朱禹潼 張曉楠 關(guān)溪 尚東,3*

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合臨床重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116011

2.大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院(學(xué)院),遼寧 大連 116044

3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外三科,遼寧 大連 116011

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨病,以骨量丟失和結(jié)構(gòu)退化為特征,易發(fā)生脆性骨折[1]。骨質(zhì)疏松癥影響著全球2億多人[2]。在中國,骨質(zhì)疏松癥和老齡化的速度都在上升。中國男性和女性老年人大于50歲的骨質(zhì)疏松患病率分別為6.46%和29.13%[3]。在全球范圍內(nèi),骨質(zhì)疏松及其相關(guān)的脆性骨折給患者帶來了巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),一直是主要的健康問題[4-5]。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物有雙膦酸鹽、降鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑和地諾單抗[6]。然而,大多數(shù)藥物有嚴(yán)重的副作用或不適合長期使用。

骨骼經(jīng)過不斷的重塑以保持礦化平衡和結(jié)構(gòu)完整性。骨重建過程中,成骨細(xì)胞(骨形成)與破骨細(xì)胞(骨吸收)相互作用導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)[7]。過度骨吸收引起的骨穩(wěn)態(tài)紊亂可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[8]。來自單核巨噬細(xì)胞的破骨細(xì)胞(osteoclasts,OCs)促進(jìn)骨吸收。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)共同誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化[9]。NF-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)與RANKL結(jié)合,通過激活一系列下游靶向因子激活OCs[10]。

脫氫膽酸(dehydrocholic acid,DHCA)是一種人工合成的膽汁酸衍生物。DHCA作為一種利膽藥,用于治療急性膽源性胰腺炎,可抑制胰腺組織水腫和壞死[11]。也用于治療膽管功能障礙、膽囊結(jié)石等疾病。然而,DHAC在骨質(zhì)疏松癥中的作用尚不清楚。有研究首次報道了正常人血清中DHCA含量顯著高于骨質(zhì)疏松患者[12]。因此,DHCA可能是用于治療骨質(zhì)疏松的一種新方法,本文研究了DHCA在體外對OCs分化和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(美倫公司);RANKL(MedChemExpress公司);Phalloidin-iFluor 594(Abcam公司);OPG和β-actin單克隆兔抗小鼠抗體(Abcam公司);RANK單克隆兔抗小鼠抗體(Zenbio公司);TRAF3單克隆兔抗小鼠抗體(Proteintech公司);TRAP染色試劑盒(Genmed scientific公司);RNA提取試劑盒、Evo M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Green Pro Taq HS預(yù)混qPCR試劑盒(艾科瑞公司);DHCA(CAS編號81-23-2,Panphy Chemicals公司)。

1.2 方法

1.2.1骨髓巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng):由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供雄性C57BL/6小鼠(6～8周齡,體重20 g左右)用于研究(許可證號:AEE19001)。所有小鼠麻醉后頸椎脫位處死。將脛骨和股骨置于無菌超凈實(shí)驗(yàn)臺上,去除脛骨和股骨上的肌肉后,將骨骼置于PBS中。剪斷骨骺,用PBS輕輕沖洗股骨和脛骨的髓腔,直至骨變成半透明。將細(xì)胞懸液離心(1 000 r/min,5 min),加入5 mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞,4 ℃靜置10 min后離心。在DMEM培養(yǎng)基(10%FBS+20 ng/mL GM-CSF)中培養(yǎng)3 d獲得BMMs。

1.2.2破骨細(xì)胞的分化:BMMs在DMEM(10% FBS+20 ng/mL GM-CSF+50 ng/mL RANKL)完全培養(yǎng)基中分化為OCs。DHCA(10、50、100、150、200 μmol/L)與BMMs共培養(yǎng)至OCs分化成熟。培養(yǎng)4 d后采用TRAP染色法對OCs進(jìn)行計(jì)數(shù),顯微鏡下觀察≥3個細(xì)胞核被視為OCs[13]。

1.2.3細(xì)胞活力測定:將細(xì)胞懸液接種于96孔板(2×103細(xì)胞/孔),孵育3 d。在第4天,實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入10、50、100、200、500、1 000 μmol/L DHCA,每組6個復(fù)孔,孵育4 d后,加入CCK8孵育2 h后在波長450 nm,測定各孔的吸光度值。

1.2.4破骨細(xì)胞F-肌動蛋白(F-actin)染色:DHCA作用培養(yǎng)4 d采用F-actin染色。取出細(xì)胞培養(yǎng)皿,PBS沖洗細(xì)胞3次。4%多聚甲醛固定,0.5% Triton X-100溶液透化處理。加入Phalloidin-iFluor 594對F-actin染色。使用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染,共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察。

1.2.5qRT-PCR:Trizol法提取總RNA。使用Evo M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。最后,采用SYBR?Green Pro Taq HS預(yù)混qPCR試劑盒檢測OCs形成和分化相關(guān)基因。采用2-△△Ct法對結(jié)果進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6Western blot:培養(yǎng)至OCs分化成熟后,提取細(xì)胞蛋白。SDS-PAGE跑膠,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,然后用5%脫脂牛奶封閉1 h,按照說明書稀釋TRAF3、OPG、RANK(1∶2 000)和β-actin(1∶5 000),4 ℃孵育過夜。二抗(1∶10 000)于次日室溫孵育1 h。采用ECL系統(tǒng)(Tanon-5200)進(jìn)行印跡檢測。根據(jù)灰度值數(shù)據(jù)(ImageJ 1.8.0)分析各蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 8.4.3對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,用t檢驗(yàn)分析兩組間的顯著性差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHCA抑制破骨細(xì)胞形成

為探討DHCA抑制OCs分化的有效濃度,首先檢測DHCA的細(xì)胞毒性,結(jié)果顯示當(dāng)DHCA濃度≥500 μmol/L時,細(xì)胞活力下降(圖1A)。隨后分別用10、50、100、150、200 μmol/L DHCA干預(yù)OCs分化。TRAP染色顯示,與未使用DHCA的對照組相比,DHCA處理后TRAP陽性細(xì)胞(紅色區(qū)域)數(shù)量呈劑量依賴性減少。DHCA在200 μmol/L時對OCs分化的抑制率最大(圖1B、1C)。

圖1 DHCA抑制破骨細(xì)胞分化

2.2 DHCA抑制破骨細(xì)胞F-actin環(huán)的形成

采用破骨細(xì)胞F-actin染色,以觀察成熟的破骨細(xì)胞F-actin的形成。與對照組(未使用DHCA)相比,DHCA能抑制F-actin環(huán)的形成,見圖2。

圖2 DHCA抑制破骨細(xì)胞F-actin環(huán)的形成

2.3 DHCA抑制破骨細(xì)胞形成與分化功能相關(guān)基因表達(dá)

用200 μmol/L DHCA干預(yù)OCs分化,qRT-PCR檢測OCs特異性基因ACP5、CTSK和MMP9的表達(dá)水平。如圖3所示,與對照組(未使用DHCA)相比,DHCA顯著抑制了與OCs分化成熟相關(guān)的ACP5 mRNA,以及與骨吸收功能相關(guān)的CTSK和MMP9 mRNA的表達(dá)。

圖3 DHCA抑制破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)

2.4 DHCA通過OPG/RANK和TRAF3抑制破骨細(xì)胞分化

Western blot結(jié)果顯示,與對照組(未使用DHCA)相比,DHCA顯著增加OPG水平,降低RANK水平,見圖4。結(jié)果表明,DHCA通過抑制OPG/RANK/RANKL信號通路抑制OCs分化。RANKL刺激后,TRAF3蛋白水平降低,DHCA可逆轉(zhuǎn)該作用。DHCA可通過抑制TRAF3蛋白降解從而抑制OCs分化。

圖4 DHCA通過OPG/RANK和TRAF3抑制OCs分化(DHCA體外作用4 d)

3 討論

骨重建功能穩(wěn)態(tài)依賴于成骨細(xì)胞的骨形成和OCs的骨吸收的共同維持。OCs的過度激活導(dǎo)致骨量丟失和骨微結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨病。抑制OCs的活化、分化和功能是目前公認(rèn)的治療骨質(zhì)疏松的有效方法。目前尚無DHCA用于治療骨質(zhì)疏松或其他骨代謝疾病的報道。根據(jù)代謝組學(xué)分析,骨質(zhì)疏松患者血清中DHCA含量較正常人明顯降低,為骨代謝疾病藥物的開發(fā)提供了拓展思路。在OC和OC前體細(xì)胞中,RANKL與其配體RANK結(jié)合,通過激活下游通路,包括NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶,刺激OC相關(guān)下游因子的表達(dá),導(dǎo)致OC的分化、活化和成熟[14-15]。本研究中,TRAP染色顯示DHCA以劑量依賴性方式抑制RANKL誘導(dǎo)的OCs形成。ACP5在活化的OCs中高表達(dá),是OCs分化的特異性基因。CTSK是OCs中最重要的細(xì)胞因子,對骨組織具有特異性降解活性,反映了OCs的骨吸收功能[16]。MMP參與了骨的發(fā)育、修復(fù)以及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。OCs分化過程中MMP9的表達(dá)上調(diào),進(jìn)而刺激骨吸收[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)DHCA通過下調(diào)ACP5、CTSK和MMP9基因的表達(dá)來抑制OCs分化和骨吸收。

OPG/RANK/RANKL信號通路在調(diào)控成骨細(xì)胞和OCs的成熟和分化,維持成骨細(xì)胞和OCs的動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[19]。OPG/RANKL/RANK信號的異常調(diào)控是骨質(zhì)疏松發(fā)生的前提。OC前體細(xì)胞或OC表面RANK與RANKL結(jié)合,介導(dǎo)信號激活OC前體細(xì)胞分化為成熟OC,抑制OC凋亡[20-21]。OPG是一種分泌型糖蛋白,屬于TNF受體超家族。OPG可與RANKL競爭性結(jié)合,從而抑制RANKL與RANK結(jié)合,抑制OCs分化和骨吸收活性[22-23]。DHCA可上調(diào)OPG蛋白的表達(dá),下調(diào)RANK蛋白的表達(dá),表明DHCA通過OPG/RANK/RANKL信號通路抑制OCs分化。

TNF受體相關(guān)因子(TNF receptor-associated factors,TRAF)是OCs中RANK激活所必需的[24]。RANK通過招募TRAFs啟動下游信號級聯(lián)[25]。TRAFs由多種亞型組成,TRAF2、TRAF3和TRAF6在OCs分化的研究中常見。TRAF3使cIAP1/2介導(dǎo)K48-link泛素化,導(dǎo)致蛋白酶體中TRAF3降解,激活非經(jīng)典NF-κB信號通路[26-28]。TRAF3抑制衰老中破骨細(xì)胞的生成[29]。此外,一項(xiàng)研究表明氯喹可以通過阻止TRAF3降解來減少破骨細(xì)胞的生成[30]。本研究結(jié)果表明TRAF3是OCs形成的重要負(fù)調(diào)控因子,表明DHCA可以通過阻斷TRAF3的降解來抑制OCs的形成。

綜上所述,本研究表明DHCA抑制OCs形成與分化,可能是通過抑制OPG/RANK/RANKL信號通路及阻斷TRAF3降解,抑制OCs形成與分化。