余玲，楊洋，段程慧，董瑞鴻，桑艷紅

（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450052）

目前糖尿病已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生問題，未來中國糖尿病患者數(shù)量將位居世界第一[1]。而糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是由糖尿病引起的主要微血管并發(fā)癥之一，也是世界上最常見的導(dǎo)致視力喪失的疾病之一，嚴(yán)重影響患者的正常生活。目前對于DR 的治療方式有基本治療、激光治療、切除術(shù)治療、藥物治療等多種手段，其中基本治療、激光治療、手術(shù)治療都有一定的治療效果，但仍存在一定的缺陷及風(fēng)險，藥物治療相對科學(xué)、保守，但是中、西藥治療各有優(yōu)劣，兩者相結(jié)合成為治療DR 的重要方向。研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬與DR 相關(guān)，在高糖環(huán)境下，視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體受損，激活線粒體自噬，導(dǎo)致線粒體能量損失加重，從而引起糖尿病視網(wǎng)膜病變[2]。而PTEN 誘導(dǎo)激酶蛋白1（PINK1）/細(xì)胞質(zhì)E3-泛素連接酶（Parkin）信號通路是線粒體自噬的關(guān)鍵通路，參與線粒體自噬過程。研究顯示，胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物可以通過抑制PINK1、Parkin 的表達(dá)減少線粒體自噬，從而對視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞起到神經(jīng)保護(hù)作用[3]。所以抑制線粒體自噬可能是治療DR的有效靶點(diǎn)。麝香保心丸是臨床治療常用的中成藥，具有芳香溫通、益氣強(qiáng)心之效，另外發(fā)現(xiàn)麝香保心丸可以改善糖尿病微循環(huán)障礙，降低血液黏度，改善紅細(xì)胞聚集度，減輕因糖尿病引起的毛細(xì)血管損壞[4]。有研究顯示，糖尿病腎?。―N）和DR 均是糖尿病并發(fā)癥，而尿微量蛋白/肌酐比值與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)，麝香保心丸可以降低尿微量蛋白/肌酐比值，預(yù)防DR、糖尿病[5]。目前還沒有關(guān)于麝香保心丸針對DR 的研究，本研究主要探索麝香保心丸對DR 大鼠線粒體自噬及PINK1/Parkin 信號通路的影響，以期為DR 的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 體質(zhì)量（200±20）g 無特定病原體（SPF）級健康雄性大鼠，90 只，購于湖北貝恩特生物科技有限公司[SCXK（鄂）2021-0027]。麝香保心丸（SBP，Z31020068）購于上海和黃藥業(yè)有限公司。雷帕霉素（S1039）購于美國Selleck 公司。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（G11120）購于北京Solarbio 公司；鏈脲佐菌素（STZ）購于美國Sigma 公司；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF，PV960）、高遷移率族蛋白1（HMGB1，PH406）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒購于上海碧云天公司；選擇性自噬接頭蛋白sequestosome-1（SQSTM1/P62，sc-48402）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ，sc-398822）、PINK1（sc-517353）、Parkin（sc-32282） 抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 DR 模型制備 適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1 周，除正常組大鼠外所有大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)14 d，然后采用一次性尾靜脈注射STZ 50 mg/kg 建立糖尿病模型[6]。于STZ 注射72 h 后測定大鼠空腹血糖（FPG），選取FPG≥16.7 mmoL/L 的大鼠作為糖尿病大鼠。繼續(xù)飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)選擇5 只大鼠進(jìn)行HE染色觀察視網(wǎng)膜病理變化，視網(wǎng)膜發(fā)生病變則表明建模成功。正常組大鼠正常飼料喂養(yǎng)，尾靜脈注射等量的生理鹽水。

1.2.2 分組處理 將大鼠隨機(jī)分為正常組（Control 組）、模型組（DR 組）、麝香保心丸低劑量組（SBP-L 組）、麝香保心丸高劑量組（SBP-H 組）、麝香保心丸高劑量+雷帕霉素組（SBP-H+RAP 組）[7-8]，每組18 只。SBP-L 組：造模成功后麝香保心丸25 mg/kg 灌胃；SBP-H 組：造模成功后麝香保心丸50 mg/kg 灌胃；SBP-H+RAP 組：造模成功后麝香保心丸50 mg/kg灌胃及雷帕霉素1 mg/kg 灌胃；正常組和模型組灌胃與SBP-L 組、SBP-H 組等量的生理鹽水，正常組、模型組、SBP-L 組、SBP-H 組灌胃與SBP-H+RAP組灌胃雷帕霉素等量的生理鹽水。麝香保心丸用生理鹽水配置成混懸液進(jìn)行灌胃，每天給藥1 次，連續(xù)12 周。

1.2.3 血糖血脂水平檢測 末次給藥結(jié)束后，用采血針對大鼠腹主動脈取血，血糖儀檢測FPG 水平，全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。

1.2.4 HE 染色 取血結(jié)束后，各組分別隨機(jī)選擇6 只大鼠處死并摘取右側(cè)眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃體，取出視網(wǎng)膜組織，生理鹽水漂洗、濾紙吸干，放入4%多聚甲醛固定，脫水、二甲苯透明，石蠟包埋切片，以備用。再將石蠟切片脫蠟復(fù)水，HE 染色，脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠視網(wǎng)膜病變情況。

1.2.5 ELISA 取腹主動脈血，離心半徑15 cm，3 000 r/min，離心10 min 后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中VEGF 水平。

1.2.6 線粒體形態(tài)觀察 每組隨機(jī)選取6 只大鼠視網(wǎng)膜組織，加入戊二醛溶液固定細(xì)胞，脫水、包埋，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，脫水、透明、封片，透射電鏡觀察線粒體形態(tài)。

1.2.7 免疫組織化學(xué) 取1.2.4 制作的石蠟切片，脫蠟復(fù)水，加SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ一抗，4 ℃孵育過夜，加二抗在室溫下孵育1 h。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，沖洗后脫水，二甲苯透明、封片，顯微鏡觀察拍照，并用Image J 軟件分析。

1.2.8 蛋白免疫印跡 選擇各組剩余的6 只大鼠，斷頸處死，迅速取出大鼠的右側(cè)眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃體，取出視網(wǎng)膜組織，生理鹽水漂洗干凈后置于離心管中，加入RIPA 裂解液裂解，電泳，并轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，含有5%脫脂奶粉封閉液封閉。加入一抗，4 ℃下孵育過夜，洗膜，加二抗室溫孵育2 h，洗膜，加ECL 孵育1 min，采集圖像并分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麝香保心丸對大鼠血糖血脂水平影響 與Control 組比較，DR 組FPG、TC、TG、LDL-C 水平顯著升高（P<0.05）；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H組FPG、TC、TG、LDL-C 水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-L 組比較，SBP-H 組FPG、TC、TG、LDL-C 水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP組FPG、TC、TG、LDL-C 水平顯著升高（P<0.05）。見表1。

表1 麝香保心丸對大鼠FPG、TC、TG、LDL-C 水平的影響（±s）Tab.1 Effects of Shexiang Baoxin Pill on levels of FPG，TC，TG and LDL-C of rats（±s）

表1 麝香保心丸對大鼠FPG、TC、TG、LDL-C 水平的影響（±s）Tab.1 Effects of Shexiang Baoxin Pill on levels of FPG，TC，TG and LDL-C of rats（±s）

注：與Control 組比較，*P<0.05；與DR 組比較，#P<0.05；與SBPL 組比較，△P<0.05；與SBP-H 組比較，▲P<0.05。

LDL-C（mmol/L）Control 組 18 8.52±0.94 1.52±0.23 0.83±0.09 0.41±0.05 DR 組 18 36.78±4.67* 4.67±0.58* 3.14±0.36* 1.89±0.24*SBP-L 組 18 27.86±3.21# 3.35±0.42# 2.32±0.25# 1.38±0.17#SBP-H 組 18 15.53±2.54#△2.19±0.35#△ 1.36±0.15#△ 0.69±0.08#△SBP-H+RAP 組 18 29.63±3.58▲ 3.86±0.51▲ 2.57±0.28▲ 1.56±0.21▲組別 動物數(shù) FPG（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）

2.2 麝香保心丸對大鼠視網(wǎng)膜病變影響 Control 組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰，細(xì)胞排列整齊有序；與Control 組比較，DR 組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，細(xì)胞排列紊亂，水腫明顯，細(xì)胞間隙變寬；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H 組視網(wǎng)膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞減少，細(xì)胞排列逐漸整齊，細(xì)胞水腫減輕，細(xì)胞形態(tài)趨于正常；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組視網(wǎng)膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞加重，細(xì)胞排列紊亂，水腫明顯。見圖1。

圖1 HE 染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜病理形態(tài)Fig.1 HE staining was used to observe the pathological morphology of retina of rats in each group

2.3 麝香保心丸對大鼠視網(wǎng)膜病變相關(guān)蛋白的影響 與Control 組比較，DR 組VEGF、HMGB1 水平顯著升高（P<0.05）；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H組VEGF、HMGB1 水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-L組比較，SBP-H 組VEGF、HMGB1 水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組VEGF、HMGB1 水平顯著升高（P<0.05）。見表2。

表2 麝香保心丸對大鼠VEGF、HMGB1 水平的影響（±s）Tab.2 Effects of Shexiang Baoxin Pill on VEGF and HMGB1 levels of rats（±s）

表2 麝香保心丸對大鼠VEGF、HMGB1 水平的影響（±s）Tab.2 Effects of Shexiang Baoxin Pill on VEGF and HMGB1 levels of rats（±s）

注：與Control 組比較，*P<0.05；與DR 組比較，#P<0.05；與SBP-L組比較，△P<0.05；與SBP-H 組比較，▲P<0.05。

組別 動物數(shù) VEGF（pg/mL） HMGB1（ng/mL）Control 組 6 85.69± 6.32 4.96±0.51 DR 組 6 263.51±20.17* 23.48±1.87*SBP-L 組 6 204.17±16.74# 17.21±1.41#SBP-H 組 6 126.45±10.13#△ 8.57±5.33#△SBP-H+RAP 組 6 187.34±14.33▲ 15.35±1.16▲

2.4 麝香保心丸對大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響 Control 組線粒體呈梭形，嵴保存完整；與Control組比較，DR 組線粒體結(jié)構(gòu)遭到破壞，線粒體腫脹明顯，形態(tài)異常；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H 組線粒體形態(tài)趨于正常，腫脹減輕；與SBP-L 組比較，SBP-H 組視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)改善更明顯；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組線粒體腫脹加重，形態(tài)異常。見圖2。

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)Fig.2 Mitochondrial structure of retinal cells of rats in each group observed by transmission electron microscopy

2.5 麝香保心丸對大鼠視網(wǎng)膜線粒體自噬相關(guān)蛋白SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ的影響 與Control 組比較，DR 組SQSTM1/P62 蛋白表達(dá)水平顯著降低，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H 組SQSTM1/P62 蛋白表達(dá)水平依次顯著升高，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與SBP-L 組比較，SBP-H 組SQSTM1/P62表達(dá)顯著升高，LC3-Ⅱ表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組SQSTM1/P62 蛋白表達(dá)水平顯著降低，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。見圖3、表3。

圖3 免疫組化檢測各組大鼠SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平Fig.3 Immunohistochemical detection of SQSTM1/P62，LC3-Ⅱprotein expression levels of rats in each group

表3 麝香保心丸對大鼠SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ蛋白的影響（±s）Tab.3 Effects of Shexiang Baoxin Pill on SQSTM1/P62，LC3-Ⅱprotein of rats（±s）

表3 麝香保心丸對大鼠SQSTM1/P62、LC3-Ⅱ蛋白的影響（±s）Tab.3 Effects of Shexiang Baoxin Pill on SQSTM1/P62，LC3-Ⅱprotein of rats（±s）

注：與Control 組比較，*P<0.05；與DR 組比較，#P<0.05；與SBPL 組比較，△P<0.05；與SBP-H 組比較，▲P<0.05。

LC3-Ⅱ（光密度值）Control 組 6 0.95±0.10 0.32±0.03 DR 組 6 0.44±0.04* 0.76±0.08*SBP-L 組 6 0.62±0.06# 0.64±0.10#SBP-H 組 6 0.87±0.09#△ 0.42±0.11#△SBP-H+RAP 組 6 0.53±0.05▲ 0.68±0.07▲組別 動物數(shù) SQSTM1/P62（光密度值）

2.6 麝香保心丸對各組大鼠PINK1/Parkin 信號通路的影響 與Control 組比較，DR 組PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與DR 組比較，SBP-L 組、SBP-H 組PINK1、Parkin 蛋白表達(dá)水平依次顯著降低（P<0.05）；與SBP-L 組比較，SBP-H組PINK1、Parkin 蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。與SBP-H 組比較，SBP-H+RAP 組PINK1、Parkin 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。見圖4、表4。

圖4 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠PINK1、Parkin蛋白表達(dá)Fig.4 Western Blot analysis of PINK1 and Parkin protein expression of rats in each group

表4 麝香保心丸對大鼠PINK1、Parkin 蛋白的影響（±s）Tab.4 Effects of Shexiang Baoxin Pill on PINK1 and Parkin proteins of rats（±s）

表4 麝香保心丸對大鼠PINK1、Parkin 蛋白的影響（±s）Tab.4 Effects of Shexiang Baoxin Pill on PINK1 and Parkin proteins of rats（±s）

注：與Control 組比較，*P<0.05；與DR 組比較，#P<0.05；與SBP-L組比較，△P<0.05；與SBP-H 組比較，▲P<0.05。

組別 動物數(shù) PINK1 Parkin Control 組 6 0.63±0.07 0.43±0.04 DR 組 6 1.25±0.13* 1.06±0.11*SBP-L 組 6 1.05±0.12# 0.81±0.10#SBP-H 組 6 0.68±0.09#△ 0.35±0.07#△SBP-H+RAP 組 6 1.17±0.12▲ 0.77±0.10▲

3 討論

DR 主要是由于高血糖及胰島素信號通路缺陷造成多種病理性并發(fā)癥，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管缺陷及神經(jīng)視網(wǎng)膜功能障礙[9]。其中高血糖是引起DR根本原因。研究顯示麝香保心丸具有降血糖、血脂功效[10]。本研究發(fā)現(xiàn)麝香保心丸可以降低DR 大鼠體內(nèi)FPG、TC、TG、LDL-C 水平，保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，減輕細(xì)胞水腫，穩(wěn)定細(xì)胞形態(tài)。另外，VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的促有絲分裂素，特異性地作用于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，高糖可引起VEGF 過表達(dá)，從而增加血管的滲透性，導(dǎo)致血管異常生長，而抑制VEGF 的表達(dá)可以保護(hù)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞，防止微血管發(fā)生病變[11-12]。HMGB1 作為晚期炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血管新生等過程，高糖刺激視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中HMGB1 過表達(dá)，抑制HMGB1 表達(dá)可以減輕DR，保護(hù)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞[13]。本研究結(jié)果顯示，麝香保心丸可以降低VEGF、HMGB1 水平，說明麝香保心丸可以保護(hù)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞，可以用于治療糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變。

自噬是一種基因調(diào)控的程序性細(xì)胞代謝過程，它可以將對細(xì)胞有害無用的蛋白質(zhì)及受損功能失調(diào)的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到溶酶體，然后進(jìn)行功能性降解以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[11]。線粒體自噬也是自噬的一種，可以降解受損的線粒體及調(diào)控線粒體總體質(zhì)量，從而調(diào)控細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。然而在能量需求高的細(xì)胞中，過度的線粒體自噬可能導(dǎo)致剩余線粒體能量的損失，從而引起細(xì)胞死亡[12]。研究顯示，降低線粒體自噬，可以緩解線粒體形態(tài)惡化，防止糖尿病患者視網(wǎng)膜神經(jīng)性退變[13]。另外有研究顯示，抑制LC3 的表達(dá)，促進(jìn)SQSTM1/P62 的表達(dá)可以抑制腦組織的自噬水平，從而緩解腦組織損傷，降低腦組織凋亡程度[14]。LC3是自噬相關(guān)蛋白標(biāo)志物，自噬發(fā)起時，胞漿型LC3-Ⅰ可以酶解一小段多肽形成自噬體LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值大小可用于評估自噬水平高低。SQSTM1/P62 是一種與LC3-Ⅱ相互作用的銜接蛋白，在自噬的過程中可以被降解[15]。本研究顯示，DR 大鼠SQSTM1/P62蛋白表達(dá)水平降低，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高，線粒體自噬能力增強(qiáng)，麝香保心丸可以上調(diào)SQSTM1/P62 表達(dá)，下調(diào)LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，抑制DR 大鼠線粒體自噬。

PINK1/Parkin 信號通路是迄今為止研究最多的線粒體自噬機(jī)制之一，也是神經(jīng)退行性疾病中研究最廣泛的自噬機(jī)制之一[16]。PINK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，負(fù)責(zé)激活并將Parkin 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到受損的線粒體。Parkin 是一種胞質(zhì)E3-泛素連接酶，主要位于胞漿[17]。當(dāng)線粒體受損時，PINK1 迅速聚集在線粒體外膜，促使Parkin 磷酸化，然后與SQSTM1、LC3B 反應(yīng)將泛素化線粒體傳遞到自噬小體中，形成線粒體自噬小體，從而清除受損的線粒體[18-20]。有研究顯示，黃芪丹參湯通過抑制PINK1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬保護(hù)糖尿病引起的腎損傷[21]。另外有研究顯示，PTEN-L 可以抑制PINK1/Parkin 信號通路從而減少線粒體自噬，達(dá)到維持線粒體穩(wěn)態(tài)目的[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，DR 大鼠PINK1、Parkin 表達(dá)上調(diào)，線粒體自噬能力增強(qiáng)，麝香保心丸可以下調(diào)PINK1、Parkin 表達(dá)，降低線粒體自噬能力，從而保護(hù)DR，自噬激活劑可逆轉(zhuǎn)麝香保心丸的作用，證明麝香保心丸可以通過抑制PINK1/Parkin 信號通路抑制DR大鼠線粒體自噬。

綜上所述，麝香保心丸可以通過抑制PINK1/Parkin 信號通路抑制DR 大鼠線粒體自噬。但本研究尚存在局限性，線粒體自噬具有雙重作用機(jī)制，在DR 中發(fā)揮的作用機(jī)制還尚不明確，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。