鄭鴻銘，胡芝凡，黃夢(mèng)芬，陳明榆，李逸婷，繆濤聲，莫喬蘭，邱澤鑫，陳斌

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科，廣州 510000）

重癥肌無力是由自身抗體介導(dǎo)的，累及神經(jīng)肌肉接頭突觸的獲得性自身免疫疾病[1]。本病可累及全身骨骼肌，常表現(xiàn)為上瞼下垂、復(fù)視、構(gòu)音障礙、吞咽困難、呼吸困難等癥狀，具有病程長、病情重、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，住院病死率可達(dá)到14.69‰[2]。目前西醫(yī)治療以膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、生物制劑、免疫球蛋白、血漿置換、切除胸腺等治療為主，然而長期用藥可能會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿受體破壞、膽堿能危象、免疫力低下等問題，血漿置換及免疫球蛋白等治療也存在著較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等問題[3-5]。中醫(yī)藥治療重癥肌無力方面有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)及研究基礎(chǔ)，具有療效持久，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)小，不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)，其在重癥肌無力治療中的地位越發(fā)得到重視。中藥復(fù)方專利及中藥復(fù)方臨床研究作為眾多臨床醫(yī)師長期實(shí)踐總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，具有較強(qiáng)的實(shí)用性及可重復(fù)性[6-7]。因此本研究通過數(shù)據(jù)挖掘探討中國專利公布公告數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)及萬方數(shù)據(jù)庫中的中藥復(fù)方治療重癥肌無力的用藥規(guī)律，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析核心藥物組合治療重癥肌無力的作用機(jī)制，以期能為中藥復(fù)方治療重癥肌無力提供組方及研究思路。

1 材料與方法

1.1 治療重癥肌無力中藥復(fù)方檢索 檢索國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局中國專利公布公告數(shù)據(jù)庫（http：//epub.cnipa.gov.cn/）截止至2023 年4 月20 日的專利數(shù)據(jù)，檢索專利類型為“發(fā)明授權(quán)”及“發(fā)明公布”，在文本名稱及摘要說明中分別以 “中藥and 重癥肌無力”“草藥and 重癥肌無力”進(jìn)行查詢，同時(shí)以“中醫(yī)藥”“中醫(yī)”“法”“方”“重癥肌無力”及“痿證”作為檢索主題詞，檢索中國知網(wǎng)及萬方數(shù)據(jù)庫從建庫以來至2023 年4 月20 日所有有關(guān)中藥復(fù)方治療重癥肌無力的期刊論文及學(xué)位論文，根據(jù)嚴(yán)格的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)對(duì)查詢及檢索結(jié)果進(jìn)行錄入整理。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 中藥復(fù)方納入標(biāo)準(zhǔn) 專利中藥復(fù)方：1）檢索國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局中國專利公布公告數(shù)據(jù)庫獲取的用于治療重癥肌無力的口服中藥復(fù)方專利，不限制藥物劑型，不限制眼肌型及全身型。2）專利適應(yīng)證中包含重癥肌無力的口服中藥復(fù)方。3）專利摘要內(nèi)容中說明可治療重癥肌無力的中藥復(fù)方。

文獻(xiàn)中藥處方：1）研究對(duì)象：用于治療重癥肌無力的中藥復(fù)方，藥味組成明確，不限制藥物劑型，不限制眼肌型及全身型，所納入研究中的患者均確診為重癥肌無力，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國重癥肌無力診斷和治療指南》[4]。2）研究類型：隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)、隊(duì)列研究、描述性研究。3）結(jié)局指標(biāo)：納入研究具有臨床療效評(píng)定等結(jié)局指標(biāo)，結(jié)局明確中藥復(fù)方對(duì)重癥肌無力有治療效果。4）以同一中藥復(fù)方組成進(jìn)行不同研究時(shí)僅保留一次。

1.2.2 中藥復(fù)方排除標(biāo)準(zhǔn) 專利中藥復(fù)方：1）非口服或僅可外用治療重癥肌無力的中藥復(fù)方專利。2） 專利處方藥物在專利摘要中未說明或未完全展示。3）用于重癥肌無力并發(fā)癥治療的中藥復(fù)方專利。4）僅含中藥提取物或中西藥合并使用的復(fù)方專利。5）以不同制劑類型相同處方內(nèi)容重復(fù)發(fā)表的專利。

文獻(xiàn)中藥處方：1）不以重癥肌無力為唯一治療對(duì)象。2）研究類型無法確認(rèn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、綜述、專家共識(shí)、會(huì)議報(bào)道等。3）無法獲取全文或藥物組方不明確。

1.3 中藥復(fù)方數(shù)據(jù)錄入與規(guī)范 將篩選后符合納入標(biāo)準(zhǔn)的中藥復(fù)方錄入Excel 2016，數(shù)據(jù)規(guī)范化處理參照2020 年版《中華人民共和國藥典》及《中華本草》。對(duì)中藥名稱進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范，如“山芋肉”規(guī)范為“山茱萸”，“丹皮”規(guī)范為“牡丹皮”，規(guī)范道地名稱，如“淮山”錄入為“山藥”。數(shù)據(jù)錄入由兩名研究人員分別獨(dú)立進(jìn)行，對(duì)錄入結(jié)果不一致處查詢?cè)瓕＠麅?nèi)容及文獻(xiàn)內(nèi)容后討論統(tǒng)一。

1.4 中藥復(fù)方數(shù)據(jù)分析 將規(guī)范化錄入后的中藥復(fù)方數(shù)據(jù)導(dǎo)入R 語言（4.2.0 版本），利用itemFrequency函數(shù)統(tǒng)計(jì)高頻中藥，進(jìn)行可視化處理，利用apriori 函數(shù)分析關(guān)聯(lián)規(guī)則，設(shè)置最小支持度為0.22，最小置信度為0.8，然后利用plot 函數(shù)對(duì)繪制點(diǎn)圖、分組矩陣圖及網(wǎng)狀圖對(duì)關(guān)聯(lián)規(guī)則進(jìn)行可視化處理；利用Excel 2016 對(duì)錄入中藥的四氣五味、歸經(jīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析繪制雷達(dá)圖，利用IBM SPSS Modeler 軟件進(jìn)行復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，利用SPSS 進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，繪制聚類分析譜系圖，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果對(duì)用藥規(guī)律進(jìn)行分析。

1.5 核心藥對(duì)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 綜合高頻藥物統(tǒng)計(jì)、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、聚類分析及中醫(yī)藥理論，獲得核心藥物組合進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/index.php） 檢索核心藥物組合藥物成分及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，以口服生物利用度≥30%，藥物相似度≥0.18 作為篩選條件，利用Uniprot（Universal Protein）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將篩選獲得的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化處理，從人類基因數(shù)據(jù)庫、疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（DisGeNET）、藥物數(shù)據(jù)庫（Drugbank）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）、TTD 數(shù)據(jù)庫獲取重癥肌無力相關(guān)靶點(diǎn)，利用R 語言ggplot2 包將篩選獲得的藥物組合靶點(diǎn)與重癥肌無力靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖。將交集靶點(diǎn)提交至STRING（https：//cn.string-db.org/）平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析，利用Cytoscape 3.7.0 Network Analysis 分析并可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，利用Metascape 數(shù)據(jù)庫對(duì)核心藥物組合與重癥肌無力靶點(diǎn)共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）及京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，利用氣泡圖可視化分析結(jié)果。

1.6 分子對(duì)接 根據(jù)中藥復(fù)方藥物組合活性成分-重癥肌無力-通路網(wǎng)絡(luò)及PPI 網(wǎng)絡(luò)模型獲取的核心藥物成分及靶點(diǎn)信息，利用Chem3D MM2 進(jìn)行能量最小化結(jié)構(gòu)優(yōu)化，利用PyMOL 軟件移除水分子、配體、無機(jī)鹽等，通過Autodock 軟件對(duì)篩選出的核心藥物成分及核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接預(yù)測(cè)，利用PyMOL 對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，并通過R 語言pheatmap 包繪制結(jié)合能熱圖。

2 結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方的數(shù)據(jù)挖掘

2.1.1 高頻中藥類別及頻數(shù)、頻率分析 根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后共納入專利63 條，文獻(xiàn)162 篇，共涉及中藥復(fù)方151 條，其中復(fù)方專利處方60 條，文獻(xiàn)報(bào)道中藥復(fù)方91 條，中藥352 味，共計(jì)用藥頻數(shù)1 759 次，通過R 4.2.0 統(tǒng)計(jì)高頻中藥得到高頻中藥（使用頻率≥10%，即使用頻數(shù)≥15 次）共26 味，其中黃芪（121 次，80.13%）、白術(shù)（93 次，61.59 %）、當(dāng)歸（84 次，55.63%）、升麻（78 次，51.66%）、黨參（66 次，43.71%），柴胡（65 次，43.05%），高頻中藥類別及頻數(shù)、置信度、頻率見表1。

表1 中藥復(fù)方治療重癥肌無力高頻藥物（頻數(shù)≥15 次）藥物類別、頻次、頻率情況Tab.1 The TCMs category，count and frequency of Chinese medicine compound for the treatment of myasthenia gravis high frequency drugs (frequency≥15)

2.1.2 四氣五味及歸經(jīng)分析 處方納入的352 味中藥的四氣以溫性藥（115 次，34.3%）為主，其次是平性藥（92 次，27.5%）；五味以甘味（179 次，34.7%）為主，其次為苦味（154 次，29.8%），四氣五味雷達(dá)圖見圖1。歸經(jīng)以肝經(jīng)（161 次，22.0%）為主，其次為腎經(jīng)（120 次，16.4%），歸經(jīng)旭日?qǐng)D見圖2。

圖1 四氣五味雷達(dá)圖Fig.1 The radar map for four natures and five flavors of drugs

圖2 歸經(jīng)旭日?qǐng)DFig.2 Sunburst chart of channel tropism

2.1.3 中藥復(fù)方關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 使用IBM SPSS Modeler 18.0 對(duì)納入的352 味中藥進(jìn)行復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖見圖3，線條越粗表示支持度越大，使用R 4.2.0 Apriori 函數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置最小支持度0.25，最小置信度0.9，共篩選得出中藥復(fù)方治療重癥肌無力核心藥對(duì)76 項(xiàng)，包括中藥7 味：柴胡、當(dāng)歸、黃芪、黨參、白術(shù)、升麻、陳皮。結(jié)果按支持度降序排序，見表2-表5，其中白術(shù)=>黃芪頻數(shù)最高，為87 次，繪制高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)狀圖，箭頭代表相互關(guān)聯(lián)，點(diǎn)大小代表置信度，點(diǎn)顏色越深代表提升度越高，見圖4。

圖3 復(fù)方中藥治療重癥肌無力復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Association network display of TCMs in treatment of myasthenia gravis

圖4 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)狀圖Fig.4 Network diagram of high frequency TCMs association rules

表2 治療重癥肌無力復(fù)方中藥的二項(xiàng)關(guān)聯(lián)規(guī)則Tab.2 Binomial association rules of TCMs compound for myasthenia gravis

表3 治療重癥肌無力復(fù)方中藥的三項(xiàng)關(guān)聯(lián)規(guī)則（支持度前10 位）Tab.3 Trinomial association rules of TCMs compound for myasthenia gravis(top 10 in support)

表4 治療重癥肌無力復(fù)方中藥的四項(xiàng)關(guān)聯(lián)規(guī)則（支持度前10 位）Tab.4 Quadrinomial association rules of TCMs compound for myasthenia gravis(top 10 in support)

表5 治療重癥肌無力復(fù)方中藥的五項(xiàng)關(guān)聯(lián)規(guī)則Tab.5 Pentavalent association rules of TCMs compound for myasthenia gravis

2.1.4 中藥復(fù)方高頻中藥聚類分析 利用SPSS 25.0 對(duì)34 味治療重癥肌無力中藥復(fù)方中的高頻中藥進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，最小聚類數(shù)設(shè)置為5，最大聚類數(shù)設(shè)置為10，測(cè)量區(qū)間采用皮爾森（Pearson）相關(guān)性，見圖5。設(shè)置Pearson 相關(guān)性為20，可分為7 類，T1：升麻、柴胡、白術(shù)、黨參、黃芪、當(dāng)歸、陳皮、甘草、巴戟天；T2：枸杞子、丹參；T3：杜仲、牛膝、山茱萸、山藥、熟地黃、茯苓、菟絲子；T4：川芎、白芍、炙甘草；T5：葛根、地龍；T6：人參；T7：淫羊藿、生地黃。

圖5 高頻藥物聚類分析Fig.5 Cluster analysis of high-frequency TCMs

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 中藥復(fù)方藥物組合及重癥肌無力靶點(diǎn)篩選綜合高頻藥物統(tǒng)計(jì)、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、聚類分析及中醫(yī)藥理論，最終選擇核心藥物組合“柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”進(jìn)一步探索中藥復(fù)方治療重癥肌無力的作用機(jī)制。篩選后獲取的柴胡、當(dāng)歸、黃芪、黨參、白術(shù)、升麻活性成分各17、2、20、21、7、17 個(gè)，根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)，去除重復(fù)項(xiàng)后，最終納入藥物活性成分55 個(gè)，去除重復(fù)項(xiàng)后，最終納入活性成分靶點(diǎn)257 個(gè)。從Genecards、DisGeNET、Drugbank、OMIM、TTD 數(shù)據(jù)庫獲取重癥肌無力相關(guān)靶點(diǎn)各839、336、14、33、7 個(gè)，合并去除重復(fù)項(xiàng)后獲得疾病靶點(diǎn)995 個(gè)。

2.2.2 中藥復(fù)方藥物組合—重癥肌無力靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用R 語言ggplot2 包將篩選獲得的 “柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”藥物組合靶點(diǎn)與重癥肌無力靶點(diǎn)取交集，獲得共同靶點(diǎn)64 個(gè)，繪制韋恩圖見圖6。PPI 網(wǎng)絡(luò)模型中節(jié)點(diǎn)大小代表連接度，邊的粗細(xì)代表相互作用強(qiáng)度，見圖7。64 個(gè)靶點(diǎn)共存在776 項(xiàng)相互關(guān)聯(lián)，其中節(jié)點(diǎn)平均連接度為24.25，平均介度為0.013，平均緊密度為0.587，連接度、介度、緊密度均大于平均值的核心靶點(diǎn)有14 個(gè)，按連接度從大到小排列依次為蛋白激酶B1（AKT1）、表皮生長因子受體（EGFR）、原癌基因FOS（FOS）、原癌基因JUN（JUN）、原癌基因MYC（MYC）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤抑制蛋白（TP53）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、雌激素受體（ESR1）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2），提示這些靶點(diǎn)可能為 “柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”治療重癥肌無力的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖6 藥物組合-重癥肌無力靶點(diǎn)韋恩圖Fig.6 Venn diagram of drug combination and myasthenia gravis targets

圖7 藥物組合-重癥肌無力靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 PPI network of drug combination and myasthenia gravis targets

2.2.3 KEGG 及GO 富集分析 利用Metascape 數(shù)據(jù)庫對(duì)“柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”藥物組合與重癥肌無力靶點(diǎn)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，包括分子功能（MF）、生物過程（BP）及細(xì)胞成分（CC）并進(jìn)行KEGG 富集分析，設(shè)定P<0.01，選取P值排名前20 位的功能信息，繪制氣泡圖進(jìn)行可視化處理。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，“柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”藥物組合參與治療重癥肌無力的信號(hào)通路主要包括白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)通路、Toll 樣受體（TLR）信號(hào)通路、輔助性T 細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞分化信號(hào)通路、C-型凝集素受體（CLR）信號(hào)通路，詳見圖8。

圖8 KEGG 富集分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG enrichment analysis

GO 富集分析結(jié)果顯示相關(guān)靶點(diǎn)參與的生物過程主要包括蛋白質(zhì)磷酸化正向調(diào)節(jié)、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)正向調(diào)控、對(duì)生長因子的響應(yīng)、對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)等；主要參與的細(xì)胞成分包括膜筏、突觸后膜、受體復(fù)合體、基底外側(cè)質(zhì)膜等，主要參與分子功能包括磷酸酯水解酶活性、作用于酯鍵的水解酶活性、血清素受體活性、G蛋白偶聯(lián)血清素受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性參與突觸后膜電位的調(diào)節(jié)、G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等，詳見圖9。

圖9 GO 富集分析氣泡圖Fig.9 Bubble diagram of GO enrichment analysis

2.2.4 中藥復(fù)方藥物組合活性成分-重癥肌無力-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.0 構(gòu)建 “藥物組合活性成分—重癥肌無力—通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖10，結(jié)果提示共124 個(gè)節(jié)點(diǎn)，產(chǎn)生662 項(xiàng)關(guān)聯(lián)，55 個(gè)藥物活性成分的平均連接度為8.2，平均介度為0.007，平均緊密度為0.384，連接度越大表示相互作用的靶點(diǎn)越多，提示該藥物活性成分在“活性成分-重癥肌無力-通路網(wǎng)絡(luò)”中處于核心位置，按連接度降序排列篩選出核心藥物活性成分見表6，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、甲氧異黃酮、異鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇、毛蕊異黃酮、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、大豆黃素、（6aR，11aR）- 3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷、齒阿米醇等。

圖10 藥物組合活性成分—重癥肌無力—通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.10 Network diagram of drug combination-myasthenia gravis-pathway

表6 核心藥物成分表Tab.6 Core drug composition table

2.2.5 分子對(duì)接結(jié)果 利用Autodock 軟件對(duì)“藥物組合活性成分—重癥肌無力—通路”網(wǎng)絡(luò)及PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選出的連接度大于平均連接度的核心藥物成分（共10 個(gè)）及前10 位核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接預(yù)測(cè)，得到藥物關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能結(jié)果，見圖11，最低結(jié)合能越低代表結(jié)合能力越強(qiáng)，對(duì)接結(jié)果提示，平均分子對(duì)接結(jié)合能為-6.23 kcal/mol，提示核心藥物成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接穩(wěn)定，結(jié)合能最低的分子對(duì)接為7-O-甲基異微凸劍葉莎醇與EGFR，其分子對(duì)接圖見圖12。EGFR 抑制劑吉非替尼與EGFR 靶點(diǎn)的分子對(duì)接見圖13。

圖11 分子對(duì)接結(jié)合能熱圖Fig.11 Heat map of molecular docking binding energy

圖12 7-O-甲基異微凸劍葉莎醇與EGFR 分子對(duì)接圖Fig.12 Molecular docking diagram of 7-Omethylisomucronulatol and EGFR

圖13 吉非替尼與EGFR 分子對(duì)接圖Fig.13 Molecular docking diagram of Gefitinib and EGFR

3 討論

3.1 中藥復(fù)方治療重癥肌無力的用藥規(guī)律 中醫(yī)典籍中暫無“重癥肌無力”病名，現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)其臨床表現(xiàn)，將其歸為“痿證”“瘖痱”“虛勞病”等范疇[8]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問》 中最早闡述了痿證的病因病機(jī)“五臟使人痿……肺主身之皮毛，心主身之血脈，肝主身之筋膜，脾主身之肌肉，腎主身之骨髓，故肺熱葉焦，則皮毛虛弱急薄，著則生痿躄也”[9]。目前重癥肌無力的中醫(yī)辨證分型尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各個(gè)醫(yī)家對(duì)本病辨治也存在不同的學(xué)術(shù)思想。國醫(yī)大師鄧鐵濤教授提出重癥肌無力“脾胃虛損，五臟相關(guān)”理論，辨證為脾胃虛損證，治療上“重補(bǔ)脾胃，益氣升陷，兼治五臟”[10]。中國中醫(yī)科學(xué)院周紹華教授將重癥肌無力分為肝腎虧虛、中氣不足、脾腎陽虛、元?dú)馑? 型[11]。劉亞軍等[12]通過回顧性分析發(fā)現(xiàn)重癥肌無力歸以脾氣虛弱證、肝腎不足證及脾腎兩虛證多見。劉小斌教授[13]提出多病因致病理論，重癥肌無力發(fā)病可歸于先天稟賦不足，或后天失調(diào)，或情志失司等所致，治療上以峻補(bǔ)脾胃、益氣升陷為治療大法，兼以補(bǔ)益肝腎。本研究通過對(duì)中國專利公布公告數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)及萬方數(shù)據(jù)庫的檢索，納入治療重癥肌無力中藥處方60 條，中藥352 味。數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)重癥肌無力中藥復(fù)方所使用的藥物多歸肝、腎經(jīng)，重癥肌無力患者常見眼肌受累，肝開竅于目，肝虛則目不得精氣濡養(yǎng)，故可見復(fù)視、眼瞼下垂等癥狀，肝主藏血并主一身之筋膜，血海不足則濡潤經(jīng)脈難以為繼，故出現(xiàn)晨輕暮重的波動(dòng)性疲勞[14]。腎為先天之本?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問》曰：“腎者作強(qiáng)之官，伎巧出焉?！蹦I虛則伎巧不出，痿軟不用，可見補(bǔ)益肝腎是重癥肌無力治療中的重要方法[15]。重癥肌無力病機(jī)以虛損為主，根據(jù)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果分析中藥復(fù)方納入中藥多為補(bǔ)氣藥、補(bǔ)陰藥及補(bǔ)陽藥，符合重癥肌無力虛損的病機(jī)，性味多以甘溫為主，溫藥可以溫補(bǔ)腎陽以固先天之本，甘味藥具有補(bǔ)益和中之作用，且甘能入脾，脾主身之肌肉，甘溫之藥能健脾益氣，補(bǔ)益脾胃以充后天之本，先后天同調(diào)達(dá)到治療重癥肌無力的目的。

關(guān)聯(lián)分析共篩選得出中藥復(fù)方治療重癥肌無力核心藥對(duì)76 項(xiàng)，包括中藥7 味：柴胡、當(dāng)歸、黃芪、黨參、白術(shù)、升麻、陳皮，其中白術(shù)=>黃芪、當(dāng)歸=>黃芪頻數(shù)較高。系統(tǒng)聚類分析結(jié)果可分為7 類，分別體現(xiàn)出中醫(yī)氣血陰陽并補(bǔ)、活血通經(jīng)、舒筋通絡(luò)、補(bǔ)益肝腎、溫腎助陽等治法，T1 聚類方升麻、柴胡、白術(shù)、黨參、黃芪、當(dāng)歸、陳皮、甘草、巴戟天以補(bǔ)中益氣湯加巴戟天，重補(bǔ)脾胃，益氣升陷，兼以補(bǔ)腎助陽；T3 聚類杜仲、牛膝、山茱萸、山藥、熟地黃、茯苓、菟絲子聚類方為經(jīng)方六味地黃丸加減，體現(xiàn)補(bǔ)腎填精以固先天之本的治療思想；T4 聚類川芎、白芍、炙甘草為四物湯加減，體現(xiàn)重癥肌無力治療中補(bǔ)血以潤宗筋的治療思想；T6 聚類單藥人參補(bǔ)脾益氣，生津養(yǎng)血，上述聚類結(jié)果契合了重癥肌無力虛損為本的病機(jī)，體現(xiàn)了重癥肌無力治療上重視補(bǔ)益虛損，益氣升陷，養(yǎng)血榮筋，注重肝腎、脾胃先后天同調(diào)的特點(diǎn)。

重癥肌無力屬于“痿證”范疇，早在《素問·痿論》中便提出“治痿獨(dú)取陽明”的觀點(diǎn)。脾胃為后天之根本，為水谷精微化生之源?！镀⑽刚摗酚醒裕骸胺蚱⑽刚?，倉廩之官也，屬土以滋眾臟，安谷以濟(jì)百骸，故胃于中宮，職司南政，旺于四季，體應(yīng)四肢。”[16]補(bǔ)中益氣湯出自《內(nèi)外傷辨惑論》，是補(bǔ)中益氣、升陽舉陷的千古名方。明代《保嬰撮要》中記載“若胃氣虧損，眼睫無力而不能開者，用補(bǔ)中益氣湯”[17]。多項(xiàng)臨床研究也證實(shí)補(bǔ)中益氣湯治療重癥肌無力具有良好的臨床療效，體現(xiàn)了從陽明論治痿證的學(xué)術(shù)思想[18-20]。本研究綜合高頻藥物統(tǒng)計(jì)、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、聚類分析及中醫(yī)藥理論后得出治療重癥肌無力的核心藥物組合 “柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”，與補(bǔ)中益氣湯組方思路相符合，重癥肌無力患者脾胃虛損，清陽不升，氣陷于下，故見眼瞼下垂，核心藥物組合中柴胡、升麻可升陽舉陷，恢復(fù)中焦升降之功能，使得氣機(jī)通利，氣血得以榮養(yǎng)宗筋，脾得以升清?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》提出當(dāng)歸能生血活血，又能宣通氣分，使氣分各有所歸，而黃芪既能補(bǔ)氣，又能升氣，核心藥物組合中當(dāng)歸、黃芪兩者相伍，補(bǔ)血以載氣，補(bǔ)氣以生血，氣血互生，氣得以壯，血得以旺，使重癥肌無力患者筋脈得以濡養(yǎng)，中氣得以升提[21]。黨參、白術(shù)補(bǔ)益脾胃，又可輔助黃芪以補(bǔ)中益氣，脾胃得以健運(yùn)，則氣血生化得其源，配以當(dāng)歸則可輔以補(bǔ)血和營。脾胃虧虛之病機(jī)貫穿重癥肌無力發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的始終，整體核心藥物組合組方體現(xiàn)補(bǔ)益脾胃以充后天之本，氣血雙補(bǔ)以榮養(yǎng)筋脈，符合“治痿獨(dú)取陽明”的中醫(yī)經(jīng)典理論。

3.2 核心藥物組合“柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”治療重癥肌無力的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果提示“柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”藥物組合的主要活性成分包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、甲氧異黃酮、異鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇、毛蕊異黃酮、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、大豆黃素、齒阿米醇等。其中當(dāng)歸中含有的β-谷甾醇及黨參、升麻、柴胡含有的豆甾醇屬于植物甾醇化合物，研究表明β-谷甾醇可選擇性地抑制CD4 陽性細(xì)胞（Th1）活性并促進(jìn)輔助型T 細(xì)胞2（Th2）偏倚，Th1 細(xì)胞和Th2 細(xì)胞的細(xì)胞間平衡失常與重癥肌無力的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，糾正Th1/Th2 失衡可能為重癥肌無力治療的關(guān)鍵之一[22-24]。豆甾醇可影響調(diào)節(jié)T 細(xì)胞（CD4+CD25+）的增殖水平，而胸腺來源的CD4+CD+25Tr 免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量及功能的異?？赏ㄟ^主動(dòng)調(diào)節(jié)的方式影響重癥肌無力等自身免疫病的發(fā)生發(fā)展，重癥肌無力癥狀未控制時(shí)CD4+CD+25Tr 細(xì)胞百分率明顯降低，因此推測(cè)豆甾醇可影響調(diào)節(jié)T 細(xì)胞來治療重癥肌無力[22，25-26]。白術(shù)中的3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)治療重癥肌無力的活性成分之一，研究表明蒼術(shù)酮可通過核因子-κB（NF-κB）通路抑制炎癥，抑制炎癥因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的釋放，從而進(jìn)一步參與重癥肌無力自免過程[27]。柴胡、黃芪中的槲皮素、黨參中的木犀草素等活性成分屬于黃酮類化合物，1 項(xiàng)對(duì)128 種黃酮類化合物的研究表明，黃酮類化合物具有乙酰膽堿酯酶抑制活性及抗氧化活性等[28]。重癥肌無力最主要的自身抗體為乙酰膽堿受體抗體（AChRAb），可分為毒蕈堿型受體（M 受體-G 蛋白偶聯(lián)型受體）和煙堿型受體（N受體-離子通道型受體），主要存在于突觸后膜，重癥肌無力患者中AChRAb 陽性率可達(dá)85%[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以濃度依賴的方式競(jìng)爭(zhēng)性抑制乙酰膽堿酯酶，減少乙酰膽堿水解以增加突觸間隙的乙酰膽堿水平，此外槲皮素還具有抗氧化應(yīng)激、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用，可以降低（IL-1β、IL-6 及TNF-α 等的表達(dá)，從而減輕神經(jīng)炎癥及凋亡神經(jīng)元細(xì)胞死亡[31-37]。異鼠李素可抑制IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放以抑制炎癥反應(yīng)，并能增強(qiáng)神經(jīng)突觸可塑性，用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其衍生物也具有抗乙酰膽堿酯酶活性潛力[38-40]。實(shí)驗(yàn)證明山柰酚可以降低促炎因子TNF-α、IL-1β 表達(dá)從而起到抗炎的作用，Beg 等[41-42]研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚可降低阿爾茲海默癥果蠅的氧化應(yīng)激及乙酰膽堿酯酶活性。木犀草素可通過抑制活性氧（ROS）/硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）/ NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）信號(hào)通路激活，降低血清白細(xì)胞介素-18（IL-18）、IL-1β 及TNF-α 水平，減輕炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激[43]。黃芪中的黃芪總皂苷成分，雖然非本藥物核心組合的核心藥物成分（連接度=5），但最新研究表明其可通過調(diào)控細(xì)胞因子分泌的水平，如抑制IL-1β 表達(dá)等起到神經(jīng)保護(hù)及修復(fù)的作用，其在重癥肌無力治療中的作用機(jī)制可進(jìn)一步深入研究[44]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果及上述研究闡明了核心藥物組合“柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”治療重癥肌無力具有多成分的特點(diǎn)，為研究中藥復(fù)方治療重癥肌無力的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考。

PPI 網(wǎng)絡(luò)提示，核心活性成分主要作用于AKT1、EGFR、FOS、JUN、MYC、IL6、TNF、CASP3、IL1B、CRP、TP53 等靶點(diǎn)，對(duì)疾病藥物共同靶點(diǎn)的KEGG 富集分析結(jié)果提示，核心藥物組合主要通過IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化信號(hào)通路及C-型凝集素受體信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)重癥肌無力的治療作用。肌肉特異性酪氨酸肌酶（MuSK）在突觸成熟、乙酰膽堿受體（AChR）聚集及維持神經(jīng)肌肉結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要作用，約1%～4%重癥肌無力患者血清中可檢測(cè)出MuSK 抗體[4，45]。研究表明AChR+和MuSK +MG 中血清中微小核糖核酸（miRNA）表達(dá)水平與健康對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中MuSK +MG 相關(guān)的血清miRNA（miR-151a-3p、miR-423-5p）與FOS、JUN 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)最多，相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1（AP-1）轉(zhuǎn)錄因子（FOS、JUN 等）參與了重癥肌無力相關(guān)自身免疫通路[46-47]。CASP3 可調(diào)節(jié)Ⅱ型干擾素（IIFN）信號(hào)通路，激活JAK 激酶（JAK）信號(hào)傳感器和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（STAT）途徑激活子，導(dǎo)致干擾素刺激基因（ISGs）的轉(zhuǎn)錄，從而校準(zhǔn)宿主防御，并限制組織損傷和防止自身免疫[48-49]。

多項(xiàng)研究表明，TNF 信號(hào)通路與重癥肌無力的發(fā)病相關(guān)，TNF-γ 可誘導(dǎo)T 細(xì)胞及B 細(xì)胞活化增殖，并產(chǎn)生抗乙酰膽堿受體抗體，破壞神經(jīng)肌肉接頭功能，TNF-α 可正性調(diào)節(jié)T 細(xì)胞及B 細(xì)胞的增殖分化，不同程度重癥肌無力患者血清中TNF-α 含量均高于正常對(duì)照組[50-53]。Interfinger 等[54]研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性產(chǎn)生TNF 的CD103+Th 細(xì)胞是重癥肌無力的特征性Th 細(xì)胞亞群，且與臨床疾病嚴(yán)重程度之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。體內(nèi)IL-1β 與TNF-α 相互誘導(dǎo)產(chǎn)生，IL-1β 的過表達(dá)會(huì)促進(jìn)TNF-α 表達(dá)水平，因而IL-1β 通過影響TNF 信號(hào)通路也可參與重癥肌無力自免過程[55]。研究發(fā)現(xiàn)Akt1 可通過調(diào)控磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/Akt/NF-κB 信號(hào)通路減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制Akt1 表達(dá)后TNF-α、IL-6 蛋白的表達(dá)水平顯著升高，可通過影響干擾素水平及細(xì)胞因子參與到重癥肌無力的發(fā)病過程中[56]。對(duì)重癥肌無力患者血清炎癥介質(zhì)水平及其壓力性損傷程度相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，患者血清超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均與壓力性損傷程度呈正相關(guān)[57]。

胸腺相關(guān)重癥肌無力約占重癥肌無力的10%～15%，研究表明自身免疫調(diào)節(jié)因子（Aire）表達(dá)水平與胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力存在關(guān)聯(lián)[4，58]。Bian 等[59]對(duì)于98 例胸腺瘤患者的研究表明，胸腺切除后患者TP53 水平下降，考慮TP53 為胸腺瘤預(yù)后因素，參與胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力。EGFR 為表皮生長因子受體，在胸腺瘤及胸腺癌中高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)胸腺瘤患者中EGFR 高表達(dá)者共患重癥肌無力幾率更高[60-61]。對(duì)胸腺瘤及腫瘤差異基因表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，胸腺組織中c-MYC 基因表達(dá)陽性率高于對(duì)照組[62]。因此推測(cè)中藥復(fù)方成分治療胸腺相關(guān)型重癥肌無力可通過EGFR、TP53、MYC 等相關(guān)靶點(diǎn)。分子對(duì)接結(jié)果提示藥物組合關(guān)鍵活性成分與EGFR 靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)合能最低，結(jié)合能力最強(qiáng)，其中7-O-甲基異微凸劍葉莎醇與EGFR 分子對(duì)接最低結(jié)合能為-9.5 kcal/mol（見圖12），研究表明[63]EGFR 抑制劑吉非替尼對(duì)胸腺瘤具有良好的治療作用，吉非替尼與EGFR 分子對(duì)接最低結(jié)合能為-8.9 kcal/mol （見圖13），提示藥物組合關(guān)鍵活性成分與EGFR 結(jié)合穩(wěn)定，“柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”可能通過靶向EGFR 治療胸腺相關(guān)型重癥肌無力。

Th17 細(xì)胞是一種CD4+T 細(xì)胞亞群，以特異性分泌高水平IL-17 為特征，Th17 可分泌IL-17、IL-22、IL-6 及TNF-α 等細(xì)胞因子，參與Th1/Th2 細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，促進(jìn)B 細(xì)胞合成并分泌大量自身免疫性抗體，加速重癥肌無力的發(fā)病[64-65]。p38α MAPK 可通過整合樹突狀細(xì)胞中的多種信號(hào)調(diào)節(jié)介導(dǎo)自身免疫的輔助T 細(xì)胞分化為程序化樹突狀細(xì)胞依賴的Th17 細(xì)胞[66]。Toll 樣受體（TLR）參與非特異性免疫，可影響固有免疫細(xì)胞活化，表達(dá)和分泌TNF-α、IL-12、IL-6 等促炎因子，并影響Treg 細(xì)胞向Th17 分化，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明阻斷TLR9 信號(hào)可減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力（EMAG）小鼠重癥肌無力的癥狀[67-68]。Aricha 等[69]研究發(fā)現(xiàn)，注射抗IL-6 抗體可下調(diào)EMAG 小鼠Th17 相關(guān)基因表達(dá)。C 型凝集素受體（CLR）在樹突狀細(xì)胞的攝取糖蛋白、呈遞抗原信息過程中發(fā)揮重要作用，從而調(diào)節(jié)自身免疫、感染等，CLR 與TLR 的相互作用也參與了對(duì)DC 功能的調(diào)控[70-71]。上述研究提示核心藥物成分可能通過靶向IL-6、參與MAPK 調(diào)控等作用于IL-17 信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、C 型凝集素受體信號(hào)通路從而用于治療重癥肌無力。GO 富集分析結(jié)果提示核心藥物組合可能通過參與MAPK 級(jí)聯(lián)正向調(diào)控、腺發(fā)育、對(duì)激素及活性氧的反應(yīng)等生物過程，作用于突觸后膜等細(xì)胞成分，影響G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等分子功能治療重癥肌無力。

上述研究結(jié)果共同提示了復(fù)方藥物組合 “柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”治療重癥肌無力具有多成分，多靶點(diǎn)共同作用的特點(diǎn)。分子對(duì)接結(jié)果顯示核心藥物成分與主要靶點(diǎn)的平均分子對(duì)接結(jié)合能為-6.23 Kcal/mol<-5.0 Kcal/mol，結(jié)合活性均較強(qiáng)，說明核心藥物成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接穩(wěn)定。

綜上所述，本研究通過對(duì)中藥復(fù)方治療重癥肌無力的數(shù)據(jù)挖掘，揭示了重癥肌無力先天稟賦不足，后天失調(diào)的病因，治療上重視補(bǔ)益虛損，養(yǎng)血榮筋，注重肝腎、脾胃先后天同調(diào)的用藥規(guī)律，并總結(jié)出治療重癥肌無力的核心中藥復(fù)方藥物組合“柴胡-當(dāng)歸-黃芪-黨參-白術(shù)-升麻”，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)核心藥物組合可能是通過槲皮素、木犀草素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、異鼠李素、甲氧異黃酮、β-谷甾醇、豆甾醇及毛蕊異黃酮等化合物與主要靶點(diǎn)AKT1、EGFR、FOS、JUN、MYC、IL -6、TNF、CASP3、IL -1β、CRP 的作用，并由IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化及C-型凝集素受體信號(hào)通路，通過參與腺發(fā)育，對(duì)激素及活性氧的反應(yīng)等生物過程，作用于突觸后膜等細(xì)胞成分，影響G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等分子功能，從而起到對(duì)重癥肌無力的治療作用，可為后續(xù)中藥復(fù)方治療重癥肌無力的機(jī)制研究提供思路與參考。