王勇，向媛，許微

(1.銅仁學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.銅仁市文化科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究中心，貴州 銅仁 554300)

隨著人類社會的工業(yè)發(fā)展，大量重金屬污染物未經(jīng)處理排放到周邊環(huán)境中，不僅對周邊動植物產(chǎn)生毒害作用，還會通過食物鏈等方式對人類產(chǎn)生嚴重的健康風(fēng)險。面對日趨嚴重的重金屬污染問題，人類亟需對重金屬污染環(huán)境進行修復(fù)治理。在使用各種不同技術(shù)方法對環(huán)境中的重金屬污染進行修復(fù)時，由于植物修復(fù)技術(shù)具有高效、環(huán)境友好型等特點，受到越來越多的重視[1-2]。利用植物修復(fù)重金屬污染土壤的關(guān)鍵是找到合適的植物種類，再利用物理、化學(xué)、生物等方法進一步提高植物修復(fù)效率、縮短修復(fù)時間，其中土壤pH值、營養(yǎng)元素含量、重金屬種類等多種外界條件對植物修復(fù)效果均有較大影響[3-4]。利用元素間的相互作用、植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收特點等強化修復(fù)效果，進一步提高修復(fù)效率的研究也越來越受到重視[5-6]。大量研究表明，鈣、磷、氮等植物必需營養(yǎng)元素添加可以鈍化土壤中的鋅、砷、鎘元素，降低重金屬活性和移動能力，減少植物對重金屬砷、鎘的吸收，對植物的生長有促進作用[2，7-8]。

磷作為植物生長必需大量元素之一，在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用，參與了包括光合作用、呼吸作用等許多生命活動過程，在能量儲存和細胞信號傳導(dǎo)、細胞分裂和細胞增大等過程中起著關(guān)鍵作用[9]。適當(dāng)增加磷元素的供應(yīng)不僅能夠促進植物的生長、提高植物對其他營養(yǎng)元素的吸收利用，增加植物各部分的干物質(zhì)積累，還能夠提高蛋白質(zhì)、糖類等營養(yǎng)成分的含量[10]。例如，適量地增加磷可以提高花生的光合速率，增加花生籽仁的賴氨酸、亞油酸等含量，從而改善花生營養(yǎng)品質(zhì)[11]。在植物修復(fù)領(lǐng)域中，磷不僅能夠影響植物對重金屬的吸收，還會增加植物的抗氧化活性，減少重金屬引起的過氧化作用和緩解重金屬慢性毒性等[5，9，12]。例如，王智怡等[13]研究發(fā)現(xiàn)，外源磷能夠減少鋁在根尖的積累，降低水稻根系果膠和半纖維素含量，緩解鋁毒帶來的損傷。適量的磷不僅能夠緩解砷對植物的毒性，限制植物對砷的吸收、轉(zhuǎn)運，還會在一定程度上增加植物的生物量[14-15]。

地枇杷是一種常見的常綠藤本植物，對鉛、鎘、銻均有較好的耐受性，在植物修復(fù)方面具有較高的應(yīng)用價值[16-17]。已有研究表明，在銻脅迫下地枇杷能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶活性去除多余的活性氧和降低細胞膜的膜脂過氧化作用，從而減少光合作用能力受到的影響[18-19]。

然而，營養(yǎng)元素與銻復(fù)合處理對地枇杷的生理變化及銻吸收特征的研究未曾報道。本研究采用盆栽的方式，通過研究地枇杷生物量、葉綠素含量、脯氨酸含量等的變化情況，明確地枇杷在磷銻復(fù)合處理下生理響應(yīng)和抗逆效果，對地枇杷的生長促進和銻污染土壤植物修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

實驗用地枇杷苗木由采集于湖南省冷水江市錫礦山的地枇杷扦插、繁殖獲得。實驗以砂培的方式進行，分別設(shè)置磷處理(0、15、30、60和180 mg·L-1)、銻+磷處理(22+0、22+15、22+30、22+60和22+180 mg·L-1)，其中磷源為NaH2PO4，銻源為酒石酸銻鉀C4H4KO7Sb·1/2H2O。每個處理設(shè)3次重復(fù)，每盆3株地枇杷，砂培實驗在塑料花盆中進行。間隔5 d每盆補充50 mL含有不同濃度磷和銻的1/2缺磷霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)，共培養(yǎng)100 d。實驗期間，其他培養(yǎng)條件均與地枇杷繁殖時保持一致。

1.1 生物量測定

首先使用濃度為20 mmol·L-1的Na2-EDTA對地枇杷根部浸泡30 min，然后用自來水沖洗干凈后分為根、莖、葉3個部分，再使用去離子水沖洗3遍，分為根、莖和葉3部分后于105 ℃殺青30 min，再在70 ℃烘干至恒重，分別記錄地枇杷根、莖和葉的干重。

1.2 葉綠素含量測定

培養(yǎng)40 d后采集地枇杷從上至下的第4或第5片完全展開的葉子，稱取新鮮葉片樣品0.1 g，將樣品置于研缽中，加入少量的CaCO3和石英砂及0.5 mL純丙酮研成勻漿，然后再用80%丙酮定容至25 mL，并在黑暗條件下放置24 h，提取液用于測定葉綠素和類胡蘿卜素的含量。提取液中的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量用分光光度計測定(UV-4100，日立)，波長分別為646、663和470 nm[20]，并按照公式計算3種色素含量：Ca=12.21D663-2.81D646，Cb=20.13D646-5.03D663；Cxc=(1 000D470-3.27Ca-104Cb)/229。

其中，Ca、Cb表示葉綠素a和葉綠素b濃度；Cxc表示類胡蘿卜素的總濃度，D663、D646和D470表示葉綠素提取液在波長663、646和470 nm下的吸光度。

1.3 脯氨酸測定

稱取不同處理的地枇杷葉片各0.500 g放入研缽中并加入5 mL 3%的磺基水楊酸溶液研磨勻漿，然后轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，在沸水浴中提取10 min(提取過程中要經(jīng)常搖動)，冷卻后于3 000 r·min-1離心10 min，上清即為脯氨酸的提取液。脯氨酸含量使用酸性茚三酮法進行測定。

1.4 營養(yǎng)元素和銻的測定

稱取0.200 g的地枇杷烘干樣品，使用5 mL 4∶1的硝酸和高氯酸混合酸在電熱板上進行消解，設(shè)定溫度為160 ℃，消解完成后消解液使用50 mL容量瓶和超純水進行定容，消解液中銻使用原子熒光光譜法測定(吉天AFS-810，北京，吉天儀器有限公司)。另稱取一定量地枇杷烘干樣品，利用H2SO4與H2O2進行消解，消解液中氮元素測定采用凱氏定氮儀(KDA-08)蒸餾后，鹽酸滴定的方法測定；磷采用釩鉬黃分光光度法測定；鉀元素測定采用火焰原子吸收分光光度法測定[21]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)測定的平均值。采用SPSS統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)，Tukey test檢驗對處理間的平均值進行顯著性分析，當(dāng)P<0.05時表示差異顯著。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 地枇杷的生物量

磷銻復(fù)合處理下地枇杷干重變化如圖1所示。磷處理下，地枇杷根的干重變化不大，但地枇杷葉的干重隨著磷濃度的增加先增加后降低，在磷濃度為15和30 mg·L-1時最大，分別比對照增加了42.91%和31.04%，而莖干重僅在磷濃度為30 mg·L-1時比對照顯著增加了28.79%。結(jié)果說明，低濃度的磷處理對地枇杷葉和莖的干物質(zhì)累積有促進作用，而高濃度的磷對地枇杷葉干物質(zhì)的積累影響不大。銻磷復(fù)合處理時，不同濃度磷的加入均能在一定程度上增加地枇杷不同部分的干物質(zhì)積累，且不同部分存在明顯差異。地枇杷莖的干重變化不大，但地枇杷葉和根的干重均在磷+銻濃度180 mg·L-1+22 mg·L-1時比單一銻處理分別有明顯增加。與單一磷處理相比，地枇杷葉干重在磷+銻的濃度分別為15 mg·L-1+22 mg·L-1和30 mg·L-1+22 mg·L-1時比磷濃度為15 mg·L-1和30 mg·L-1分別降低了15.28%和20.23%，而其在磷+銻濃度為180 mg·L-1+22 mg·L-1時，比磷濃度為180 mg·L-1明顯增加了23.64%。此外，根干重在磷+銻濃度為15 mg·L-1+22 mg·L-1、30 mg·L-1+22 mg·L-1、60 mg·L-1+22 mg·L-1和180 mg·L-1+22 mg·L-1時，分別比磷濃度為15、30、60和180 mg·L-1時增加了27.66%、35.21%、36.76%和75.76%。磷與銻復(fù)合處理時，銻的加入不僅能顯著促進地枇杷根干物質(zhì)的積累，而且低濃度磷銻復(fù)合處理時能夠抑制地枇杷葉的干物質(zhì)積累，而高濃度磷與銻復(fù)合處理時能夠促進地枇杷葉干物質(zhì)的積累。

圖中柱上無相同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，圖2～7同。A表示葉，B表示莖，C表示根。圖1 磷銻復(fù)合處理對地枇杷干重的影響Fig.1 Effect of phosphorus and antimony treatment on dry weight of Ficus tikoua

2.2 葉綠素含量

磷銻復(fù)合處理下地枇杷葉綠素含量變化如圖2所示。很明顯，高濃度磷能增加地枇杷類胡蘿卜素含量，而對地枇杷葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a/葉綠素b影響不大，僅類胡蘿卜素含量在磷濃度為180 mg·L-1處理下比對照增加了28.51%。磷銻復(fù)合處理時，地枇杷葉綠素a、類胡蘿卜素、葉綠素a/葉綠素b在磷+銻濃度為60 mg·L-1+22 mg·L-1和180 mg·L-1+22 mg·L-1有明顯變化，其分別比單一銻處理時增加了10.22%、20.27%、31.25%和24.48%、37.03%和35.88%。而地枇杷葉綠素b含量在磷+銻濃度為60 mg·L-1+22 mg·L-1和180 mg·L-1+22 mg·L-1時，比單一銻處理時降低了17.01%和15.48%。

圖2 磷銻復(fù)合處理對地枇杷葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of phosphorus and antimony treatment on chlorophyll content of Ficus tikoua

結(jié)果表明，銻處理時中高濃度的磷加入能夠促進葉綠素a和類胡蘿卜素的合成，而抑制葉綠素b的合成。與單一磷處理相比，低濃度磷+銻復(fù)合處理對地枇杷葉綠素指標(biāo)影響不大，但高濃度的磷銻復(fù)合處理促進葉綠素a的合成，增加地枇杷葉綠素a含量。地枇杷葉綠素a和葉綠素a/葉綠素b在磷+銻濃度為180 mg·L-1+22 mg·L-1時比磷濃度為180 mg·L-1時有明顯增加。

2.3 脯氨酸含量

磷銻復(fù)合處理下地枇杷葉綠素含量變化如圖3所示。磷處理下，地枇杷葉中脯氨酸含量隨著磷濃度增加逐漸增加，在磷濃度為180 mg·L-1時含量最高。而地枇杷根中脯氨酸隨著磷濃度增加而逐漸降低，且在對照時含量最高。結(jié)果表明，高濃度磷處理會增加地枇杷葉中脯氨酸含量，而缺磷會增加地枇杷根中的脯氨酸含量。磷銻復(fù)合處理時，地枇杷根中脯氨酸含量變化不大，而葉中脯氨酸隨著磷濃度的增加先增加而后降低，在磷+銻濃度為15 mg·L-1+22 mg·L-1達到最大值。與磷處理相比，磷銻復(fù)合處理中，地枇杷葉中脯氨酸含量在磷+銻濃度為60 mg·L-1+22 mg·L-1和180 mg·L-1+22 mg·L-1時分別比磷濃度為60和180 mg·L-1明顯降低了50.49%和79.97%；而在磷+銻濃度為15 mg·L-1+22 mg·L-1時比磷濃度為15 mg·L-1，顯著增加了71.25%。磷銻復(fù)合處理中，銻的加入均能明顯降低地枇杷根中脯氨酸含量，其在磷+銻濃度為0 mg·L-1+22 mg·L-1、15 mg·L-1+22 mg·L-1、30 mg·L-1+22 mg·L-1、60 mg·L-1+22 mg·L-1和180 mg·L-1+22 mg·L-1時分別比磷濃度為0、15、30、60和180 mg·L-1時明顯降低了53.76%、47.85%、54.34%、40.10%和50.39%。這表明磷銻復(fù)合處理時，銻與低濃度磷復(fù)合處理能夠增加葉中脯氨酸含量，而銻與高濃度磷復(fù)合處理能夠明顯降低地枇杷葉和根中脯氨酸含量。

A表示葉，B表示根。圖3 磷銻復(fù)合處理對地枇杷脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of phosphorus and antimony treatment on proline content of Ficus tikoua

2.4 氮磷鉀含量

由圖4可知，磷處理并不會增加地枇杷葉片中氮含量，相反除在磷濃度30 mg·L-1時與對照差異不大外，其他磷處理還會明顯抑制地枇杷葉中氮的累積。而地枇杷莖中氮含量與其有相反的規(guī)律，除在磷濃度為30 mg·L-1時莖中氮含量沒有變化，其余處理均能增加地枇杷莖中氮的含量。同時地枇杷根中氮的含量在磷濃度為180 mg·L-1時最高，為27.28 mg·g-1，其余處理之間地枇杷根中氮含量差異不大。磷銻復(fù)合條件下，地枇杷葉中氮含量在磷+銻濃度為30 mg·L-1+22 mg·L-1和180 mg·L-1+22 mg·L-1時最高，分別為29.44和27.59 mg·g-1，而在磷+銻濃度為15 mg·L-1+22 mg·L-1和60 mg·L-1+22 mg·L-1時最低。雖然地枇杷莖中氮的含量在磷+銻濃度為180 mg·L-1+22 mg·L-1時變化不大，但其他處理對地枇杷莖中氮的累積有抑制作用，能夠降低地枇杷莖中氮的含量。此外，地枇杷根中氮的含量在磷+銻濃度為180 mg·L-1+22 mg·L-1時有明顯增加。與磷處理相比，低濃度的磷和銻復(fù)合處理時，銻的加入能夠降低地枇杷葉中氮的含量，且在磷+銻濃度為15 mg·L-1+22 mg·L-1、60 mg·L-1+22 mg·L-1時變化明顯。雖然磷銻復(fù)合處理時，銻的加入均能增加地枇杷根中氮的含量，但地枇杷莖中氮的含量僅在磷銻濃度為60 mg·L-1+22 mg·L-1時有明顯降低。

A表示葉，B表示莖，C表示根。圖4 磷銻復(fù)合處理對地枇杷氮含量的影響Fig.4 Effect of phosphorus and antimony treatment on nitrogen content of Ficus tikoua

磷銻復(fù)合處理下地枇杷磷含量變化如圖5所示。磷處理下，地枇杷葉和根中磷含量隨著磷濃度的增加而增加，而地枇杷莖內(nèi)磷的含量變化不明顯。同樣，磷銻復(fù)合處理下地枇杷根莖葉中磷的含量均隨著磷+銻濃度的增加而增加，且在磷+銻濃度為180 mg·L-1+22 mg·L-1時含量最高。與磷處理相比，磷銻復(fù)合處理中，莖和根中磷的含量在磷+銻濃度180 mg·L-1+22 mg·L-1時最高，分別是磷濃度為180 mg·L-1時的1.60倍和1.19倍，表明磷濃度較高時銻的加入對地枇杷根中磷的累積影響不大，但是其對莖和葉中磷的積累有促進作用。

A表示葉，B表示莖，C表示根。圖5 磷銻復(fù)合處理對地枇杷磷含量的影響Fig.5 Effect of phosphorus and antimony treatment on phosphorus content of Ficus tikoua

磷銻復(fù)合對地枇杷鉀含量影響如圖6所示。雖然磷處理對地枇杷葉和莖中鉀的含量影響不大，但在磷濃度為30和60 mg·L-1時，地枇杷根中鉀含量有明顯降低，而在磷濃度為180 mg·L-1時含量最高。磷銻復(fù)合處理對地枇杷葉中鉀含量影響不大，地枇杷莖中鉀的含量在磷+銻濃度為15 mg·L-1+22 mg·L-1和60 mg·L-1+22 mg·L-1時含量最低，但處理間沒有差異。地枇杷根中鉀的含量隨磷銻復(fù)合濃度增加，先增加而后減少，在磷+銻濃度為30 mg·L-1+22 mg·L-1時含量最高。與單一磷處理相比，低濃度磷銻復(fù)合會降低地枇杷葉中鉀含量，而中高濃度的磷處理下銻的加入會降低地枇杷莖中鉀的含量。同時在中低濃度的磷銻復(fù)合處理時，促進地枇杷根對鉀的吸收，在磷+銻濃度為15 mg·L-1+22 mg·L-1、30 mg·L-1+22 mg·L-1和60 mg·L-1+22 mg·L-1時對根中鉀含量有明顯促進作用。

A表示葉，B表示莖，C表示根。圖6 磷銻復(fù)合處理對地枇杷鉀含量的影響Fig.6 Effect of phosphorus and antimony treatment on potassium content of Ficus tikoua

2.5 銻含量

磷銻復(fù)合處理下地枇杷銻含量變化如圖7所示。地枇杷根中銻的含量隨磷銻復(fù)合處理濃度增加而增加，在磷+銻濃度為15 mg·L-1+22 mg·L-1、60 mg·L-1+22 mg·L-1和180 mg·L-1+22 mg·L-1時，銻的含量分別比單一銻處理時增加了17.55%、34.77%和49.85%。此外，磷銻復(fù)合處理對地枇杷莖中銻的含量影響不大，但是磷的加入會明顯降低葉中銻的含量，且處理間差別不明顯。結(jié)果表明，磷的加入能夠促進地枇杷根對銻的吸收，而限制銻在地枇杷葉中的存儲。

圖7 磷銻復(fù)合處理對地枇杷銻含量的影響Fig.7 Effect of phosphorus and antimony treatment on antimony content of Ficus tikoua

3 討論與結(jié)論

磷是植物生長發(fā)育和維持正常生理功能的重要元素之一，通常環(huán)境中磷的供應(yīng)量是植物生長發(fā)育的一種限制因素。當(dāng)磷供應(yīng)不足或過量時都會造成植物光合作用效率降低，營養(yǎng)元素的吸收利用減少等生理功能的紊亂，最終造成植物生產(chǎn)能力降低，干物質(zhì)積累減少[22]。這種不利影響不僅與磷的濃度有關(guān)，也與植物的種類有很大的關(guān)系。例如，陽顯斌等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在相同磷濃度下，磷高效品種籽粒產(chǎn)量和生物產(chǎn)量均高于磷低效基因型。青蒜苗植株鮮重、假莖長及假莖粗隨磷濃度升高呈先增大后減小規(guī)律，并在磷濃度1.5 mmol·L-1時效果最佳。本研究中，磷濃度為30 mg·L-1以下時，地枇杷莖和葉的干重較高，表明低濃度磷對地枇杷莖和葉的干物質(zhì)累積有促進作用，而高濃度的磷對地枇杷干物質(zhì)累積影響不大。當(dāng)培養(yǎng)基質(zhì)中磷元素的過量增長，會對植物產(chǎn)生毒害作用，造成膜脂過氧化作用、葉綠素含量降低、光合作用系統(tǒng)損傷等。在本研究中，高濃度磷處理會增加地枇杷葉中游離脯氨酸含量，同時激發(fā)地枇杷體內(nèi)的色素保護機制，增加類胡蘿卜素的含量。這表明雖然隨著磷元素的增加，地枇杷葉片受到過量磷的毒害作用，但地枇杷通過調(diào)節(jié)保護色素的方式來避免光合作用系統(tǒng)的損傷，從而維持正常的生理功能。不僅如此，磷的添加也會對植物體內(nèi)鉀、鈣、鋅等營養(yǎng)元素的吸收產(chǎn)生影響[2，24]。在本研究中，磷的添加不僅能夠增加地枇杷根和葉中磷的含量，而且高濃度磷對地枇杷根中鉀的吸收有促進作用。

磷銻砷屬于同一主族元素，有著類似的性質(zhì)，研究表明，當(dāng)同時存在磷銻或磷砷時，磷的添加不僅能影響植物對重金屬銻砷的吸收，也會對植物的生理活動產(chǎn)生較大影響[1，14]。本研究發(fā)現(xiàn)，銻處理中，磷的加入能夠促進地枇杷根對銻的吸收，而限制銻在地枇杷葉中的存儲。進一步表明在地枇杷體內(nèi)磷對銻的吸收存儲，不僅與元素相關(guān)，而且與植物的部位相關(guān)。銻處理下，磷的加入也會對地枇杷營養(yǎng)元素的吸收有顯著的影響，低濃度磷會增加葉片中鉀的含量，而高濃度磷對地枇杷葉和根中氮的增加有促進作用?？偟恼f來，雖然磷對銻處理下地枇杷生長有促進作用，能夠增加地枇杷根葉的干物質(zhì)累積，而且高濃度磷能夠緩解銻的毒害作用，降低脯氨酸含量，但中高濃度的磷對葉綠素a和類胡蘿卜素的合成有促進作用，而對葉綠素b的合成有抑制作用。從另一方面來說，銻能夠在一定程度上緩解過高的磷產(chǎn)生的毒害作用，降低地枇杷葉和根中脯氨酸含量，促進葉綠素a的合成，而且能夠增加地枇杷根和葉的干物質(zhì)累積。但在元素吸收積累方面，表現(xiàn)更為復(fù)雜，雖然銻的加入對磷處理下的地枇杷根中氮的積累有促進作用，但是對葉片而言，低濃度磷處理下，銻的加入反而會抑制地枇杷葉中氮、鉀的累積。