吳亞輝 ，羅龍龍*，張冉

（1. 湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410205；2. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所重大疫情應(yīng)急防控藥物研究室，北京 100850）

近年來，隨著抗體制備技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟以及抗體在臨床應(yīng)用過程中突出的療效，治療性抗體藥物被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤、免疫性疾病、感染性疾病和心血管疾病等治療領(lǐng)域[1]。據(jù)統(tǒng)計，截至2023年7月20日，全球已上市及在研抗體藥物（含生物類似藥）共計6367個，其中占比最多的是傳統(tǒng)免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體，其次是抗體-藥物偶聯(lián)物（antibodydrug conjugates，ADCs）、雙特異性抗體（bispecific antibody，BsAb）和小分子抗體[2]。與此同時，全球治療性抗體藥物的市場份額也一直處在快速增長過程中，從1997年的3億美元增長至2022年的2200億美元。因此，對治療性抗體藥物的研發(fā)和性能優(yōu)化是目前國際創(chuàng)新型新藥開發(fā)的熱點之一。

在對治療性抗體藥物的研究過程中，不僅需要考慮其與抗原結(jié)合的特異性、免疫原性和自身理化性質(zhì)等問題[3]，抗體的藥代動力學（pharmacokinetics，PK）特征也是一個影響其臨床應(yīng)用的重要因素。描述藥物PK的重要參數(shù)之一，即藥物半衰期，指的是體內(nèi)藥物血液濃度降至一半所需要的時間。通常，對藥物半衰期的適當延長能提高藥效、減少給藥劑量和給藥頻率，進而更便于臨床治療并減輕患者的治療負擔[4]。近年來，有關(guān)如何延長治療性抗體藥物半衰期的研究主要集中在目前臨床常用的IgG抗體以及半衰期較短的納米抗體（nanobody，Nb）。

IgG是人體血清中含量最為豐富的抗體，占血液循環(huán)中所有抗體的75%[5]，是由2條重鏈和2條輕鏈通過二硫鍵連接構(gòu)成的Y型對稱結(jié)構(gòu)的大分子蛋白質(zhì)，其相對分子質(zhì)量為150000。根據(jù)其功能又可將結(jié)構(gòu)分為2個特異性識別靶抗原的抗原結(jié)合片段（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab）、2個恒定的可結(jié)晶片段（fragment crystallizable，F(xiàn)c）和連接Fab段與Fc段的鉸鏈區(qū)[6]。IgG具有比其他亞型抗體更長的血清半衰期，一般在10 ～ 21 d，這一特性使得IgG類抗體藥物的藥效更持久、給藥頻率和劑量也相應(yīng)降低，成為目前為止臨床上應(yīng)用最為廣泛的抗體藥物類型[7]。IgG的高血清滴度和較長的血清半衰期特性由許多與結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的因素決定，包括新生兒Fc受體（neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn）介導(dǎo)的循環(huán)、總電荷量、疏水性大小、等電點（isoelectric point，pI）、糖基化修飾等，其中，F(xiàn)cRn介導(dǎo)的循環(huán)機制是最為重要的影響因素。血液中循環(huán)的IgG通過胞飲作用或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被內(nèi)皮細胞或單核細胞吸收后，IgG在酸性環(huán)境中（pH = 6.0），其Fc段與FcRn相互作用，使得IgG與FcRn結(jié)合。然后，結(jié)合的IgG被轉(zhuǎn)運至細胞表面，并在達到生理pH值（pH = 7.4）時又被釋放至血液中，使這一部分的IgG又能被重復(fù)利用[3]?；谝陨线@些因素，針對IgG半衰期延長的方法學研究也在不斷開展，力求提高IgG類抗體藥物的半衰期，使其滿足臨床實際需求。

小分子抗體主要包括單鏈抗體（single chain variable fragments，scFv）[8]、Nb[9]和Fab段等，其中Nb的相對分子質(zhì)量最小（＜15000），僅由1個來自于駱駝的重鏈抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。自1993年Hamers-Casterman等[10]在駱駝血清中發(fā)現(xiàn)天然重鏈抗體以來，研究者們對Nb產(chǎn)生了濃厚的興趣，眾多研究成果表明，Nb具有比傳統(tǒng)抗體更好的組織穿透能力[8]，免疫原性小[11]，能以可溶性形式在原核或真核系統(tǒng)中高表達，穩(wěn)定性也比其他小分子抗體更高[12]。以上這些優(yōu)勢促使Nb在治療性藥物開發(fā)、診斷以及物質(zhì)檢測等領(lǐng)域的研究被迅速推進，2019年，全球首個Nb藥物caplacizumab（用于治療罕見凝血障礙的二價Nb）被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準進入市場，并且同時有十幾種Nb藥物正處于臨床試驗研究階段[13]。但是，由于Nb的相對分子質(zhì)量遠小于腎濾過屏障所允許濾除的最大蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量（50000 ～ 60000），使得Nb可直接并迅速被腎臟清除，導(dǎo)致其半衰期極短，通常在幾分鐘至幾小時之間。因此，延長Nb半衰期成為了進一步改善Nb藥物療效的重要方向之一。目前，以蛋白融合、化學修飾、紅細胞載體和多價Nb為主的策略被應(yīng)用到Nb半衰期改造的研究中。

本文主要介紹了延長IgG和Nb半衰期的一些方法。針對IgG的半衰期改造，我們從Fc段改造、pI改造、糖基化改造、pH依賴性抗原結(jié)合抗體等方面對其改造原理、改造常用的方法及其缺陷和創(chuàng)新性技術(shù)進行了詳細介紹。另外，對于Nb的半衰期改造，我們以蛋白融合、化學修飾和紅細胞載體為重點，同樣從原理、常用方法及其優(yōu)缺點和創(chuàng)新性技術(shù)等方面進行了概述。最后，針對現(xiàn)有治療性抗體半衰期改造方法所存在的一些問題，對未來治療性抗體藥物半衰期改造可能的新策略和趨勢進行展望。

1 IgG的半衰期改造

1.1 Fc段改造

由于IgG的Fc段與FcRn的pH依賴性的相互結(jié)合及循環(huán)機制對IgG的半衰期特征十分重要，研究者們主要通過優(yōu)化Fc段的蛋白序列來改善兩者間的結(jié)合強度，提高兩者在酸性（pH = 6）條件下的結(jié)合并維持兩者在中性（pH = 7.4）條件下的正常解離，從而延長IgG的半衰期。優(yōu)化Fc段傳統(tǒng)方法包括丙氨酸掃描[14]、定點誘變[15-18]、分子建模[4]和隨機突變[17]，通過替換IgG的Fc段中與FcRn結(jié)合位點或位點附近的氨基酸，從而獲得Fc段變體庫，再結(jié)合噬菌體展示技術(shù)進行蛋白質(zhì)篩選并驗證，最終得到與FcRn高親和力結(jié)合的Fc段變體，從而突破了以往單點突變所帶來的局限性。其中，最經(jīng)典的且已被廣泛引入到臨床治療性IgG抗體中的突變組合有YTE（M252Y/S254T/T256E）[19-21]和LS（M428L/N434S）[22-23]，它們能在不影響IgG的Fab段與靶抗原的結(jié)合親和力的情況下增強與FcRn的結(jié)合，從而延長IgG抗體的半衰期。在具體的臨床應(yīng)用中，經(jīng)過YTE改造后針對呼吸道合胞病毒的莫塔韋單抗（motavizumab）對人FcRn的親和力提高了10倍，且半衰期延長至60 d以上[19]；另外，YTE改造后針對嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SRAS-CoV-2）抗體藥物AZD7442的半衰期延長了近3倍[24-25]。除此之外，LS同樣也被引入到用于治療新型冠狀病毒感染（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的索托韋單抗（sotrovimab）中以延長其半衰期[23]，而Zalevsky等[4]也通過在貝伐單抗（bevacizumab）的Fc段引入LS突變，使得bevacizumab在食蟹猴體內(nèi)的半衰期從9.7 d延長至31.1 d。

在某些情況下，F(xiàn)c段突變不可避免地會對IgG抗體中Fc段的其他效應(yīng)器功能和自身穩(wěn)定性帶來影響。為了解決這一問題， Booth等[26]開發(fā)了一種基于結(jié)構(gòu)分析和網(wǎng)絡(luò)分析的框架，通過分析在酸性條件下Fc段與FcRn的結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，在維持Fc段與具有效應(yīng)器功能的受體[補體第1成分q（complement component 1q，C1q）、三基序蛋白21（tripartite -motif protein 21，TRIM21）、FcγRI、FcγRIIa/b、 FcγRIIIa等]的正常結(jié)合的條件下，繪制出各個突變相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，并將篩選后得到的突變進行組合，再評估組合突變體的性能。最終篩選得到5種Fc段突變組合DF183（T256D/Q311V/A378V）、DF197（H285N/T307Q/N315D）、DF213（H285D/T307Q/A378V）、DF215（T307Q/Q311V/A378V）、DF228（T256D/H286D/T307R/Q311V/A378V）。且其驗證實驗表明，DF228突變型motavizumab在食蟹猴中的半衰期與野生型相比提高了3.5倍（與YTE突變型相當甚至有所提高）[19]。Mackness等[27]運用點飽和突變技術(shù)在IgG1 Fc段的11處與FcRn結(jié)合位點進行了突變并篩選得到3種不破壞IgG與FcγRⅢa的結(jié)合親和力、IgG與FcRn結(jié)合的pH依賴性、并且與人體內(nèi)關(guān)鍵免疫原性標志物RF的結(jié)合親和力低的組合變體YD（M252Y/T256D）、DQ（T256D/T307Q）和DW（T256D/T307W）。而為了維持抗體突變體的穩(wěn)定性，Borrok等[28]通過分析TM（L234F/L235E/P331S）-YTE中單個突變對抗體熱穩(wěn)定性的影響，隨后用提高熱穩(wěn)定性的新突變?nèi)〈环€(wěn)定突變的方法發(fā)現(xiàn)了一種新的組合突變體FQQ-YTE（L234F/L235Q/K322Q/M252Y/S254T/T256E），其穩(wěn)定性比TM-YTE更高且具有與TM-YTE相同的生物活性。Lee等[29]以優(yōu)化Fc段與FcRn結(jié)合的pH依賴性為目的，從Fc段突變庫中篩選獲得了一種新的組合突變L309D/Q311H/N434S（DHS），其在保持IgG完整的效應(yīng)功能的同時，顯著提高了IgG的半衰期；Ko等[30]同樣以優(yōu)化Fc段與FcRn結(jié)合的pH依賴性為目的，利用膜蛋白漂移和組裝（membrane protein drift and assembly，MPDA）細菌展示系統(tǒng)，從Fc段變體庫中篩選得到一種新的組合突變PFc29（Q311R/M428L），曲妥珠單抗（trastuzumab）-PFc29在食蟹猴模型中的半衰期比trastuzumab-YTE和trastuzumab -LS的半衰期增加了6 d左右，同時增強了trastuzumab的補體依賴的細胞毒性作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）和抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。為了進一步提高Fc段變體庫的通量并降低篩選的成本，Chen等[31]開發(fā)了一種基于哺乳動物展示技術(shù)和二代測序技術(shù)的Fc變體庫篩選方法，將Fc段變體庫的通量由以前的數(shù)千個增加至數(shù)百萬個，并且哺乳動物展示技術(shù)與噬菌體展示技術(shù)或酵母菌展示技術(shù)相比，能較大程度地保留了IgG Fc段的糖基化結(jié)構(gòu)，使得Fc段改造與IgG糖基化改造很好地結(jié)合并篩選出性能更強的工程化IgG抗體。

綜上所述，在對IgG的Fc段進行改造以增強Fc段與FcRn的結(jié)合并延長其半衰期的同時，不僅需要在提高酸性的條件下保持Fc段與FcRn的結(jié)合力，同時維持中性的條件下兩者的正常解離，還需要考慮改造后的Fc段對IgG其他性能的影響，如結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、與靶抗原的結(jié)合親和力（Fab段的功能）、與補體或其他Fc段功能性受體的結(jié)合親和力等。再者，F(xiàn)c段突變所導(dǎo)致的IgG半衰期延長在體內(nèi)與體外以及不同物種間都是存在差異的[32]，因此需要提前對抗體的各項理化性質(zhì)以及在不同物種之間的差異性進行分析，以確?？贵w經(jīng)Fc段改造后達到半衰期預(yù)期的延長效果。

1.2 pI改造

IgG抗體的pI是其重要的物理性質(zhì)之一，眾多研究證實了通過改變抗體表面所帶電荷量及其電荷分布可以改變IgG的半衰期。人們普遍認為通過降低抗體整體的凈正電荷來降低其pI值，能夠減少抗體與帶負電荷的細胞膜之間的非特異性相互作用，從而在一定程度上降低細胞對抗體的攝取速率和抗體的清除速率。除此之外，有研究還發(fā)現(xiàn)了IgG Fv區(qū)的正電荷斑塊會促進抗體與FcRn的結(jié)合，使得其在中性pH條件下與FcRn的解離速度降低，從而影響了IgG的PK性質(zhì)[33-34]。

早期研究者們采用化學偶聯(lián)法將IgG陽/陰離子化[35-36]，從而引起IgG抗體PK的變化，但運用該方法得到的IgG變體的pI并不完全一致，這導(dǎo)致研究者無法準確地評估IgG自身電荷變化對其半衰期的影響程度。隨后，Li等[37]發(fā)現(xiàn)在對人源化的抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）IgG的kI/VH3框架區(qū)序列進行改造的過程中，因抗體所帶負電荷增加而改善了抗體的PK。但這種抗體框架區(qū)氨基酸序列變化所引起的抗體pI變化的范圍非常狹窄，并且由于結(jié)合不同靶標的IgG抗體具有不同的理化性質(zhì)特征，使得部分人源化IgG的pI值變化后并不引起其半衰期的改變，因此限制了該方面的應(yīng)用。近年來，越來越多的研究致力于通過改造IgG Fab段來降低IgG的pI值或改變其表面的電荷分布。例如，Igawa等[38]通過對抗白細胞介素6受體（interleukin 6 receptor，IL-6R）IgG的Fab段中的氨基酸進行定點誘變產(chǎn)生pI值比野生型低1 ～ 2個pI單位的IgG變體，使得該變體半衰期延長了2.4倍。Datta-Mannan等[39]則利用分子建模技術(shù)將互補決定區(qū)（complementarity determing region，CDR）帶正電荷的氨基酸殘基進行了替換，在不影響抗體整體pI值的條件下平衡了CDR的電荷分布，進而延長了抗體的血清半衰期。但通過改造Fab段來實現(xiàn)IgG的pI值或電荷分布變化的策略可能會同時引起其抗原特異性結(jié)合能力減弱或理化性質(zhì)（穩(wěn)定性、溶解度和黏度）的改變，而如果嚴格控制這些影響因素，將會導(dǎo)致篩選出來的能夠有效延長IgG半衰期的突變類型十分有限。

1.3 糖基化改造

IgG是人血清中含量最多的糖蛋白，糖基化作為其翻譯后修飾的重要生物反應(yīng)之一，對其半衰期、親和力、Fc段結(jié)構(gòu)及其效應(yīng)功能等方面有重要影響。IgG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中發(fā)生的糖基化反應(yīng)主要為Fc段CH2結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基Asn297上的N-連接糖基化，少數(shù)IgG 的糖基化反應(yīng)發(fā)生在Fab段[40]。對IgG的半衰期有影響的聚糖主要包括甘露糖、唾液酸、半乳糖，IgG的N-聚糖結(jié)構(gòu)不會顯著影響其與FcRn的結(jié)合，但會通過相關(guān)受體介導(dǎo)的選擇性糖蛋白清除途徑來影響其半衰期。例如，肝中的去唾液酸糖蛋白受體可結(jié)合IgG N-末端的半乳糖而將IgG清除，甘露糖受體可與IgG N-末端的甘露糖或N-乙酰氨基葡萄糖殘基結(jié)合并將其清除，另外，IgG N-末端的甘露糖和半乳糖還可通過凝集素介導(dǎo)的清除反應(yīng)而引起半衰期縮短[41]。

大量研究證實含高甘露糖型的IgG與含其他糖型的IgG相比清除速度更快、半衰期更短[42-43]。Newkirk等[44]和Winkelhake等[45]通過去除N-末端半乳糖以及N-乙酰氨基葡萄糖使得IgG的半衰期明顯延長。此外，唾液酸化對IgG在血漿中的半衰期也至關(guān)重要，唾液酸糖鏈的存在極大地增加了IgG所帶負電荷的數(shù)量，減少了受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，從而延長了IgG的半衰期。Ludwig等[46]通過在體系中加入唾液酸前體（1，3，4-O-Bu3ManNac）將抗白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）IgG唾液酸化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該IgG的半衰期由原來的39.5 h延長至60.9 h，且其生物活性和穩(wěn)定性沒有受到糖基化的影響。Bas等[47]還將IgG Fc段的高唾液酸化與Fc段隨機突變相結(jié)合，得到的高唾液酸化IgG突變體，經(jīng)半衰期檢測發(fā)現(xiàn)，唾液酸化既可直接延長IgG抗體的半衰期，也能與Fc段突變一起協(xié)同延長IgG的半衰期。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)IgG Fab段的唾液酸化可增強抗表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）IgG單抗（cetuximab）和抗MUC1 IgG 單抗（pankomab）的血清半衰期[48]。

1.4 抗原結(jié)合部位pH依賴性改造

IgG除了被細胞非特異性攝取并被胞內(nèi)溶酶體以降解的方式清除之外，還可以通過與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的方式被免疫細胞內(nèi)吞并清除。通常與膜抗原結(jié)合的抗體會因迅速與抗原一起內(nèi)化而被快速清除，這種現(xiàn)象被稱為靶介導(dǎo)的藥物處置（targetmediated drug disposition，TMDD）。為了減少這類抗體的快速清除，一種基于抗原結(jié)合部位pH依賴性IgG的工程化技術(shù)被提出并受到廣泛關(guān)注[49-51]，該抗體在血液中與靶抗原結(jié)合后被免疫細胞內(nèi)吞至核內(nèi)體中，核內(nèi)體所提供的酸性條件（pH = 6.0）可以降低抗體與靶抗原的親和力，從而加速抗體與抗原的解離，解離后的抗體可被FcRn介導(dǎo)的循環(huán)作用而重新回到血液中，而靶抗原則被運輸至溶酶體中被降解，從而在有效降解靶抗原的同時最大限度地減少了TMDD介導(dǎo)的抗體快速清除并延長了抗體半衰期。

最常用的抗原結(jié)合部位pH依賴性改造的方法是組氨酸突變[52-53]，即在CDR或骨架區(qū)被引入組氨酸，利用組氨酸在酸性核內(nèi)體中質(zhì)子化和在中性血液中去質(zhì)子化的電荷特性實現(xiàn)了其與抗原的解離與結(jié)合。但通過表面逐個組氨酸突變來達到改造目的的策略耗時耗力，并且獲得的突變型IgG雖然能在酸性pH下減弱與抗原的結(jié)合親和力，但在某些情況下也可能同時降低其在中性條件（pH = 7.4）下與抗原的結(jié)合親和力，從而降低了其對靶標識別能力。對此，研究者們在技術(shù)上做了進一步改進。Schr?ter等[54]通過使用聯(lián)合組氨酸掃描文庫和酵母展示技術(shù)的策略篩選并合成了抗原結(jié)合部位pH依賴性的抗腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）IgG單抗，所獲得的工程化IgG抗體在pH= 6.0條件下與抗原的解離速率常數(shù)增加了230 ～ 780倍，但是在pH = 7.4下保持了與抗原的結(jié)合活性，并且，這種基于高通量技術(shù)開展的組合文庫篩選使得工作量大大減少。Bonvin等[55]以1個VH結(jié)構(gòu)域和7個VL結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)并在其CDR3處引入足量的組氨酸突變，建立了富含組氨酸的scFv噬菌體庫，利用噬菌體展示技術(shù)篩選獲得與CXC趨化因子配體10（C-X-C chemokine ligand 10，CXCL10）以pH依賴性方式結(jié)合的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，并將兩者重組構(gòu)成完整的抗CXCL10 IgG1，該IgG1在pH 為6時與CXCL10的親和力系數(shù)比在pH = 7.4時降低了2.4倍，這種“從頭篩選”的方法更具有通用性并且提高了篩選過程的效率，之后也被運用到了合成抗原結(jié)合部位pH依賴性的抗葡萄球菌腸毒素B IgG和抗EGFR IgG中[56-57]。

1.5 抗原結(jié)合鈣離子依賴性改造

由于抗體的抗原結(jié)合pH依賴性改造始終需要依賴于其組氨酸殘基的質(zhì)子化，該過程發(fā)生在酸性核內(nèi)體中，質(zhì)子化后的抗體與抗原表位中帶正電或質(zhì)子供體殘基之間產(chǎn)生靜電排斥，導(dǎo)致抗體與抗原解離，最終使得抗體重新回到血液中。但某些抗體在酸性pH環(huán)境下是與抗原帶負電荷或成為質(zhì)子受體的表位相結(jié)合的，這將導(dǎo)致抗體即使經(jīng)過組氨酸改造，也不會產(chǎn)生抗原結(jié)合pH依賴性。為了克服這一限制，Hironiwa等[58]探索了一種替代性方法，利用血液與核內(nèi)體之間鈣離子濃度的差異，通過在含鈣離子的溶液中將抗體與人IL-6R結(jié)合并在無鈣離子的溶液中進行洗脫的步驟對人噬菌體抗體庫進行篩選，最終篩選得到一種抗原結(jié)合部位鈣離子依賴性IgG，該抗體可在循環(huán)中被重復(fù)利用，并且加速了機體對抗原的清除。但是，從人抗體庫中篩選出抗原結(jié)合部位鈣離子依賴性IgG的種類和數(shù)量有限，需要更多的研究來提升該技術(shù)的普適性。

2 納米抗體的半衰期改造

2.1 與長半衰期蛋白融合

由于Nb的尺寸較小，在腎濾過屏障的相對分子質(zhì)量閾值（60000）以下，致使Nb在人體內(nèi)的半衰期低至幾小時甚至幾分鐘。因此，通過將Nb與一些具有長半衰期的蛋白融合表達形成更大相對分子質(zhì)量的蛋白成為了延長其半衰期的有效方法之一。人體內(nèi)具有長半衰期的蛋白主要是人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）和IgG，兩者的相對分子質(zhì)量都大于腎濾過蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量閾值，并且IgG的Fc段融合能使Nb直接參與FcRn結(jié)合介導(dǎo)藥物的胞內(nèi)循環(huán)過程，從而更有效地提升藥物的半衰期。

直接與HSA（相對分子質(zhì)量為66000）連接形成融合蛋白很可能會使Nb失去其小分子優(yōu)勢（高滲透性、高溶解度），因此，研究者們往往采用在Nb上融合能與HSA 結(jié)合的小分子蛋白質(zhì)，如相對分子質(zhì)量為5000 ～ 6000的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域[59]和小于15000的抗HSA Nb[60]。例如，Morais等[61]將白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗TNF Nb進行了融合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白VHH-Zag（相對分子質(zhì)量為25200）的24 h血液清除率和總排泄量均顯著低于未融合的Nb，從而延長了抗TNF Nb的半衰期；Sato等[62]將抗細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）Nb（H11）與抗HSA Nb融合形成H11-HLE（相對分子質(zhì)量為27200），在小鼠體內(nèi)進行PK實驗發(fā)現(xiàn)H11-HLE融合蛋白在血漿和腫瘤中的半衰期與H11相比延長了10倍，且H11-HLE保持了與H11相似的抗原結(jié)合親和力。相比較而言，將Nb與Fc段進行融合表達是延長Nb半衰期的主要手段之一，但該方法在延長Nb抗體半衰期的同時還賦予了Nb其他特性，如Li等[63]為了提高抗人蛋白原轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9） Nb的半衰期以及靶向性，將抗人PCSK9 Nb的二聚體與IgG4的Fc段進行了融合，所獲得的融合蛋白不僅半衰期長，而且增強了其穩(wěn)定性和降脂效果。另外，Nb與IgG的Fc段的融合還可以賦予其Fc相關(guān)的效應(yīng)器功能[如ADCC、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬作用 （antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）和CDC]，使得該方法在抗腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[64]，也有研究者通過Nb與二硝基苯酚（di-nitro phenol，DNP）半抗原偶聯(lián)的方式招募抗DNP抗體，以此來達到相同的效果[65-66]。此外，還有研究者通過將Nb以24聚體的形式結(jié)合在鐵蛋白表面，構(gòu)建出了一種新型的納米抗體鐵蛋白-Nb融合蛋白——Fenobody，F(xiàn)enobody與常規(guī)Nb相比具有更強的抗原結(jié)合親和力（約360倍）和更長的半衰期（約10倍）[67]。

2.2 化學修飾

Nb除了通過與上述蛋白質(zhì)融合來增加相對分子質(zhì)量以減少腎臟濾過率之外，還能通過一些化學修飾的方式來達到相同的目的。最經(jīng)典且技術(shù)最為成熟的化學修飾是聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾[68]。PEG是一種高度韌性、親水性且不能被生物降解的生物相容性大分子，不僅能夠顯著改善Nb及其他小分子蛋白質(zhì)在體內(nèi)的循環(huán)半衰期，還可以降低它們的免疫原性、提高其穩(wěn)定性和水溶性，因此被美國FDA批準廣泛應(yīng)用于藥物的PK改造[69-71]。但PEG修飾也存在一些弊端，比如隨機化的PEG修飾會影響Nb的治療效果[72]、長期使用PEG修飾后的Nb會導(dǎo)致PEG在體內(nèi)大量堆積而對機體產(chǎn)生毒性作用，并且PEG自身也具有免疫原性，一旦造成機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，很可能會影響藥物的治療效果或引發(fā)其他的不良反應(yīng)。

為了彌補PEG修飾的缺陷，一些PEG模擬肽開始被廣泛應(yīng)用，脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸（prolinealanine-serine，PAS）序列即為其中之一。PAS具有免疫原性低、不會在腎臟積累以及不需要通過復(fù)雜的化學偶聯(lián)反應(yīng)與蛋白質(zhì)連接等獨特優(yōu)勢，使其在Nb半衰期改造中得到應(yīng)用。Khodabakhsh等[73-74]首次將PAS重復(fù)序列連接至抗VEGF Nb上，使得Nb終末半衰期顯著增加了14倍，同時發(fā)現(xiàn)PAS在不改變Nb生物活性的情況下，提高了Nb的抗原結(jié)合能力并對正常細胞沒有表現(xiàn)出任何細胞毒性。另外，作為PEG替代性化合物的XTEN也同樣具有良好的安全性和較低的免疫原性，它是一種非結(jié)構(gòu)化的親水性多肽，能夠有效、精準地延長所修飾的肽和蛋白質(zhì)的半衰期[75]，最初應(yīng)用于人類生長激素[76]、胰高血糖素樣肽2[77]、胰高血糖素[78]和凝血因子[79]等蛋白類治療性藥物的半衰期延長。近年也有研究者將XTEN與scFv融合，構(gòu)建出一種靶向腫瘤相關(guān)抗原[人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor，HER2）或EGFR]和分化簇3（cluster of differentiation 3，CD3）的雙特異性T細胞結(jié)合劑XPAT，在延長scFv半衰期的同時提高了其抗腫瘤活性和穩(wěn)定性，并保證了XPAT的安全性[80]。雖然目前還未有研究者對XTEN延長Nb半衰期進行實驗探究，但就上述研究可見XTEN應(yīng)用的廣泛性，說明其在Nb半衰期延長領(lǐng)域具有巨大潛力。除此之外，彈性蛋白樣五肽（elastin-like pentapeptide，ELP）修飾也被證實在保持Nb的體內(nèi)生物活性的同時，能減少Nb通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)而被大量清除，從而延長其半衰期，并因其高度的生物安全性而得到廣泛應(yīng)用[81-83]。如Conrad等[84]設(shè)計了一種ELP修飾的抗TNF Nb，其在體內(nèi)的存留時間相對于未修飾的抗TNF Nb延長約24倍，并可以在植物中實現(xiàn)高效表達。

2.3 利用紅細胞載體

紅細胞（red blood cell，RBC）可以作為許多小分子物質(zhì)的載體，具有長循環(huán)半衰期（120 d）、缺乏細胞核、對機體來說缺乏自身免疫原性、可被機體有效清除并誘導(dǎo)機體對附著于RBC表面的外來物質(zhì)產(chǎn)生免疫耐受的特性[85]。因此，與化學修飾相比，以RBC作為Nb的載體的方法對機體來說安全性更高。

目前，已經(jīng)開發(fā)了幾種連接RBC與Nb的技術(shù)。傳統(tǒng)的方式是通過借助短肽或化學交聯(lián)劑將Nb與RBC表面的膜蛋白偶聯(lián)，但是在RBC上的偶聯(lián)位點往往缺乏特異性，或者涉及的操作步驟過多，容易使RBC受損而被機體快速識別并清除。為了保護RBC并維持其天然生物學特異性，Huang等[86]開發(fā)了一種新的策略，通過基因修飾的方式將抗A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素（botulinum neurotoxin type A，BoNT/A）的Nb的序列與RBC膜上的糖蛋白A（glycophorin A，GPA）嵌合并表達在小鼠RBC表面，在維持RBC正常生理功能的同時使抗BoNT/ANb的半衰期延長至28 d。雖然該方法更為精準，但對祖紅細胞進行基因改造的過程十分耗時、昂貴；并且無法保證經(jīng)體外培養(yǎng)后獲得的成熟RBC全部為無核RBC，因此可能在后續(xù)實驗中造成RBC遺傳物質(zhì)的傳播。隨后，Harmand等[85]又進行了創(chuàng)新，他們設(shè)計了一種突變的天冬酰胺內(nèi)肽酶（Cys247Ala-OaAEP1），該酶可以識別改造后的Nb上的三肽序列（Asn-Xaa-Yaa，Xaa通常為脂肪族氨基酸，Yaa通常為側(cè)鏈氨基酸），并催化Nb與RBC之間的連接反應(yīng)。該方法不僅過程簡單、快速，而且對Nb和RBC的正常生理特性均沒有較大影響，具有一定的通用性。

2.4 多價納米抗體

多價Nb是解決Nb半衰期問題的途徑之一，通過利用基因重組技術(shù)或柔性連接物的方式將相同或不同的Nb組合成一個更大相對分子質(zhì)量的融合蛋白，同時多價結(jié)構(gòu)也能在一定程度上增強整個融合蛋白的抗原結(jié)合親和力。例如，Sadeghi等[87]將羊駝IgG2c的鉸鏈區(qū)序列插入到2個編碼抗VEGF Nb的序列中間，形成二價Nb，研究發(fā)現(xiàn)該二價Nb在抑制人內(nèi)皮細胞增殖、成管和遷移方面均明顯優(yōu)于單價Nb，且PK結(jié)果表明二價Nb的半衰期比單價Nb長1.8倍； Ma等[88]將編碼程序性死亡受體-配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1） Nb和抗T細胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白（T cell immune receptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）Nb的基因克隆至含人IgG4 Fc段的載體中，成功構(gòu)建了四價PD-L1/TIGIT雙特異Nb，其相較于單價抗體具有更高的阻斷活性。此外，也有研究者利用柔性連接肽Gly-Ser（GS）將3個抗呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）Nb連接成一種抗RSV的三價Nb ALX-0171，其對RSV的中和效力增強了6000倍，且目前已進入Ⅱ期臨床試驗[89]；Koenig等[90]也利用柔性連接肽（Gly4Ser）3將抗SARS-CoV-2 Nb連接形成二價或三價的抗SARSCoV-2 Nb，其中活性達到單價Nb的100倍以上。柔性連接肽具有靈活性、穩(wěn)定性等特點，但其缺乏剛性，可能導(dǎo)致融合蛋白表達下降或生物活性喪失，因此，Xiang等[91]同時利用（EAAAK）31剛性連接肽序列將與SARS-CoV-2 刺突蛋白受體結(jié)合域中不同表位結(jié)合的Nb連接成具有高中和效力的多價Nb。

3 結(jié)語與展望

在抗體藥物發(fā)展歷程中，以IgG為主的治療性單克隆抗體藥物因特異性高、半衰期長、安全性好，使其在抗體藥物市場中長期占據(jù)主導(dǎo)地位。研究者們在不斷地挖掘新的藥物靶點以研發(fā)新型抗體藥物的同時，也在通過延長已有的治療性抗體半衰期的方式來進一步提高其治療效果。在延長IgG半衰期的相關(guān)方法中，針對其Fc區(qū)改造的研究最多且最成熟，在臨床中應(yīng)用最為廣泛的YTE和LS變體不僅使得抗體的半衰期大大延長，也保護了抗體的抗原識別特性。但在Fc區(qū)引入突變，改變Fc與FcRn結(jié)合pH依賴性的同時，還需要注意突變對抗體的Fc效應(yīng)功能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。而針對這些影響，研究者們也通過建立Fc變體庫并結(jié)合噬菌體展示技術(shù)、計算機輔助結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)、點飽和突變技術(shù)等方法獲得了更多半衰期延長的Fc突變組合，且不會對IgG的其他功能造成影響。此外，改變IgG的pI或電荷分布也是延長其半衰期的常用方法，通過化學偶聯(lián)或誘導(dǎo)IgG的氨基酸序列突變使其pI降低或均衡電荷來達到改造目的，但這些方法都存在局限性。而IgG的糖基化改造對理化性質(zhì)的影響是多方面的，通過降低IgG中的甘露糖、半乳糖或N-乙酰氨基葡萄糖的方式可減少其與一些糖受體結(jié)合從而降低其清除率，通過唾液酸化也可延長其半衰期，還有研究者證實聯(lián)合Fc突變與唾液酸化可以協(xié)同增強抗體半衰期。另外，賦予IgG pH依賴性或鈣離子依賴性的抗原結(jié)合能力可以降低其胞內(nèi)特異性清除速度，從而改善其半衰期。通常采用在Fab區(qū)引入組氨酸的方式來制備pH依賴性抗原結(jié)合抗體，但過程中需要特別注意對中性pH下IgG與抗原正常結(jié)合的影響。

Nb的半衰期改造是進一步改善Nb藥物療效的重要方向。Nb的半衰期改造策略主要有4種：與長半衰期蛋白融合、化學修飾、利用RBC載體和多價Nb?；谏鲜霾呗?，目前較為成熟的技術(shù)包括人HSA融合、Fc融合、PEG修飾以及多價Nb。Nb直接與人HSA融合可能會導(dǎo)致其小尺寸優(yōu)勢的丟失，因此，許多研究者后來選擇將Nb與白蛋白結(jié)合域（albumin binding domain，ABD）或抗HAS Nb進行融合；Fc融合在延長Nb半衰期的同時賦予其Fc相關(guān)的效應(yīng)器功能，更有利于Nb應(yīng)用于抗腫瘤等疾病的治療；PEG修飾作為最經(jīng)典且技術(shù)最為成熟的化學修飾方法已經(jīng)在包括Nb在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)的性能優(yōu)化上得到應(yīng)用，但也有研究表明該方法也存在一定安全隱患，由此研究者嘗試開發(fā)相對分子質(zhì)量較小的PEG模擬肽。除此之外，利用RBC載體的相關(guān)技術(shù)也在不斷進步并朝著通用化的方向發(fā)展。最后，多價Nb也因在延長Nb半衰期的同時增強了Nb的抗原結(jié)合能力而得到應(yīng)用。

總之，IgG和Nb的相關(guān)半衰期改造技術(shù)各有優(yōu)劣，而且，各種治療性抗體自身性質(zhì)以及與相應(yīng)抗原結(jié)合的表位結(jié)構(gòu)的差異也會導(dǎo)致抗體藥物半衰期差異較大。因此，治療性抗體半衰期改造并沒有一個通用的最佳策略，需要結(jié)合有關(guān)性質(zhì)進行合理選擇。同時，不同改造技術(shù)的相互結(jié)合也可以作為一種新的策略來協(xié)同提高抗體藥物的半衰期。在未來的研究中，隨著人工智能（artificial intelligence，AI）技術(shù)和深度學習技術(shù)的不斷迭代，使其在結(jié)構(gòu)生物學方面得到廣泛的運用，促使更多蛋白晶體結(jié)構(gòu)得到了更深層次的解析，我們將更加全面的了解IgG和Nb抗體的結(jié)構(gòu)及其效應(yīng)功能，因此，基于AI的結(jié)構(gòu)預(yù)測算法將會使得抗體藥物半衰期的改造邁入更加快速、精準和科學的軌道。