何思婕，張男俠，楊夢宇，唐偉方

（中國藥科大學理學院，江蘇 南京，210009）

肝癌中表達的酪氨酸激酶（tyrosine kinase ，Tec）家族由5個成員組成：Tec、布魯頓氏酪氨酸激酶（Bruton,s tyrosine kinase，BTK）、白細胞介素-2誘導型酪氨酸激酶（interleukin-2 inducible tyrosine kinase，ITK）、靜息淋巴細胞激酶（resting lymphocyte kinase，RLK）和骨髓激酶（bone marrow X-linked kinase，BMX）。在T淋巴細胞中，有3種主要的Tec激酶表達：ITK、 RLK和Tec，它們都是在T細胞受體（T cell receptor，TCR）刺激下發(fā)生磷酸化的Tec。ITK是1992年被發(fā)現(xiàn)的一種具有5個結構域的蛋白激酶，其相對分子質量為72000，主要在T細胞中表達，也在肥大細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）和自然殺傷T細胞（natural killer T cell，NKT）中表達。ITK通常位于細胞質中，激活后向質膜轉移，對TCR信號傳導至關重要，在輔助性T細胞1（T helper 1 cell，Th1）、Th2、Th17和恒定自然殺傷T細胞（invariant natural killer T cells，iNKT）的細胞因子產生過程中有重要作用[1-4]，對非經典調節(jié)性T細胞也有調節(jié)作用[5]，能調節(jié)T細胞的激活、增殖和分化。ITK通過控制促炎因子的表達參與炎癥反應的發(fā)病機制，對其進行抑制是緩解或治療急性腎損傷、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、潰瘍性腸炎等炎癥性疾病的潛在策略。目前已有多種結構類型的小分子抑制劑被報道，其中JET-051、CPI-818分別進入Ⅱ期、Ⅰ期臨床試驗，但還未有ITK抑制劑上市。本文通過對ITK的結構、參與的信號通路、在炎癥中的作用及其抑制劑的研究進展進行綜述，以期為ITK抑制劑的開發(fā)提供參考。

1 ITK結構

ITK基因在人類染色體上定位于5q31 ～ 5q32位，由5個不同的結構域組成：pleckstrin同源（pleckstrin homology，PH）結構域、Tec同源（Tec homology，TH）結構域、肉瘤基因同源3（sarcoma homology 3，SH3）、SH2和SH1結構域（見圖1）。PH結構域位于ITK的氨基端，SH1結構域位于ITK的羧基端[6]。柔性鉸鏈連接氨基端和羧基端。連接兩端的柔性鉸鏈區(qū)形成腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結合位點的一部分，激活環(huán)位于兩端激酶結構域之間[7]。ITK的PH結構域負責蛋白-脂質相互作用，并幫助激酶結合在細胞膜上。TH結構域包含27個氨基酸殘基組成的保守序列，顯示出對ITK家族性識別。TH結構域的脯氨酸富集區(qū)（proline rich region，PRR）與SH3結構域結合，使其處于自身抑制狀態(tài)。SH3結構域包含1個保守的氨基酸殘基Trp208，它對SH3結構域與PRR的結合至關重要，并導致激酶處于自抑制狀態(tài)。SH2結構域負責蛋白-蛋白相互作用，使該激酶與磷脂酶Cγ1 （phospholipase C-gamma 1，PLCγ1）結合。SH2和SH3結構域的任何突變或者缺失都會導致該激酶失活。SH1結構域（激酶或催化結構域）對于激酶的催化活性，尤其是通過磷酸化該脂肪酶的Tyr775和Tyr783殘基來激活PLCγ1是必要的。激酶的催化結構域包含1個ATP結合位點，將磷酸基從ATP分子轉移到底物，即使底物磷酸化。該結構域還包括1個重要的氨基酸殘基Tyr511，該氨基酸殘基被淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte specific protein tyrosine kinase，Lck）轉磷酸化，用于初始激活ITK[8]。

圖1 ITK激酶的結構域Figure 1 The domain of ITK kinase

2 ITK在TCR信號通路中的作用

ITK是TCR介導的信號傳導的關鍵成分。TCR與抗原提呈細胞（antigen-presenting cells，APC）上的肽-主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）復合物產生相互作用，從而活化Lck，導致分化簇3（cluster of differentiation，CD3）免疫受體酪氨酸活化基序（immunorecepter tyrosine-based activation motif，ITAMs）的磷酸化。接著70 kDa zeta鏈相關蛋白激酶（zeta chain-associated protein kinase 70 kDa，Zap-70）與磷酸化的ITAMs結合，并被Lck磷酸化，使Zap-70活化，并導致T淋巴細胞活化銜接子（linker for activation of T cells，LAT）和含有76 kDa白細胞蛋白的SH2結構域（SH2 domain containing leukocyte protein of 76 kDa，SLP-76）磷酸化。Src激酶的活化導致磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）的活化，隨后生成磷脂酰肌醇（3，4，5）三磷酸（phosphatidyl-inositol-3，4，5-trisphosphate，PIP3）并在質膜上積累，進而ITK通過其PH結構域被招募到膜上，通過SH3和SH2結構域與磷酸化的SLP-76/LAT銜接復合物相互作用，并在Y511和Y180上磷酸化。ITK還與下游靶標PLCγ1相互作用并直接磷酸化，導致磷脂酶活化。PLCγ1活化后可水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2）產生第二信使1，4，5-三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG），2個第二信使都有助于傳導下游信號以調節(jié)基因表達。下游信號分子包括Ca2+通道、細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，Erk）激活與轉錄、細胞因子釋放和肌動蛋白重組（見圖2）。ITK的缺失不會導致這些下游信號分子的消失，但會使它們明顯減少，導致不同T細胞譜系的發(fā)育和分化發(fā)生改變[9-10]。ITK不是TCR信號傳導所必須的，但它是TCR信號傳導的催化劑，能夠加速細胞對TCR刺激的反應速率[11]。

圖2 ITK在T細胞信號傳導中的作用Figure 2 The role of ITK in T cell signaling

3 ITK與炎癥

ITK與許多炎癥疾病有關。促炎性Th17細胞和抗炎性調節(jié)性T細胞（regulatory cells，Treg）之間的平衡對于產生保護性免疫應答同時最小化自身免疫至關重要，二者的失衡會導致免疫疾病的產生。ITK調節(jié)Th17和Treg免疫應答，研究表明ITK正調控Th17細胞，負調控Treg細胞[12-14]。此外，ITK負調控Th1細胞[14]，在炎癥中也有重要作用。

3.1 急性腎損傷

先天性或適應性免疫細胞會釋放多種促炎細胞因子，它們從體循環(huán)遷移到腎組織，對腎內皮細胞和腎小管上皮細胞造成急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。CD4+T細胞的亞型Th1/Th17被過度激活會導致嚴重炎癥反應，與AKI的發(fā)病有關[15-16]。CD4+T細胞中的ITK對于調節(jié)AKI過程中的炎癥通路有關鍵作用。AKI發(fā)病過程中，ITK在T細胞中處于活化狀態(tài)，抑制ITK可能導致Th1/Th17細胞因子下調和Treg細胞上調，從而使得AKI得到改善[16]。早期損傷階段的特征是γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）表達上調，可能由Th1細胞產生，在后期，Th17細胞使損傷和組織纖維化持續(xù)[17]。抑制ITK可緩解AKI。

3.2 多發(fā)性硬化癥

多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是Th1和Th17細胞侵入中樞神經系統(tǒng)，引起髓鞘組織損傷，導致癱瘓以及神經元損傷和丟失的一種疾病，其病變的組織病理學模式具有異質性，并且在患者之間和疾病的不同階段有所不同[18-19]。研究表明，ITK促進CD4+T細胞遷移到中樞神經系統(tǒng)并導致神經炎癥。ITK在抗原特異性細胞的血腦屏障遷移中可能發(fā)揮作用。因此，ITK的缺失減少了CD4+T細胞進入中樞神經系統(tǒng)和穿越大腦內皮屏障的轉運以及Th1和Th17效應細胞因子的分泌，并且促進了Treg細胞的擴增，使神經炎癥得到抑制[19]。ITK可以調節(jié)炎癥T細胞進入中樞神經系統(tǒng)，成為MS的治療靶點。

3.3 銀屑病

銀屑病是由于角質形成細胞過度增殖和皮膚中免疫細胞浸潤而產生的，在患者手、腳、背部等皮膚上出現(xiàn)明顯的銀色鱗片的慢性皮膚病。研究表明，在人類皮膚上應用咪喹莫特（imiquimod，IMQ）會導致樹突細胞釋放白細胞介素-23（interleulcin-23，IL-23），使Th0向Th17分化，Th17分泌的細胞因子導致角質細胞功能障礙和招募中性粒細胞/樹突細胞，并導致牛皮癬樣炎癥的發(fā)生[20]。通過使用ITK抑制劑可以阻斷ITK信號通路，進而顯著削弱IMQ啟動的Th1/Th17免疫應答，并擴增Treg細胞，最終使銀屑病得到緩解[21]。因此，抑制ITK可能是治療銀屑病型炎癥的一種有效方法。

3.4 系統(tǒng)性紅斑狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種能使多器官逐漸衰弱的慢性自身免疫性疾病，遺傳、環(huán)境因素和荷爾蒙的復雜相互作用導致自身免疫耐受性崩潰，損傷皮膚、關節(jié)、腎、心臟和大腦等多個器官[22]。CD4+T細胞和CD8+T細胞是SLE發(fā)病和產生炎癥的關鍵因素，Th17細胞和IL-17家族的細胞因子在SLE中起重要作用[23]，SLE患者存在Th17/Treg細胞的相互作用，Th17細胞可能抑制Treg細胞的分化[24]。在SLE患者中表達ITK的T細胞（包括CD4+pITK+T、CD8+pITK+T細胞）增多，且與SLE的嚴重程度以及Th17相關細胞因子呈正相關。研究發(fā)現(xiàn)，表達ITK的T細胞和血清中IL-10水平之間沒有顯著的關聯(lián)，這一初步結果不能推斷ITK對Treg細胞的作用，ITK在SLE患者Treg細胞分化中的作用有待進一步探討[25]。目前尚未有ITK抑制劑用于治療SLE的研究。

3.5 肺炎

研究表明，急性肺損傷（acute lung injury，ALI）期間Th17細胞中磷酸化ITK（phosphorylated-ITK，p-ITK）的高表達與中性粒細胞相關炎癥反應上調、肺上皮通透性受損有關。ITK通過上調Th17免疫應答和氧化應激參與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的肺部炎癥和上皮屏障功能障礙。ITK抑制劑通過降低ALI小鼠肺室Th17免疫反應/氧化應激和上調Treg細胞，降低上皮屏障高通透性，改善氣道炎癥[4]。ITK阻斷可能是一種減輕ALI相關氣道炎癥的潛在治療策略。ITK根據(jù)肺部炎癥的類型不同可以差異調節(jié)Th17細胞因子的產生，在直桿糖多孢菌誘導的Th17驅動的過敏性肺部炎癥（hypersensitivity pneumonitis，HP）中，Th17細胞的IL-17A的分泌和細胞因子的產生并不需要ITK[26]。

3.6 潰瘍性結腸炎

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是黏膜炎癥從直腸開始并在結腸向近端延伸的一種慢性炎癥性腸病[27]。研究結果表明，UC患者的黏膜T細胞中ITK磷酸化增加，ITK調節(jié)UC中特有的黏膜細胞因子譜，在UC中表達p-ITK的黏膜CD4+T細胞的擴增與疾病的嚴重程度相關[28]。選擇性靶向ITK是一種治療UC的新策略。

4 ITK抑制劑

ITK在調節(jié)致使炎癥發(fā)生的信號通路中發(fā)揮核心作用。因此，將ITK作為解決T細胞相關疾病的一個關鍵靶點設計新抑制劑是合理的，目前已有多種結構類型的ITK抑制劑被報道（見表1）。

表1 已報道的ITK抑制劑Table 1 ITK inhibitors have been reported

4.1 氨基噻唑類

百時美施貴寶公司使用均相時間分辨熒光法（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）對公司的內部化合物庫進行篩選確定化合物1是一種選擇性ITK抑制劑，IC50為1 μmol · L-1。通過對化合物1的噻唑環(huán)、硫甲基連接子、N-乙酰哌嗪酰胺、中心苯環(huán)、噻唑2-羧酰胺部分分別進行結構修飾，最終將硫芳基的苯環(huán)進行二甲基取代，并在苯甲酰胺的對位引入1個較大的疏水基團，優(yōu)化得到BMS-488516（2），IC50為0.09 μmol · L-1?；衔?對Tec家族激酶具有較高的選擇性（約500倍），在體外具有降低IL-2產生和抑制人及小鼠T細胞增殖的良好活性，但藥代動力學性質不佳，在小鼠中只有高劑量（50和100 mg · kg-1）的皮下給藥有一定效果[29]。因此，又在化合物1的結構基礎上進行新一輪的優(yōu)化，通過構效關系研究，去除了化合物1的硫甲基醚的亞甲基部分、將硫苯基替換為4-甲氧基-6-甲基類似物，并在芐胺上引入1個較大的疏水基團，最終獲得了BMS-509744（3）。與化合物2相比，化合物3具有更強的ITK抑制活性（IC50= 19 nmol · L-1）和更好的藥代動力學性質，但是對Tec家族激酶的選擇性有所降低（約為200倍），口服生物利用度仍然較差（F= 6.4%）[30]。此外，化合物3能顯著降低卵白蛋白誘導的過敏/哮喘小鼠模型的肺部炎癥[31]，能使心臟移植后Th1/Th17反應降低，顯著延長心臟移植的平均存活時間[32]，局部應用可改善小鼠銀屑病樣皮膚炎癥[33]。

4.2 四氫吲唑類

基因泰克公司于2014年通過高通量篩選得到了化合物4，并根據(jù)化合物4與ITK的共晶結構（見圖3A），對化合物4的吲哚的6位、吡唑雜環(huán)、氰苯基取代以及芐位取代進行改造，得到了一系列對ITK表現(xiàn)出較強的抑制活性（Ki＜1 nmol · L-1）和良好的激酶選擇性的化合物，其中化合物5的Ki為0.1 nmol · L-1，對磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）的 IC50為25 nmol · L-1?？赡苡捎跐B透性較低，與化合物4相比，其清除率更低，且沒有表現(xiàn)出良好的生物利用度[34]。為此，在后續(xù)的優(yōu)化中將同時改善化合物的溶解度和滲透性。在第一輪的優(yōu)化中，用四氫吲唑替代化合物4的吲哚母核以降低芳環(huán)數(shù)量，從而降低溶解度預測指數(shù)（solubility forecast index，SFI），以期改善溶解度。在四氫吲哚母核上引入了不同的取代基后發(fā)現(xiàn)，引入偕二甲基能增強對ITK的抑制活性（Ki= 5.3 nmol · L-1），但溶解度并未得到提升。在第二輪的優(yōu)化中，進一步在苯環(huán)芐位引入與化合物5相同的堿性增溶基團，得到四氫吲唑類抑制劑GNE-9822（6）。共晶結構顯示，化合物6的四氫吲唑母核上的偕二甲基伸入鄰近Phe435的親脂性口袋，在鉸鏈區(qū)形成3個氫鍵，并以芐基為中心使苯基與Phe437形成合適的π-π相互作用（見圖3B）。該化合物具有良好的溶解度和中等的滲透性，在人肝細胞中有較低的清除率和較高的人血漿蛋白結合能力，在動物中有良好的生物利用度和較長的半衰期[35]。但在進行體內療效研究時發(fā)現(xiàn)其在肝細胞和Jurkat細胞中具有脫靶效應和細胞毒性。為消除這些缺點，筆者對已合成的四氫吲唑類抑制劑進行分析，發(fā)現(xiàn)細胞毒性與化合物的堿性相關。為此，通過用烷基砜代替堿性胺來降低細胞毒性，用二氟亞甲基環(huán)丙基取代化合物6的偕二甲基以優(yōu)化配體與Phe435附近親脂口袋之間的相互作用來提高抑制作用，最終開發(fā)了GNE-4997（7），其結合模式與化合物6的結合模式一致。酰胺NH與Met438的羰基結合，吡唑與Met438的NH和Glu436的羰基形成氫鍵作用，從而將抑制劑固定在鉸鏈區(qū)。環(huán)砜用于固定苯環(huán)與Phe437的π-π相互作用。環(huán)丙烷的二氟亞甲基位于相鄰Phe435的親脂口袋中（見圖3C）。化合物7的Ki值為0.09 nmol · L-1，對Jurkat細胞PLC-γ磷酸化的抑制作用IC50為4 nmol · L-1，對Jurkat 細胞增殖的IC50為12 μmol · L-1，與化合物6相比，其對Lck的選擇性增加，肝毒性也有所降低[36]。

圖3 化合物4、6、7與ITK激酶結合模式圖Figure 3 The binding pattern of compound 4、6、7 with ITK

4.3 苯并咪唑類

異?；罨腡細胞或NK細胞與許多疾病高度相關。由于在T細胞的發(fā)育過程中，RLK和ITK共同調節(jié)TCR信號通路[37]，因此開發(fā)ITK/RLK雙靶抑制劑將有利于有效阻斷Tec激酶驅動的這些細胞的活化。2015年，Zhong等[38]通過共價靶向技術和基于結構的設計發(fā)現(xiàn)了高選擇性的苯并咪唑類ITK/RLK抑制劑PRN694（8）。化合物8通過與Cys442ITK或Cys350RLK形成一個共價鍵（見圖4），不可逆地抑制ITK和RLK，IC50分別為0.3和1.4 nmol · L-1?；衔?可阻止TCR或Fc受體（FcR）誘導的細胞活化，抑制TCR誘導的T細胞增殖而不產生直接的細胞毒性，并阻斷促炎細胞因子的釋放。在噁唑酮誘導的遲發(fā)性超敏反應（delayed type hypersensitivity，DTH）小鼠模型中，化合物8能減輕遲發(fā)性超敏反應[38]。此外，化合物8對Th1分化、IFN-γ的產生、Th17分化和IL-17A的產生具有較強的抑制作用，而對Th2分化的抑制作用較弱[39]。研究表明，化合物8在Rac1v12小鼠中能抑制T淋巴細胞功能，降低全身腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量，減少促炎細胞因子釋放，并且在IMQ小鼠模型中對銀屑病有一定的治療效果，能夠有效降低銀屑病樣表型的嚴重程度，并減少表皮增殖和厚度[40]。這些研究結果表明， ITK/RLK雙靶點抑制劑在治療T細胞或NK細胞惡性腫瘤以及炎癥和自身免疫性疾病，如銀屑病、類風濕關節(jié)炎、MS和炎癥性腸病方面具有良好的應用前景。

圖4 化合物8與ITK活性部位對接圖（PDB ID: 3QGY）Figure 4 Molecular docking model of compound 8 with ITK active site(PDB ID: 3QGY)

4.4 吡唑并嘧啶類

吡唑并嘧啶類化合物ibrutinib（9）是BTK的不可逆抑制劑，ITK與BTK具有顯著的序列同源性和功能相似性，并且都包含ibrutinib結合位點，該結合位點由1個SH3自磷酸化酪氨酸（tyrosine，Tyr）和1個共價結合半胱氨酸殘基組成。BTK和ITK之間的同源性，以及ibrutinib在ITK Cys442處的潛在共價結合（見圖5）和活性位點的占有率與ibrutinib不可逆結合BTK時的情況類似，使ibrutinib具有ITK活性，IC50為2.2 nmol · L-1。分析證實ibrutinib不可逆地結合ITK并抑制TCR刺激后Th2細胞的活化。由于RLK同樣可以使Th1和CD8+T細胞的活化，因此這種抑制對Th2極化CD4+T細胞具有特異性[41]。此外，Ibrutinib阻斷人Th17細胞和相關細胞因子的體外生成并提高叉頭框蛋白P3（forkhead box protein P3，F(xiàn)OXP3）表達。低劑量ibrutinib可改善人CD4+T細胞體外分化為Treg細胞，高劑量的ibrutinib完全阻斷了Treg細胞的產生[42]。實驗結果證實，Ibrutinib是首個具有臨床可行性的ITK強效和不可逆抑制劑。

圖5 化合物9與ITK活性部位對接圖（PDB ID: 3QGW）Figure 5 Molecular docking model of compound 9 with ITK active site(PDB ID: 3QGW)

PF-06465469（10）是輝瑞公司研發(fā)的吡唑并嘧啶類共價抑制劑。它是以化合物11為基礎進行改造。化合物11是通過化合物庫篩選得到的共價激酶抑制劑，對ITK的IC50為73 nmol · L-1。對化合物11進行細胞肌醇單磷酸酶（inositol monophosphatase，IP1）測試，與酶水平測試結果相比，化合物11在細胞中的效果顯著下降，IC50為2.21 μmol · L-1。為替換不利于代謝的叔丁基，Zapf等[43]設計合成了一系列苯胺、烷基胺衍生物，其中異丙基苯基衍生物（10）的活性有顯著提高，對ITK的IC50為2 nmol · L-1，在細胞和人全血（human whole blood，hWB）分析中也有較好的作用效果，IC50分別為31和48 nmol · L-1?；衔?0與ITK蛋白的對接結果顯示，丙烯酰胺與Cys442形成共價相互作用，2個芳基之間的酰胺鍵與Lys391和Asp500形成氫鍵作用（見圖6）。蛋白結合動力學模擬實驗結果表明化合物10對ITK具有良好的親和力，并且不可逆地與ITK結合，但其對ITK和BTK 2種激酶具有相當?shù)囊种苹钚裕@表明仍需要通過適當?shù)慕Y構修飾，來實現(xiàn)選擇性的提升[43]。

圖6 化合物10與ITK活性部位對接圖（PDB ID: 4HCU）Figure 6 Molecular docking model of compound 10 with ITK active site(PDB ID: 4HCU)

4.5 吡啶酮類

由于3-氨基吡啶-2-酮結構具有與激酶形成多個氫鍵的潛在能力，因此Charrier等[44]選擇該片段作為核心骨架，以化合物Amrinone（12）為設計起點，用苯甲?；娲被?，并在苯甲酰胺環(huán)上引入親脂性基團，對吡啶環(huán)進行結構修飾，并使用帶有SP評分的Glide對接軟件進行虛擬篩選得到吡咯烷甲基吡咯烷基團以增加溶解度，設計了一系列吡啶酮類化合物，其中化合物13對ITK顯示出良好的抑制活性（Ki= 7 nmol · L-1）與BMS-509744相當，具有良好的選擇性。該化合物具有符合口服類藥物特征的理化性質，在pH = 7.4時溶解度為150 μg · mL-1，滲透性良好，外排較少，在滲透性實驗Caco2的研究中，A-B為10.8×10-6cm · s-1，B-A為32.4×10-6cm · s-1。

4.6 磺酰吡啶類

Trani等[45]通過對基因泰克公司高通量篩選得到的化合物14和葛蘭素史克公司發(fā)布的ITK抑制劑化合物15的結構分析，進一步改造得到了化合物16。與化合物15相比，化合物16具有更好的水溶性，但化合物16對Lck缺乏選擇性，且在Jurkat細胞的測試中活性較差（IC50= 2.6 μmol · L-1）。為此，Trani等[45]用苯磺?；娲S基，用吡啶環(huán)替代嘧啶環(huán)來最大化苯環(huán)與ITK的Phe437的π-π相互作用以提高對Lck的選擇性，并在鉸鏈區(qū)用不同的基團進行取代，設計并合成了一系列磺酰吡啶類化合物。其中化合物17的細胞活性（0.17 nmol · L-1）和對Lck的選擇性（182倍）較好，這是因為其環(huán)戊烷環(huán)在ITK中與Phe435能形成更強的親脂性相互作用。該化合物氨基吡唑部分與鉸鏈序列（Met438和Glu436）形成3個氫鍵，砜連接子使苯環(huán)與吡啶環(huán)形成了60°夾角，從而形成了π-π相互作用，環(huán)己醇的羥基與水分子形成氫鍵，并通過與Ser499和Asp500形成氫鍵而更加穩(wěn)定（見圖7）?；衔?7能夠抑制Jurkat細胞的PLC-γ1磷酸化（IC50= 180 nmol · L-1），在人肝微粒體中表現(xiàn)出中高的清除率，在MDR1/MDCK的試驗中表現(xiàn)出中等的滲透性，但它的溶解度等理化性質仍需要進一步改善。

圖7 化合物17與ITK活性部位對接圖（PDB ID: 4QD6）Figure 7 Molecular docking model of compound 17 with ITK active site(PDB ID: 4QD6)

4.7 吲哚基吲唑類

以化合物18（ITK IC50= 10.9 nmol · L-1）為先導化合物，Wang等[46]用不同的親電彈頭修飾烷氧基醚側鏈與Cys442形成共價鍵，以及在吲唑的6位引入不同的取代基占據(jù)Phe435、Lys391、Val377和Ala 389形成的疏水口袋以提高其活性，在吲哚的5位引入不同的芳基取代與Phe437形成T型π-π相互作用以提高對BTK的選擇性，合成了一系列吲哚啉唑類ITK抑制劑。對接結果顯示，化合物19（ITK IC50= 4 nmol · L-1）與ITK形成了3個氫鍵，其苯基近似垂直于Phe473的苯環(huán)（見圖8）。試驗結果表明，化合物19和20（ITK IC50= 5.8 nmol · L-1）可以有效抑制ITK下游底物的磷酸化，當濃度為0.3 μmol · L-1時，Jurkat細胞中的PLCγ1磷酸化被完全抑制（化合物19，EC50= 119 nmol · L-1；化合物20，EC50= 133 nmol · L-1），此外，也抑制Jurkat細胞中ERK1/2的磷酸化，在細胞中對BTK表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性?；衔?9和20具有一定的抗增殖活性，在低微摩爾水平上抑制3種T-ALL細胞（Jurkat，MOLT-4和 CCRF-CEM細胞）和一種皮膚T細胞淋巴瘤細胞（H9）的生長，但對HEK 293 T細胞的抑制作用較弱?；衔?9的半衰期較短、清除率高、分布體積小，因此其可能殘留在循環(huán)系統(tǒng)中。

圖8 化合物19與ITK的ATP結合口袋對接圖（PDB ID:3V5J）Figure 8 Molecular docking model of compound 19 with ATP binding pocket of ITK (PDB ID: 3V5J)

4.8 吡咯并嘧啶類

化合物21是表皮生長因子受體T790M突變體的不可逆抑制劑，在1 μmol · L-1時對ITK的抑制率超過80%，通過參考化合物21的結構，Tang等[47]以7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶骨架為起點對該分子進行合理的設計和改造，進一步提高了其選擇性，從而獲得針對ITK的選擇性共價抑制劑。實驗結果表明，化合物22表現(xiàn)出對ITK的有效活性（IC50= 3.7 nmol · L-1）和對BTK的優(yōu)異選擇性?；衔?2還可以抑制Jurkat細胞中ITK對PLCγ1的磷酸化作用，并對幾種T細胞白血病和淋巴瘤細胞系顯示出良好的抗增殖作用。

4.9 未公開結構

JTE-051和CPI-818是2個已進入臨床試驗階段但結構尚未公開的ITK抑制劑，其基本信息見表2。

表2 臨床試驗中的ITK抑制劑Table 2 ITK inhibitors in clinical trials

JTE-051是日本煙草株式會社研發(fā)的目前唯一進入臨床試驗階段，用于治療類風濕關節(jié)炎和銀屑病的ITK抑制劑，通過抑制激活與免疫反應相關的T細胞的信號來抑制過度活躍的免疫反應，其中治療類風濕關節(jié)炎（NCT02919475）、牛皮癬（NCT03358290）、神經性疼痛（jRCT2031210042）已進入II期臨床試驗。 2021年6月公開的治療類風濕關節(jié)炎的II期臨床數(shù)據(jù)表明[48]，JTE-051在不同的給藥劑量（50、100、150和200 mg）下均具有一定的療效，在258名受試者中僅有8名出現(xiàn)嚴重不良反應，表現(xiàn)為胃腸道功能紊亂（2人）、感染和侵襲（3人）、肌肉骨骼和結締組織疾?。?人）。

CPI-818是Corvus 制藥研發(fā)的一種口服的ITK共價抑制劑，其IC50為2.3 nmol · L-1，選擇性比RLK和BTK高100倍，能抑制外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中ERK和PLCγ的磷酸化，并抑制Jurkat細胞中IL-2的分泌（IC50= 75 nmol · L-1）[49]，可以有效抑制TCR信號的轉導，且對雙陰性T細胞（double negative T cell，DNT）沒有毒性[50]。在自身免疫性淋巴增生綜合征（autoimmune lymphoproliferative syndrome，ALPS）的MRL/lpr小鼠模型中，CPI-818能顯著降低DNT細胞數(shù)量、抑制淋巴結病變和其他疾病的發(fā)生。此外，研究數(shù)據(jù)表明，針對ITK阻斷TCR信號傳導可能是治療成人和兒童ALPS的一種有效策略[51]。臨床相關移植物抗宿主?。╣raft versus host diseases，GVHD）模型研究數(shù)據(jù)表明，抑制ITK可通過抑制T細胞的激活和增殖、降低促炎細胞因子的濃度和增加抗炎因子的濃度來預防急性移植物抗宿主?。╝cute graft versus host disease，aGVAD）[52]。CPI-818在T細胞淋巴瘤的Ⅰ/Ⅰb期臨床試驗（NCT03952078）中的評估結果顯示其具有良好的耐受性和抗腫瘤活性，但其本身的化學結構、優(yōu)化過程尚未公開。Ⅰ期臨床數(shù)據(jù)表明CPI-818通過保留RLK，選擇性抑制ITK，誘導Th1細胞偏斜，以劑量依賴的方式影響T細胞的分化、增殖，在劑量遞增期間未觀察到劑量限制性毒性（dose limited toxicity，DLT），接受200 mg劑量治療的患者達到的藥物血漿濃度與體外觀察到的Th1偏斜一致，該劑量下的6名外周T細胞淋巴瘤患者中有1名維持了15個月的完全緩解（complete remission，CR），有2名病情穩(wěn)定（stable disease，SD）[53]。

5 結語與展望

ITK在T細胞信號傳導、分化、發(fā)育和細胞因子產生中發(fā)揮重要作用，通過調控促炎細胞因子的表達，能夠影響免疫性炎癥的發(fā)生、發(fā)展。目前研究人員雖然設計合成了多種結構的ITK抑制劑，但由于選擇性不佳、理化性質不佳、藥代動力學性質不佳等原因，仍沒有藥物上市，只有JTE-051進入Ⅱ期臨床。由于ITK與BTK之間顯著的同源性，BTK抑制劑如ibrutinib，成為了臨床可行的ITK抑制劑。ITK與RLK的協(xié)同作用使得ITK/RLK雙重抑制劑能產生更有效的抗炎作用。隨著各個化合物與ITK的共晶結構被報道，人們對其了解更加深入，相信終將開發(fā)更安全有效的ITK抑制劑，使患者獲益。