內(nèi)標(biāo)溶液添加體積,貢獻(xiàn)率為68.59%。因此,添加內(nèi)標(biāo)過程是雞蛋粉中氟蟲腈砜ID-LC-MS/MS法測定的關(guān)鍵控制點。從表1可知,刻度誤差、測量重復(fù)性、溫度波動都可能引起體積偏差,最終影響檢測結(jié)果。內(nèi)標(biāo)溶液的添加體積相對較小,且溶劑乙腈容易揮發(fā),常規(guī)檢測時一般使用移液槍快速移取、直接添加。100 μL移液槍檢定合格的容量允差范圍相對較大,是導(dǎo)致50 μL體積引入的不確定度偏大的主要原因。移液槍使用前進(jìn)行移取體積的準(zhǔn)確性校正,可以確保檢測結(jié)果更接近真值。20 ℃時,水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1,約為乙腈的六分之一。當(dāng)內(nèi)標(biāo)的溶劑更換為水后,移取體積因受溫度波動而對不確定度的貢獻(xiàn)會明顯減小。若用不易揮發(fā)的溶劑(例如水)稀釋內(nèi)標(biāo),降低不確定度的方法還可以考慮用質(zhì)量代替體積[15]。

Cs,標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度對合成不確定度的貢獻(xiàn)率;Vs,標(biāo)準(zhǔn)工作溶液移取體積對合成不確定度的貢獻(xiàn)率;vi+vsi,內(nèi)標(biāo)溶液添加體積對合成不確定度的貢獻(xiàn)率;m,樣品稱樣量對合成不確定度的貢獻(xiàn)率。Cs, Vs, vi+vsi and m were the contribution ratio of the concentration of standard working solution, the transferred volume of standard working solution, the added volumes of internal standard solution and the weighting of sample, respectively.圖2 ID-LC-MS/MS法檢測雞蛋粉中氟蟲腈砜的不確定度分量貢獻(xiàn)圖Fig.2 Contribution of each component in the combined uncertainty for determination of fipronil-sulfone in egg powder by ID-LC-MS/MS

用萬分之一天平(特種準(zhǔn)確度級)稱量雞蛋粉(1.25 g左右)帶來的不確定度幾乎可以忽略不計(圖2)。當(dāng)樣品為均質(zhì)的雞蛋液(5 g左右)時,用萬分之一天平稱量,檢測結(jié)果以雞蛋液計,稱量帶來的不確定度小于雞蛋粉,其他測量不確定度分量的貢獻(xiàn)率與雞蛋粉一致。

2.2 參考基準(zhǔn)材料評估

氟蟲腈砜單點校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由參考物質(zhì)、稀釋劑和內(nèi)標(biāo)溶液混合制備而成。制備前用LC-MS/MS對上述材料進(jìn)行分析。由圖3可知,稀釋劑乙腈(也是樣品提取溶劑)中不存在氟蟲腈砜和氟蟲腈砜-13C6;參考物質(zhì)[GBW(E)084271]中存在氟蟲腈砜,無氟蟲腈砜-13C6;內(nèi)標(biāo)溶液中存在氟蟲腈砜-13C6,無氟蟲腈砜。這些材料在使用時互不干擾,不會給氟蟲腈砜及其內(nèi)標(biāo)的濃度準(zhǔn)確性帶來風(fēng)險,也不會給樣品提取及其內(nèi)標(biāo)添加過程增加額外的不確定性因素。雞蛋粉[GBW(E)100779]經(jīng)乙腈提取、PAC柱凈化后,用LC-MS/MS分析,獲得的色譜與質(zhì)譜特征與圖3-B一致;用ID-LC-MS/MS法檢測,提取液經(jīng)同位素稀釋、PAC柱凈化后進(jìn)行分析,能夠獲得與圖3-B、圖3-C特征一致的色譜圖和質(zhì)譜圖。

A,稀釋劑(乙腈);B,參考物質(zhì)[GBW(E)084271];C,內(nèi)標(biāo)溶液(氟蟲腈砜-13C6)。1和2分別為針對氟蟲腈砜的提取離子色譜圖和質(zhì)譜棒狀圖,3和4分別為針對氟蟲腈砜-13C6的提取離子色譜圖和質(zhì)譜棒狀圖。A, Diluent solvent (acetonitrile); B, Reference material [GBW(E)084271]; C, Internal standard solution (fipronil-sulfone-13C6). 1 and 2, The extracted ion chromatogram and mass spectra centroid for fipronil-sulfone; 3 and 4, The extracted ion chromatogram and mass spectra centroid for fipronil-sulfone-13C6.圖3 用于氟蟲腈砜檢測的參考物質(zhì)、稀釋劑和內(nèi)標(biāo)溶液LC-MS/MS圖Fig.3 LC-MS/MS profiles of reference material, diluent solvent and internal standard solution for the fipronil-sulfone detection

2.3 前處理方法評估

氟蟲腈砜的完全提取是準(zhǔn)確反映雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留量的首要條件,也是有效地測量不確定度評估的前提。乙腈對氟蟲腈及其代謝物具有極好的溶解能力,還可以沉淀大部分蛋白質(zhì),有利于釋放目標(biāo)物,減少提取過程中的乳化現(xiàn)象[9]。本研究以GBW(E)100779為測試樣,以乙腈為提取溶劑,輔助超聲提取。由表2可見,超聲提取5 min,雞蛋粉中氟蟲腈砜的含量平均值略偏小,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)較大。延長超聲時間至10 min,提取得率明顯增加。超聲30 min時檢測結(jié)果最高,6次測量的平均值與GBW(E)100779的標(biāo)準(zhǔn)值(77 μg·kg-1)最接近,而且RSD相對較小,可視為雞蛋粉中的氟蟲腈砜已被提取完全。當(dāng)用空白雞蛋粉加標(biāo)制備質(zhì)控樣用于提取效果比較時,不同超聲時間對檢測結(jié)果無顯著性差異。

表2 不同超聲時間下提取的雞蛋粉(GBW(E)100779)的ID-LC-MS/MS檢測結(jié)果Table 2 Test results of egg powder (GBW(E)100779) by ID-LC-MS/MS after extraction for different ultrasonic times

雞蛋粉乙腈提取液中含有除目標(biāo)物之外的蛋白質(zhì)、脂肪、色素等雜質(zhì),需經(jīng)凈化處理,以減少它們對儀器的污染和對檢測靈敏度的影響。PAC柱是一種多功能凈化柱,可用于雞蛋提取液的快速直通式凈化,以去除主要的雜質(zhì),使進(jìn)樣液中氟蟲腈砜和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均能同步滿足檢測要求[9]。同位素稀釋質(zhì)譜法可以恰當(dāng)?shù)叵齼艋^程的損失,以及伴隨復(fù)雜基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)對準(zhǔn)確測量的影響[15]?；赑AC柱的凈化程序不會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本研究基于國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)100779]建立了ID-LC-MS/MS法檢測雞蛋粉中氟蟲腈砜殘留量的測量不確定度評估模型,系統(tǒng)分析了影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素,得出以下結(jié)論:參考基準(zhǔn)的合理選擇和目標(biāo)物的完全提取是準(zhǔn)確測量的前提,同位素內(nèi)標(biāo)的精準(zhǔn)添加是獲得可靠結(jié)果的關(guān)鍵。針對動物源性食品中的污染物,通過代謝試驗和加工處理,研制與天然陽性樣品基本一致的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),可逐步替代傳統(tǒng)外加標(biāo)的質(zhì)控樣,有效用于檢測方法的優(yōu)化和檢測質(zhì)量的評估。