張?jiān)娡? 田新春, 花海洋, 劉洪運(yùn)

(承德醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院, 河北 承德 067000)

食管癌是常見癌癥之一,其中,食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占據(jù)了所有食管癌患者的近九成,多數(shù)患者在確診時已處于腫瘤晚期。盡管手術(shù)、化療和放療等技術(shù)不斷進(jìn)步,但ESCC患者的5年生存率仍然較低。飲酒、吸煙、賁門失弛緩癥、種族和高淀粉飲食等是ESCC發(fā)生的危險因素,至今ESCC發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚[1]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM)是腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)的重要組成部分,主要為M2表型。靶向抑制TAM浸潤在阻止腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[2]。含三聯(lián)基元25(Tripartite Motif Containing 25,TRIM25)是TRIM家族成員之一,參與發(fā)育、細(xì)胞生長、分化、腫瘤和先天免疫反應(yīng)等過程。研究結(jié)果顯示,胃癌中TRIM25表達(dá)與巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤密切相關(guān)[3]。目前,關(guān)于TRIM25與ESCC中巨噬細(xì)胞浸潤的關(guān)系還尚未見報道。另有研究證據(jù)顯示,ZEST2多梳抑制復(fù)合物2亞單位增強(qiáng)子(ehancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit,EZH2)與巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān),其可能通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化,誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4]。目前研究發(fā)現(xiàn),TRIM25通過上調(diào)EZH2表達(dá)誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥[5]。然而,目前TRIM25 與EZH2調(diào)控關(guān)系及其作用在ESCC尚不清晰,尋求新的治療靶點(diǎn)意義重大。因此,本研究旨在探討ESCC細(xì)胞中TRIM25/EZH2軸對巨噬細(xì)胞M2極化的影響及其對ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用,為明確ESCC發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制和開發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑:正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞HET-1A、ESCC細(xì)胞KYSE510和急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1均購自美國ATCC。TRIM25特異性shRNA(sh-TRIM25)和shRNA陰性對照(sh-NC)、EZH2過表達(dá)載體(oe-EZH2)和過表達(dá)載體陰性對照(oe-NC)構(gòu)建及對應(yīng)的慢病毒包裝均交由吉滿生物科技上海有限公司完成。2×SYBR Green qPCR Master Mix購自美國Bimake生物科技有限公司,TRIM25、EZH2、Arg-1和APC-F4/80抗體均購自英國Abcam公司,放線菌酮購自美國Sigma公司,FITC-CD206抗體購自美國Santa Cruz公司,CCK-8試劑盒購自奧默生物技術(shù)(上海)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及慢病毒感染:HET-1A、KYSE510和THP-1細(xì)胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞密度長至80%時,胰酶消化細(xì)胞繼續(xù)傳代。待細(xì)胞生長至對數(shù)期,將THP-1細(xì)胞、KYSE510細(xì)胞分別接種于6孔板(1×106個/孔),培養(yǎng)過夜。將KYSE510細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組(Ctrl組)、sh-NC組、sh-TRIM25組、sh-NC+oe-NC組、sh-TRIM25+oe-NC組、sh-NC+oe-EZH2組和sh-TRIM25+oe-EZH2組,用sh-NC、sh-TRIM25、oe-NC和oe-EZH2慢病毒液(MOI=20)分別感染上述KYSE510細(xì)胞。按照參考文獻(xiàn)[9],向THP-1細(xì)胞中加入100ng/mL的佛波酯處理48h,誘導(dǎo)產(chǎn)生M0巨噬細(xì)胞。將M0巨噬細(xì)胞置于Transwell小室下室,上室接種上述各組轉(zhuǎn)染處理的KYSE70細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,收集共培養(yǎng)上清液,分別命名為TAM、sh-NC+TAM、sh-TRIM25+TAM、sh-NC+oe-NC+TAM、sh-TRIM25+oe-NC+TAM、sh-NC+ oe-EZH2+TAM和sh-TRIM25+oe-EZH2+TAM。收集共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞,分別命名為Ctrl、sh-NC、sh-TRIM25、sh-NC+oe-NC、sh-TRIM25+oe-NC、sh-NC+oe-EZH2和sh-TRIM25+oe-EZH2。將KYSE510細(xì)胞接種于6孔板(1×106個/孔),培養(yǎng)過夜,棄去舊培養(yǎng)基,細(xì)胞分為Ctrl組、TAM組、sh-NC+TAM組、sh-TRIM25+TAM組、sh-NC+oe-NC+TAM組、sh-TRIM25+oe-NC+TAM組、sh-NC+oe-EZH2+TAM組和sh-TRIM25+oe-EZH2+TAM組,按照分組,將上述各組共培養(yǎng)上清液分別加入KYSE510細(xì)胞中。繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3qPCR法檢測KYSE510細(xì)胞中TRIM25和EZH2 mRNA表達(dá):收集KYSE510細(xì)胞,TRIzol法提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SYBR Green qPCR Master Mix進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。TRIM25引物序列:上游為5'-GTCTCTACCCAGAACAGTTTCC-3',下游為5'-ATCCAACACA GGCTGATTCC-3';EZH2引物序列:上游為5'-AATCAGAGTACATGCGACTGA GA-3',下游為5'-GCTGTATCCTTCGCTGTTTCC-3';GAPDH引物序列:上游為5'-GCCGGTGCTGAGTATGTC-3',下游為5'-CTTCTG GGTGGCAGTGAT。PCR反應(yīng)條件:95℃ 10min;95℃ 15s,60℃ 30s,72℃ 10s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算TRIM25和EZH2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4WB法檢測KYSE510細(xì)胞中TRIM25、EZH2和Arg-1蛋白表達(dá):收集各組KYSE510細(xì)胞,經(jīng)RIPA裂解液裂解后,收集細(xì)胞上清液進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2h,加入TRIM25抗體(1∶1 000)、EZH2抗體(1∶2 000)、Arg-1抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶2 000),4℃孵育 12h。隨后,特異性二抗(1∶5 000)作用1h,凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶,并用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.5放線菌酮(CHX)蛋白合成抑制實(shí)驗(yàn)檢測KYSE510細(xì)胞中EZH2蛋白的表達(dá):穩(wěn)定表達(dá)sh-NC和sh-TRIM25的KYSE510細(xì)胞接種于6孔板(1×106個/孔),過夜培養(yǎng)后,更換培養(yǎng)基,并添加10μg/mL CHX。分別收集0、8、12和16h后的細(xì)胞樣品,按照WB法檢測細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)。

1.6FCM檢測F4/80+CD206+巨噬細(xì)胞比例:將KYSE510細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng),收集共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞,用PBS將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107個/mL,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管,分別加入APC-F4/80抗體、FITC-CD206抗體,室溫條件下避光處理30min。PBS清洗并重懸細(xì)胞,取細(xì)胞懸液,上FCM儀檢測F4/80+CD206+巨噬細(xì)胞。

1.7CCK-8法檢測KYSE510細(xì)胞的增殖活力:KYSE510細(xì)胞接種至96孔板(1×104個/孔),共培養(yǎng)上清液處理KYSE510細(xì)胞后,按照CCK-8試劑盒說明操作,酶標(biāo)儀檢測各孔細(xì)胞在450nm處的光密度(D)值。另設(shè)置空白組(未接種細(xì)胞)用作讀值調(diào)零。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組D值-空白組D值)/(對照組D值-空白組D值)×100%,或者是細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組D值-空白組D值)/(sh-NC+oe-NC+TAM組D值-空白組D值)×100%

1.8克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測KYSE510細(xì)胞的克隆形成能力:KYSE510細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿(3×102個細(xì)胞/皿),共培養(yǎng)上清液處理KYSE510細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)2周。棄去培養(yǎng)液,PBS清洗3次。經(jīng)多聚甲醛固定,吉姆薩染色液染色,流水沖洗、干燥后,計(jì)算克隆形成數(shù)。

1.9Transwell實(shí)驗(yàn)檢測KYSE510細(xì)胞的遷移和侵襲能力:無血清培養(yǎng)基重懸KYSE510細(xì)胞后,接種至Transwell小室的上室。Transwell小室的下室加入RPMI 1640培養(yǎng)基。過夜培養(yǎng)后,取出小室,經(jīng)多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色液染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)時,除使用預(yù)鋪20%的matrigel膠Transwell小室外,其余實(shí)驗(yàn)方法同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1KYSE510細(xì)胞中TRIM25和EZH2 mRNA與蛋白均高表達(dá):qPCR法和WB法檢測結(jié)果(圖1)顯示,與HET-1A組相比,KYSE510組細(xì)胞中TRIM25和EZH2 mRNA與蛋白表達(dá)水平均顯著升高(t=6.32,P<0.01;t=5.98,P<0.01;t=6.15,P<0.01;t=5.85,P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TRIM25和EZH2 mRNA及蛋白在KYSE510細(xì)胞中高表達(dá)。

圖1 食管癌KYSE510細(xì)胞中TRIM25和EZH2 mRNA(A)和蛋白(B)的表達(dá)

2.2KYSE510細(xì)胞中TRIM25對巨噬細(xì)胞M2極化的影響:qPCR法和WB法檢測結(jié)果(圖2)顯示,與Ctrl組和sh-NC組相比,sh-TRIM25組KYSE510細(xì)胞中RIM25 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(LSD-t=5.73,P<0.01;LSD-t=5.65,P<0.01)。KYSE510細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,FCM和WB法檢測結(jié)果(圖3)顯示,與Ctrl組和sh-NC組相比,sh-TRIM25組巨噬細(xì)胞中F4/80+CD206+巨噬細(xì)胞比例和Arg-1蛋白表達(dá)明顯降低(LSD-t=3.25,P<0.01;LSD-t=3.43,P<0.01)。

圖2 qPCR法(A)和WB法(B)檢測sh-TRIM25的敲低效率

圖3 FCM(A)和WB法(B)檢測敲低TRIM25對巨噬細(xì)胞M2極化的影響

2.3TRIM25通過巨噬細(xì)胞M2極化對KYSE510細(xì)胞的影響:KYSE510細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)上清液處理KYSE510細(xì)胞,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)顯示,與Ctrl組相比,TAM組KYSE510細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(LSD-t=3.85,P<0.05;LSD-t=4.12,P<0.05;LSD-t=3.20,P<0.05;LSD-t=3.31,P<0.05);TAM組和sh-NC+TAM組兩組間KYSE510細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);與sh-NC+TAM組相比,sh-TRIM25+TAM組KYSE510細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(LSD-t=3.24,P<0.05;LSD-t=3.24,P<0.05;LSD-t=3.46,P<0.05;LSD-t=3.05,P<0.05;LSD-t=2.84,P<0.05)。

圖4 TRIM25通過巨噬細(xì)胞M2極化對KYSE510細(xì)胞的影響

2.4TRIM25介導(dǎo)EZH2蛋白穩(wěn)定性:qPCR法和WB法檢測結(jié)果(圖5)顯示,與Ctrl組和sh-NC組相比,sh-TRIM25組KYSE510細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)顯著降低(LSD-t=4.62,P<0.05;LSD-t=4.71,P<0.05)。經(jīng)CHX處理后,與sh-NC組相比,sh-TRIM25組KYSE510細(xì)胞中EZH2蛋白半衰期顯著降低(LSD-t=4.12,P<0.05;LSD-t=5.12,P<0.01)。

圖5 TRIM25介導(dǎo)EZH2蛋白的穩(wěn)定性

2.5KYSE510細(xì)胞中TRIM25/EZH2軸對巨噬細(xì)胞M2極化的影響:WB法檢測結(jié)果(圖6)顯示,與sh-NC+oe-NC組相比,sh-TRIM25+oe-NC組KYSE510細(xì)胞中TRIM25和EZH2蛋白表達(dá)均顯著降低(LSD-t=6.89,P<0.01;LSD-t=5.68,P<0.01),sh-NC+oe-EZH2組KYSE510細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),而TRIM25蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與sh-TRIM25+oe-NC組相比,sh-TRIM25+oe-EZH2組KYSE510細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)顯著升高(LSD-t=5.25,P<0.01),TRIM25蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KYSE510細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),FCM和WB法檢測結(jié)果(圖7)顯示,與sh-NC+oe-NC組相比,sh-TRIM25+oe-NC組巨噬細(xì)胞中F4/80+CD206+巨噬細(xì)胞比例和Arg-1蛋白表達(dá)均顯著降低(LSD-t=4.15,P<0.05,LSD-t=4.62,P<0.05),sh-NC+oe-EZH2組巨噬細(xì)胞中F4/80+CD206+巨噬細(xì)胞比例和Arg-1蛋白表達(dá)均顯著升高(LSD-t=4.85,P<0.05,LSD-t=4.52,P<0.05);與sh-TRIM25+oe-NC組相比,sh-TRIM25+oe-EZH2組巨噬細(xì)胞中F4/80+CD206+巨噬細(xì)胞比例和Arg-1蛋白表達(dá)明顯升高(LSD-t=3.37,P<0.05,LSD-t=3.95,P<0.05)。

圖6 WB法檢測KYSE510細(xì)胞中TRIM25和 EZH2蛋白表達(dá)

圖7 KYSE510細(xì)胞中TRIM25對巨噬細(xì)胞M2極化的影響

2.6TRIM25/EZH2軸通過巨噬細(xì)胞M2極化對KYSE510細(xì)胞的影響:用KYSE510細(xì)胞與M0巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)上清液處理KYSE510細(xì)胞后,CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖8)顯示,與sh-NC+oe-NC+TAM組相比,sh-TRIM25+oe-NC+TAM組KYSE510細(xì)胞增殖活力、克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(LSD-t=4.12,P<0.05,LSD-t=4.35,P<0.05,LSD-t=4.56,P<0.05),sh-NC+oe-EZH2+TAM組KYSE510細(xì)胞增殖活力、克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(LSD-t=4.85,P<0.05,LSD-t=5.02,P<0.05,LSD-t=5.13,P<0.05);與sh-TRIM25+oe-NC+TAM組相比,sh-TRIM25+oe-EZH2+TAM組KYSE510細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(LSD-t=4.02,P<0.05,LSD-t=4.08,P<0.05,LSD-t=4.11,P<0.05)。

圖8 TRIM25/ EZH2軸通過巨噬細(xì)胞M2極化對KYSE510細(xì)胞的影響

3 討 論

ESCC的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多基因變化、多階段的綜合過程[6]。腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞作為TME的主要組成部分,對腫瘤的進(jìn)展、治療和預(yù)后有重要影響[7]。近年來,越來越多的研究關(guān)注免疫微環(huán)境對抗腫瘤免疫的調(diào)控作用,但對ESCC免疫細(xì)胞浸潤的調(diào)控機(jī)制卻知之甚少。因此,還需繼續(xù)探究ESCC免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)分子機(jī)制,以期為開發(fā)新的臨床治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

免疫細(xì)胞浸潤包括TAM,它們產(chǎn)生各種血管生成、免疫抑制和生長相關(guān)的因子,從而促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[8]。巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的表型異質(zhì)性,可分為M1型和M2型,前者以分泌促炎細(xì)胞因子為特征,后者有助于產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。在腫瘤發(fā)展的最初階段,TAM表現(xiàn)為M1表型,而在腫瘤進(jìn)展的后期,它們則向M2表型極化[9]。研究結(jié)果表明,ESCC中M2巨噬細(xì)胞可通過分泌Arg1、IL-10和TGF-β增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[10]。目前,關(guān)于ESCC中M2巨噬細(xì)胞形成的相關(guān)分子機(jī)制仍需繼續(xù)研究。TRIM25是TRIM蛋白家族的成員,參與多種類型腫瘤的進(jìn)展,是癌癥中的重要促癌因子。TRIM25除了對腫瘤細(xì)胞本身的調(diào)控作用外,還與巨噬細(xì)胞浸潤相關(guān),可調(diào)控巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答[11]。本研究結(jié)果顯示,TRIM25在ESCC細(xì)胞中表達(dá)升高。敲低TRIM25后可抑制與ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)的M0巨噬細(xì)胞向M2表型極化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲低TRIM25通過抑制M0巨噬細(xì)胞向M2表型極化,抑制ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。該研究結(jié)果表明,敲低TRIM25通過抑制巨噬細(xì)胞M2極化在ESCC中發(fā)揮抗腫瘤作用。

EZH2是多克隆阻遏復(fù)合體的一個組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶亞單位,在多種類型腫瘤中反復(fù)突變或過表達(dá)[12]。EZH2在食管癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),其高表達(dá)促進(jìn)了食管癌的進(jìn)展。5-FU通過下調(diào)EZH2表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示,EZH2在ESCC細(xì)胞中表達(dá)升高。值得注意的是,EZH2是巨噬細(xì)胞激活的關(guān)鍵介質(zhì),EZH2的缺失有可能阻止巨噬細(xì)胞依賴性疾病的發(fā)展[14]。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)EZH2可促進(jìn)與ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)的M0巨噬細(xì)胞向M2表型極化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)EZH2通過促進(jìn)M0巨噬細(xì)胞向M2表型極化,促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。該研究結(jié)果表明,EZH2通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化在ESCC中發(fā)揮促腫瘤作用。另外,已有研究證據(jù)[7]顯示,TRIM25通過上調(diào)EZH2表達(dá)參與癌細(xì)胞化療耐藥性的形成。本研究結(jié)果顯示,敲低TRIM25對EZH2 mRNA表達(dá)無明顯影響,但可降低EZH2蛋白半衰期,導(dǎo)致EZH2蛋白穩(wěn)定性降低。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)EZH2可逆轉(zhuǎn)sh-TRIM25對巨噬細(xì)胞M2極化的影響,導(dǎo)致M2巨噬細(xì)胞比例升高,最終導(dǎo)致ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力升高。該研究結(jié)果表明,敲低TRIM25通過下調(diào)EZH2蛋白穩(wěn)定性,抑制巨噬細(xì)胞M2極化,在ESCC中發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述,TRIM25和EZH2在ESCC細(xì)胞中高表達(dá),TRIM25通過促進(jìn)EZH2蛋白的穩(wěn)定性,上調(diào)EZH2蛋白表達(dá),誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化,從而促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此研究為揭示ESCC相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的分子機(jī)制及挖掘新的臨床治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。