鄭小花 徐穎 林超琴 胡德婷 鄭啟斌

1.福建省婦幼保健院 福建醫(yī)科大學(xué)婦兒臨床醫(yī)學(xué)院,福建 福州 350001

2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院倉山院區(qū)婦產(chǎn)科,福建 福州 350025

3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,福建 福州 350001

4.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院濱海院區(qū)國家區(qū)域醫(yī)療中心神經(jīng)外科,福建 福州 350212

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)中最常見的一種類型,常發(fā)生于女性絕經(jīng)后 5～10 年內(nèi)[1]。目前我國OP患病人數(shù)約為9 000萬,女性約7 000萬[2]。2023年國家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布2022年末我國60歲及以上人口占19.8%,65歲及以上占14.9%[3]。人口的老齡化使PMOP在女性中的患病率快速攀升。PMOP最嚴(yán)重的后果是骨質(zhì)疏松性骨折,更年期的女性發(fā)生較嚴(yán)重的骨折后的剩余壽命較發(fā)生乳腺癌后的剩余壽命要短[4]。高發(fā)病率及其并發(fā)癥的高致殘率、高致死率等問題使PMOP成為我國醫(yī)療衛(wèi)生面臨的重大挑戰(zhàn),亟需有效的PMOP防治措施[5]。電刺激作為一種傳統(tǒng)安全且經(jīng)濟(jì)有效的康復(fù)治療手段在OP的應(yīng)用較多,經(jīng)皮穴位電刺激(transcutaneous electrical acupoint stimulation,TEAS)治療可緩解疼痛、增強(qiáng)肌力、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù),改善肢體功能[6]。TEAS 是以經(jīng)絡(luò)穴位理論為指導(dǎo),并結(jié)合經(jīng)皮神經(jīng)電刺激的一種物理療法[7],其將電極片貼在目標(biāo)穴位對(duì)應(yīng)的皮膚,設(shè)定所需要的頻率、脈寬等參數(shù)電流輸入人體,刺激人體的穴位和周圍神經(jīng)或經(jīng)絡(luò)以達(dá)到治療OP等疾病的目的,較傳統(tǒng)針灸更無創(chuàng)及可控性。本實(shí)驗(yàn)通過觀察TEAS對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清骨代謝指標(biāo)及骨密度的影響,探討不同頻率TEAS在調(diào)節(jié)骨平衡方面的療效,為其防治PMOP的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:32只清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)雌性健康大鼠,5月齡,體重為320～388 g,購于中國斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010],動(dòng)物飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,并由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供專用飼料飼養(yǎng),通風(fēng)良好的潔凈層流環(huán)境(SPF級(jí)環(huán)境),室溫18 ℃～25 ℃,模擬晝夜各12 h的光照,相對(duì)濕度(50±5)%,每周更換2次墊。自由攝食和飲潔凈水,所有進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的物品均嚴(yán)格高溫消毒或紫外線消毒處理。本實(shí)驗(yàn)依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)指導(dǎo)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及管理,已得到福建省婦幼保健院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理號(hào):2021KLD667)。

1.1.2主要儀器與試劑:LGT-231手持神經(jīng)肌肉電刺激儀(廣州龍之杰科技有限公司),雙能X線骨密度儀(美國HOLOGIC DISCOVERY W型);上海西唐生物科技有限公司ELISA檢測試劑盒:骨特異性堿性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型原膠原C端前肽(PICP)、Ⅰ型原膠原N端前肽(PINP)、Ⅰ型膠原羧基端肽(ICTP)、吡啶啉(Pyr)、脫氧吡啶啉(D-Pyr)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組與造模:SD大鼠適應(yīng)性生長1周后采取隨機(jī)編號(hào),分為假手術(shù)組(Sham組)、OVX 組(模型對(duì)照組)、2 Hz組(0VX+TEAS 2 Hz組)、50 Hz組(0VX+TEAS 50 Hz組)。后3組均進(jìn)行卵巢去勢骨質(zhì)疏松模型的建立:采用國內(nèi)外公認(rèn)的雌性大鼠PMOP模型[8]。術(shù)前注射10%水合氯醛溶液麻醉(0.2 mL/100 g體質(zhì)量),無菌操作下摘除大鼠雙側(cè)卵巢,Sham組則只切除卵巢附近等體積的脂肪,術(shù)后縫皮封口,每日觀察大鼠皮膚傷口情況,碘伏消毒傷口,根據(jù)傷口情況腹腔注射青霉素G 5萬～10萬單位,1 次/d,連續(xù) 3 d,防止術(shù)后感染。

1.2.2干預(yù)方法:造模后1個(gè)月2 Hz 組、50 Hz 組大鼠背部進(jìn)行消毒,剃毛、脫毛,暴露出需要貼電極片的皮膚,根據(jù)大鼠穴位圖譜,在大鼠背部“命門穴”(雙側(cè))、“環(huán)跳穴”(雙側(cè))相應(yīng)的部位粘上電極片(電極片定期更換),LGT-231手持神經(jīng)肌肉電刺激儀,調(diào)整相應(yīng)頻率,電流強(qiáng)度設(shè)置為大鼠局部肌肉輕度收縮為度,4～10 mA,治療時(shí)間為 30 min,每日1次,每周治療 5 d休息2 d,連同休息日,共12周。Sham組、OVX組不予TEAS治療及其他干預(yù),同實(shí)驗(yàn)組一同飼養(yǎng)、管理。

1.2.3指標(biāo)檢測:3個(gè)月后左心室采血并處死各組大鼠,全血室溫放置30 min后離心10 min,取上層血清于無菌凍存管中,行ELISA測定,按照各定量測定試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行,所有樣品同批次測定,以避免批間誤差。分離出腰椎和右側(cè)股骨,剝除附著的軟組織,用經(jīng)生理鹽水浸透的醫(yī)用紗布包裹右側(cè)股骨和椎骨,放置于-80 ℃冰箱中保存待用。檢測時(shí)將解凍后的骨樣本整齊地?cái)[放在檢測床上開始檢測,用雙能X線骨密度儀對(duì)大鼠第4～6腰椎及右股骨頸Ward’s三角區(qū)BMD進(jìn)行測量。選擇大鼠骨密度高分辨模式,行間距0.070 0 cm,點(diǎn)分辨率0.062 2 cm,6.10×0.10 Coll,140/100kVp。結(jié)果用g/cm2表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),正態(tài)分布且方差齊者采用LSD檢驗(yàn),方差不齊者采用Games-Howell檢驗(yàn),非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)(秩和檢驗(yàn)),結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn) ɑ=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨形成標(biāo)志物

OVX組較Sham組血清BALP、PICP、PINP均顯著增高(P<0.05),TEAS 2 Hz組較OVX組血清BALP、PICP、PINP均顯著降低(P<0.05),且與Sham組無差別;50 Hz組較OVX組相比無顯著變化,與Sham組相比血清BALP、PINP升高,PICP與Sham組無差別(P=0.336)。2 Hz組較50 Hz組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

表1 各組大鼠血清骨形成標(biāo)志物比較

2.2 各組大鼠骨吸收標(biāo)志物

OVX組較Sham組血清ICTP、Pyr、D-Pyr均顯著增高(P<0.05),TEAS 2 Hz組、50 Hz組較OVX組血清ICTP、Pyr、D-Pyr均顯著降低(P<0.05),TEAS 50 Hz組較Sham組血清ICTP、Pyr、D-Pyr無明顯區(qū)別(P>0.05),2 Hz較50 Hz組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清骨吸收標(biāo)志物比較

2.3 腰椎及右股骨骨密度的影響

OVX組較Sham組腰椎及右股骨骨密度均顯著降低(P<0.05 ),TEAS 2 Hz組較OVX組腰椎及股骨骨密度均顯著增高(P<0.05),且腰椎骨密度較Sham組無差異;TEAS 50 Hz組較Sham組顯著降低(P<0.05 ),較OVX組骨密度無區(qū)別,2 Hz腰椎骨密度較50 Hz組高(P=0.048),但股骨骨密度均無區(qū)別,見表3。

表3 各組大鼠腰椎及右股骨骨密度比較

3 討論

PMOP是由于女性絕經(jīng)后雌激素缺乏,進(jìn)而引起骨代謝紊亂,導(dǎo)致骨量丟失、BMD下降及骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的全身代謝性骨病。骨組織通過骨重塑的過程不斷發(fā)生變化[9]。PMOP是一種高轉(zhuǎn)換代謝型骨病,骨吸收率大于骨形成率,從而導(dǎo)致骨丟失。細(xì)胞因子、骨吸收標(biāo)志物、骨形成標(biāo)志物、基因、受體等決定骨代謝的內(nèi)環(huán)境和代謝調(diào)節(jié)過程,而且也是決定骨質(zhì)量、骨強(qiáng)度的重要因素[10]。骨形成標(biāo)志物反映成骨細(xì)胞活性及骨吸收水平,骨吸收標(biāo)志物反映破骨細(xì)胞活性及骨形成狀態(tài)。推薦敏感性較高的骨形成標(biāo)志物包括BALP、PICP、PINP等,以及骨吸收標(biāo)志物主要包括ICTP、Pyr、D-Pyr等[11]。既往臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)TEAS在OP中治療有效,本實(shí)驗(yàn)通過骨形成及骨吸收標(biāo)志物探討TEAS在骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物中的作用,以期探討其抗OP機(jī)制。

BALP是成骨細(xì)胞的一種細(xì)胞外酶,其主要作用是在成骨過程中水解磷酸酶,為羥基磷灰石的沉積提供磷酸,同時(shí)水解焦磷酸鹽,有利于成骨[11]。高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松、骨折患者中,血清BALP明顯升高。本實(shí)驗(yàn)中,與Sham組相比,OVX組術(shù)后3個(gè)月BALP顯著升高,體現(xiàn)了OVX造模術(shù)后呈高轉(zhuǎn)換代謝型OP模型。TEAS 2 Hz干預(yù)后較OVX組相比降低,50 Hz無明顯變化,說明2 Hz TEAS可能參與BALP的調(diào)節(jié)促進(jìn)骨形成。血清Ⅰ型前膠原水解,去除其羧基及氨基端的附加肽段,生成原膠原,前膠原去除下來的羧基端附加肽段稱PICP,氨基端附加肽段稱PINP。PICP、PINP由成骨細(xì)胞合成,其在血清中的含量反映成骨細(xì)胞合成骨膠原的能力,即Ⅰ型膠原的合成速率,是新骨形成的特異性的敏感指標(biāo)[12]。TEAS 2 Hz組PINP、PICP較OVX組降低,體現(xiàn)了TEAS可能通過促進(jìn)PICP、PINP從而促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成,干預(yù)OP的過程。

本研究結(jié)果顯示,OVX大鼠 ALP、PINP、PICP等較Sham組升高,提示模型組大鼠骨代謝處于高轉(zhuǎn)換狀態(tài),成骨細(xì)胞代謝活躍所致。經(jīng)電刺激干預(yù)后,TEAS 2 Hz組較OVX組血清BALP、PICP、PINP均顯著降低(P<0.05),且與Sham組無差別,提示其參與骨形成過程,且促進(jìn)新骨的形成療效顯著,可能通過骨形成途徑。結(jié)論與其他學(xué)者一致,如王巧靈[13]予補(bǔ)腎壯骨湯聯(lián)合針灸對(duì)骨質(zhì)疏松患者進(jìn)行治療,ALP、PINP均低于對(duì)照組。Wiesmann等[14]研究顯示,電刺激能明顯調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖及分化,進(jìn)而影響骨代謝和重建,達(dá)到抑制骨吸收,促進(jìn)骨形成和逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松的作用。50 Hz組血清骨形成標(biāo)志物與OVX組相比無顯著變化,但血清BALP、PINP與Sham組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且50 Hz TEAS干預(yù)后與OVX組相比腰椎、股骨骨密度均未增加,提示其可能未參與骨形成過程。

ICTP是Ⅰ型膠原在骨吸收過程中的降解產(chǎn)物之一,是骨吸收的特異及敏感的生化指標(biāo),同時(shí)不受飲食和腎濾過率的影響,是反映破骨細(xì)胞膠原降解的重要指標(biāo)[15]。Pyr和D-Pyr是骨Ⅰ型膠原的特異組分,在骨膠原合成膠原纖維時(shí),骨溶解時(shí)在羥賴氨酰氧化酶的作用下,由骨膠原分子蛋白水解釋放出來,進(jìn)入血循環(huán),排入尿中[16]。Pyr和D-Pyr幾乎僅存在于骨骼和牙組織中,在血液和尿中以游離和肽結(jié)合形態(tài)存在。以上3種骨吸收標(biāo)志物能夠及時(shí)直觀地反映骨溶解程度和敏感反應(yīng)骨丟失范圍。本實(shí)驗(yàn)中OVX組術(shù)后ICTP、Pyr、D-Pyr均高于Sham組,說明OVX術(shù)后破骨細(xì)胞的骨吸收活性增強(qiáng),骨丟失增加,但經(jīng)TEAS治療后兩組骨吸收指標(biāo)均較OVX組降低,且與Sham組無區(qū)別,TEAS可能通過調(diào)節(jié)骨吸收標(biāo)志物干預(yù)骨代謝平衡,增加腰椎、股骨骨密度以達(dá)到抗PMOP的作用。

2020年發(fā)布的《中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(shí)》中明確指出針刺、穴位貼敷法可有效緩解骨質(zhì)疏松性疼痛[17]。電針是應(yīng)用中醫(yī)理論,用針刺入腧穴得氣后,在針上連接人體生物電的微量電流波以加強(qiáng)持續(xù)刺激穴位,從而達(dá)到治療疾病的一種療法。TEAS 兼具針刺及低頻電刺激的療效,通過刺激肌纖維的收縮帶動(dòng)骨骼肌的運(yùn)動(dòng),提高肌肉的質(zhì)量,維持對(duì)骨的應(yīng)力刺激,促進(jìn)骨重建[18]。TEAS能避免患者對(duì)傳統(tǒng)針刺疼痛的顧慮,依從性好。時(shí)克昌等[19]的臨床研究證實(shí),TEAS可改善骨質(zhì)疏松癥狀,但其未闡述相關(guān)作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)TEAS組ALP、PINP、PICP等較OVX組低,同時(shí)ICTP、Pyr、D-Pyr降低,提示可能通過骨代謝平衡參與其調(diào)節(jié)OP。

低頻電的參數(shù)包括頻率、周期、波寬、通斷比、波形等,臨床儀器中很多參數(shù)相對(duì)固定,對(duì)生物效應(yīng)影響較大的是頻率及強(qiáng)度[20],陳善堂等[21]指出固定頻率(15 Hz)脈沖電磁場在1.10～4.10 mT的強(qiáng)度下對(duì)小鼠MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力無明顯影響,因此對(duì)頻率的可調(diào)節(jié)性及爭議也較大。低頻電流式指頻率1 000 Hz以下的脈沖電流,每次通電能使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)發(fā)生興奮,超過1 000 Hz則不能引起興奮。臨床常用的低頻電是在100 Hz以下。有學(xué)者將電極連接到100 MHz任意波形發(fā)生器以各種頻率(1、2.5、5、10、15、20、30、40、50、60和100 Hz)行電刺激,探討動(dòng)態(tài)骨骼肌電刺激在刺激肌肉收縮、誘導(dǎo)骨骼髓內(nèi)壓變化的最佳頻率。發(fā)現(xiàn)在20、50 Hz肌肉電刺激時(shí)股骨骨小梁質(zhì)量改善更明顯[22]。但Swift等[23]對(duì)脊髓損傷患者股四頭肌、腘繩肌和臀肌進(jìn)行連續(xù)性刺激電刺激(50 Hz),結(jié)果發(fā)現(xiàn)腰椎和股骨頸區(qū)域的BMD均無變化。本實(shí)驗(yàn)中選擇TEAS頻率為2 Hz及50 Hz,是文獻(xiàn)報(bào)道比較常見的兩種頻率,以此作為低頻率及中高頻的代表,結(jié)果證實(shí)這兩種頻率均有參與血清骨代謝的調(diào)節(jié),2 Hz的TEAS均可降低骨形成標(biāo)志物BALP、PINP、PICP及骨吸收標(biāo)志物ICTP、Pyr、D-Pyr,50 Hz僅降低骨吸收標(biāo)志物,表明2 Hz TEAS參與骨吸收及骨形成過程,且干預(yù)后腰椎及股骨BMD均升高,50 Hz TEAS只參與骨吸收過程,且50 Hz干預(yù)的大鼠的骨密度并未升高,考慮2 Hz頻率的TEAS可能更有利于臨床抗OP的治療。

在電針治療中,多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的頻率低于10 Hz,結(jié)論均提示抗OP效果顯著。如柏中喜等[24]以電脈沖頻率2 Hz(120 r/min),強(qiáng)度為1 mA行經(jīng)皮穴位電刺激,發(fā)現(xiàn)增加絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的骨密度及生物力學(xué)。經(jīng)皮電刺激的治療模式中針灸樣刺激頻率是1～4 Hz,脈沖寬度是0.2～0.3 ms,出現(xiàn)脈沖式肌肉抽搐,適用于急慢性疼痛、長期止痛及周圍循環(huán)障礙。絕經(jīng)后肌肉骨關(guān)節(jié)癥狀常見肩、頸腰背部肌肉和肌腱疼痛,肩、膝、腰骶關(guān)節(jié)和手指關(guān)節(jié)等部位的疼痛,常伴有骨關(guān)節(jié)炎[25]。因此2 Hz頻率的TEAS可能較50 Hz頻率更適合緩解PMOP引起的急慢性骨關(guān)節(jié)肌肉疼痛癥狀。

綜上所述,本研究采用TEAS干預(yù)PMOP大鼠模型,結(jié)果提示2 Hz TEAS參與骨吸收及骨形成過程,且干預(yù)后腰椎及股骨BMD均升高,50 Hz TEAS只參與骨吸收過程,且50 Hz干預(yù)的大鼠的BMD并未升高,考慮TEAS改善 PMOP 可能與其參與血清骨轉(zhuǎn)化標(biāo)志物調(diào)節(jié)骨平衡代謝有關(guān),且2 Hz頻率的TEAS可能更有利于臨床抗OP的治療。本實(shí)驗(yàn)初步探討了TEAS改善PMOP及方案,為TEAS防治PMOP的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。