王祎琳，伍迎歡，趙燕英

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，青藏高原動(dòng)物保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青藏高原動(dòng)物保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

異體移植炎癥因子1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)是一種分子量約為17 ku 的鈣結(jié)合蛋白，其主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌[1]。異體移植炎癥因子1 基因首先從大鼠(Rattus norvegicus)心臟移植排斥物中克隆[2]。此外，其他研究小組純化或鑒定的daintain[3]、離子化鈣聯(lián)調(diào)節(jié)因子[4]和小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)答因子1[5]都可能是異體移植炎癥因子1 的類似物，但其功能的一致性尚待驗(yàn)證。在人(Homo sapiens)中，異體移植炎癥因子1 的基因定位于人類白細(xì)胞抗原Ⅲ區(qū)域[4]，提示其與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。較多研究顯示，異體移植炎癥因子1 與器官移植排斥[6]、炎性血管病變[7]、自身性免疫疾病[8]、癌癥[9]等炎性疾病相關(guān)。目前已鑒定了多種生物的異體移植炎癥因子1 序列，序列比對顯示其高度同源[1]，預(yù)示著其功能的相似性。

在水生生物中，已有報(bào)道稱鰻弧菌(Vibrio anguillarum) 的誘導(dǎo)使菲律賓蛤仔(Ruditapes phil-ippinarum)血細(xì)胞中異體移植炎癥因子1 的表達(dá)水平在72 h 后達(dá)到峰值[10]。溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、出血性敗血癥病毒(viral hemorrhagic septicemia virus)刺激了鮑(Haliotis)血細(xì)胞異體移植炎癥因子1 的表達(dá)[11]。類立克次體(Rickettsia-lick organism)/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 激發(fā)了近江牡蠣(Crassostrea ariakensis)血細(xì)胞中異體移植炎癥因子1 的表達(dá)[12]，此外，革蘭氏陽性細(xì)菌/脂多糖也激發(fā)了海膽(Echinoidea)體腔細(xì)胞異體移植炎癥因子1 的表達(dá)[13-14]。上述研究表明，病原微生物可激活水生生物異體移植炎癥因子1 在免疫細(xì)胞尤其是血細(xì)胞中的表達(dá)，提示異體移植炎癥因子1 參與了水生生物的天然免疫，但其具體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，但同時(shí)草魚病害較多。筆者前期克隆了草魚異體移植炎癥因子1 基因序列[15]，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討異體移植炎癥因子1 對草魚血液白細(xì)胞活力和炎性因子釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

草魚(300～500 g)購自成都市水產(chǎn)市場。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和福利經(jīng)西南民族大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。魚(淡水)全血淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；RPMI-1 640 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；胎牛血清購自 Gibco 公司；青鏈霉素雙抗(雙抗)、BCA 蛋白分析試劑盒、紅細(xì)胞裂解液、CCK8 試劑盒、活性氧檢測試劑盒及線粒體膜電位檢測試劑盒購自Bioswamp 公司；AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)；ATP 含量檢測、一氧化氮檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；脂多糖、牛血清白蛋白購自Sigma 公司；超濾管購自Millipore公司，淡水魚腫瘤壞死因子α (No.JYM0045Fs)、白細(xì)胞介素1β (No.JYM0047Fs)和白細(xì)胞介素6(No.JYM0091Fs) ELISA 檢測試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司。

超凈工作臺(tái)購自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀購置芬蘭雷勃診斷有限公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司；流式細(xì)胞儀購自Beckman 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

草魚白細(xì)胞準(zhǔn)備 從市場購買體重(300±50) g 的草魚，在(28.0 ± 0.5) °C 水循環(huán)系統(tǒng)中養(yǎng)殖1 周。養(yǎng)殖條件：5～10 mg/L 溶解氧，每天喂養(yǎng)3 次5%體重的魚飼料，12 h 光暗交替。1周后，從草魚尾靜脈取血，按1∶1 (體積比)與樣本稀釋液混勻，加入等體積淋巴細(xì)胞分離液后，在外周血單核細(xì)胞離心管中離心。離心后取環(huán)狀乳白色細(xì)胞層，用清洗液重懸細(xì)胞 3 次。加入紅細(xì)胞裂解液，裂解紅細(xì)胞至溶液透亮，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，終止裂解。離心后將白細(xì)胞轉(zhuǎn)入含10% 胎牛血清的RPMI-1 640 培養(yǎng)基中。

蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot) 在1×106個(gè)/mL 草魚白細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入100 ng/mL 脂多糖。48 h 后收集細(xì)胞外液并濃縮，通過Western blot 檢測異體移植炎癥因子1 的分泌水平。BCA 蛋白分析試劑盒定量總蛋白質(zhì)濃度后，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。5%牛血清白蛋白封閉。接著將膜與草魚異體移植炎癥因子1 抗體[15](1∶1 000)在4 °C 孵育過夜，并用TBST(含有20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，0.14 mol/L NaCl，0.1% Tween 20) 徹底清洗，二抗孵育后化學(xué)發(fā)光法檢測免疫復(fù)合物。

細(xì)胞活力 使用CCK-8 試劑盒檢測草魚外周血白細(xì)胞活力。將1×105個(gè)/mL 草魚白細(xì)胞接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為4 組，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。每組分別加入終濃度為0、0.1、1.0、10.0 nmol/L 的草魚異體移植炎癥因子1 重組蛋白[15]處理48 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液4，37 °C 孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的光吸收值。

線粒體膜電位、ATP 含量 利用JC-1 熒光探針評估線粒體膜電位，流式細(xì)胞儀檢測JC-1的單體和多聚體信號[16]。計(jì)算JC-1 多聚體和單體的比例用于衡量線粒體膜電位的高低。此外，裂解細(xì)胞，去除蛋白質(zhì)，以ATP 為標(biāo)準(zhǔn)，利用ATP 檢測試劑盒測定胞內(nèi)ATP 的含量。

細(xì)胞凋亡、一氧化氮檢測 按1×106細(xì)胞/孔濃度將草魚白細(xì)胞接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入上述濃度異體移植炎癥因子1 處理48 h 后，收集細(xì)胞，重懸于結(jié)合緩沖溶液中，195 μL，2×105個(gè)/mL 細(xì)胞與5 μL Annexin V-FITC 室溫避光孵育30 min。PBS 洗滌后，用PI 進(jìn)行雙染。流式細(xì)胞儀檢測不同凋亡階段的細(xì)胞比例。同時(shí)，活性氧、一氧化氮檢測試劑盒分析細(xì)胞中活性氧和一氧化氮的水平。

腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β 和白細(xì)胞介素6 含量測定 異體移植炎癥因子1 處理草魚白細(xì)胞48 h 后，分別利用腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β 和白細(xì)胞介素6 ELISA 檢測試劑盒測定細(xì)胞外液中這3 種細(xì)胞因子的含量，同樣在450 nm 處檢測光吸收值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用 SPSS 17.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的差異使用t檢驗(yàn)，P<0.05 時(shí)認(rèn)定為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 脂多糖對異體移植炎癥因子分泌的影響

脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的主要組成部分，能誘發(fā)宿主細(xì)胞的固有免疫，在細(xì)菌的識(shí)別、黏附、轉(zhuǎn)移和致病過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)100 ng/mL 脂多糖刺激后，草魚白細(xì)胞分泌的異體移植炎癥因子1 極其顯著升高(圖1)，提示異體移植炎癥因子1 參與了病原菌感染引發(fā)的草魚免疫應(yīng)答。

圖1 草魚異體移植炎癥因子(AIF-1)的分泌(a) Western blot 影像，(b) AIF-1 蛋白相對水平；1.脂多糖，2.對照，***P<0.001；下同。Fig.1 The secretion of allograft inflammatory factor-1(AIF-1) in C.idella(a) Western blot image,(b) the relative level of AIF-1;1.LPS,2.control,***P<0.001;the same below.

2.2 細(xì)胞活力

為了探索草魚異體移植炎癥因子1 的分泌對白細(xì)胞的影響，本實(shí)驗(yàn)通過外加純化的草魚異體移植炎癥因子1 重組蛋白后，檢測白細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示，雖然0.1 nmol/L 異體移植炎癥因子1并未明顯增強(qiáng)白細(xì)胞，但1.0 nmol/L 和10.0 nmol/L異體移植炎癥因子1 以濃度依賴的形式極其顯著提高了白細(xì)胞活力(P<0.001)(圖2)。

圖2 草魚白細(xì)胞活力Fig.2 Cell viability of C.idella leukocyte

2.3 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞活力的降低很可能誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測了異體移植炎癥因子1 的提高對白細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，草魚異體移植炎癥因子1 在1.0 和10.0 nmol/L 時(shí)降低了白細(xì)胞的凋亡率，包括早期凋亡率和晚期凋亡率，尤其是10.0 nmol/L 異體移植炎癥因子1 處理(圖3)。

圖3 草魚白細(xì)胞凋亡(a) 對照，(b) 0.1 nmol/L AIF-1，(c) 1.0 nmol/L AIF-1，(d) 10.0 nmol/L AIF-1，(e) 異體移植炎癥因子1 對白細(xì)胞凋亡的影響；(a)～(d).凋亡熒光圖像；*P<0.05，***P<0.001。Fig.3 Cell apoptosis of C.idella leukocyte(a) control,(b) 0.1 nmol/L AIF-1,(c) 1.0 nmol/L AIF-1,(d) 10.0 nmol/L AIF-1,(e) effect of AIF-1 on leukocyte apoptosis;(a)-(d) fluorescent images;*P<0.05,***P<0.001.

2.4 線粒體活性

線粒體功能障礙是細(xì)胞凋亡的重要原因，為了進(jìn)一步闡釋異體移植炎癥因子1 抑制草魚白細(xì)胞凋亡的原因，本實(shí)驗(yàn)檢測了異體移植炎癥因子1 對白細(xì)胞線粒體功能的影響。結(jié)果顯示，異體移植炎癥因子1 改善了線粒體ATP 的產(chǎn)生(圖4-a)，這主要源于異體移植炎癥因子1 增強(qiáng)了線粒體膜電位(圖4-b)。

圖4 線粒體功能(a) ATP 含量，(b) 線粒體膜電位(△Ψm)；**P<0.01。Fig.4 Mitochondrial function(a) ATP content,(b) mitochondrial membrane potential;**P<0.01.

2.5 炎性介質(zhì)的釋放

在宿主免疫應(yīng)答中，激活的白細(xì)胞將產(chǎn)生和釋放多種炎性因子。本實(shí)驗(yàn)分別檢測了異體移植炎癥因子1 對常見炎性介質(zhì)包括一氧化氮和活性氧產(chǎn)生以及炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β 和白細(xì)胞介素6 的分泌。結(jié)果顯示，異體移植炎癥因子1 提高了一氧化氮(圖5-a)和活性氧(圖5-b)的產(chǎn)生，同時(shí)刺激了腫瘤壞死因子α(圖6-a)、白細(xì)胞介素1β(圖6-b)和白細(xì)胞介素6(圖6-c)的分泌，提示異體移植炎癥因子1 激活了草魚外周血白細(xì)胞。

圖5 一氧化氮和活性氧的產(chǎn)生(a) 一氧化氮水平，(b) 活性氧水平。Fig.5 Nitric oxide and reactive oxygen species production(a) nitric oxide,(b) reactive oxygen species.

圖6 炎性細(xì)胞因子的分泌(a) 腫瘤壞死因子α，(b) 白細(xì)胞介素1β，(c) 白細(xì)胞介素6。Fig.6 Inflammatory cytokine secretion(a) tumor necrosis factor-alpha (TNF-α),(b) interleukin 1β (IL1β),(c) interleukin 6 (IL6).

3 討論

水生生物先天免疫系統(tǒng)是其抵抗病原微生物感染的堅(jiān)實(shí)屏障。如前所述，菲律賓蛤仔、近江牡蠣、鮑及海膽的異體移植炎癥因子1 參與了病原菌、病毒和/或脂多糖刺激的免疫應(yīng)答[10-14]，但異體移植炎癥因子1 在免疫應(yīng)答激活過程中扮演的角色還不清楚。

研究顯示，菲律賓蛤仔、鮑、近江牡蠣的異體移植炎癥因子主要在血細(xì)胞表達(dá)[10-12]，考慮到異體移植炎癥因子1 是可分泌的細(xì)胞因子[1]。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測了脂多糖刺激后草魚外周血白細(xì)胞異體移植炎癥因子1 的釋放，結(jié)果顯示，脂多糖顯著刺激了血細(xì)胞分泌的異體移植炎癥因子1 水平，這一結(jié)果與其他小組發(fā)現(xiàn)的脂多糖誘導(dǎo)了近江牡蠣血細(xì)胞中異體移植炎癥因子1 的表達(dá)[12]和海膽體腔細(xì)胞異體移植炎癥因子1 的表達(dá)[13-14]結(jié)果相呼應(yīng)，進(jìn)一步說明異體移植炎癥因子1 參與了革蘭氏陰性細(xì)菌感染水生生物引發(fā)的免疫應(yīng)答。

為了探查異體移植炎癥因子1 的分泌上調(diào)在免疫激活中的作用，本實(shí)驗(yàn)檢測了異體移植炎癥因子1 對外周血白細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，異體移植炎癥因子1 誘導(dǎo)了外周血白細(xì)胞的增殖，雖然在水生生物中還未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的研究。但在小鼠(Mus musculus)巨噬細(xì)胞中的研究同樣顯示，削弱異體移植炎癥因子1 的表達(dá)會(huì)抑制巨噬細(xì)胞的增殖，而重建異體移植炎癥因子1 的表達(dá)則恢復(fù)了巨噬細(xì)胞的增殖[17]。因此，異體移植炎癥因子1 對草魚外周血細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。

另一方面，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測量了外周血白細(xì)胞的凋亡。與增殖上調(diào)的結(jié)果相一致，異體移植炎癥因子1 的添加抑制了草魚外周血白細(xì)胞的凋亡，在大鼠中，干擾異體移植炎癥因子1 的表達(dá)誘導(dǎo)了大鼠巨噬細(xì)胞的凋亡，而共轉(zhuǎn)染其過表達(dá)質(zhì)粒后，反轉(zhuǎn)了干擾載體所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]。因此，異體移植炎癥因子1 對于血液白細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞的增殖是至關(guān)重要的。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)供給能量的細(xì)胞器，其對于細(xì)胞的存活不可或缺。線粒體的功能障礙直接導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡。尤其是線粒體內(nèi)膜的通透性增加，引發(fā)了線粒體膜電位降低(去極化)，往往是細(xì)胞由存活走向凋亡的關(guān)鍵一步。在本研究中，草魚異體移植炎癥因子1 提高了線粒體ATP 的產(chǎn)量，這可能主要源于其對線粒體膜電位的維持，進(jìn)而抑制了外周血細(xì)胞的凋亡。

免疫細(xì)胞在激活的過程中會(huì)產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，這些炎性介質(zhì)可殺滅病原菌，如一氧化氮和氧自由基。一氧化氮由一氧化氮合酶產(chǎn)生，它和氧自由基一起組成過氧化亞硝酸鹽，過氧化亞硝酸鹽可透過靶細(xì)胞細(xì)胞膜，擴(kuò)散至細(xì)胞核，造成靶細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的硝化和氧化損傷[19]。本實(shí)驗(yàn)中草魚異體移植炎癥因子1 刺激了白細(xì)胞的一氧化氮和氧自由基的產(chǎn)生，提示其在白細(xì)胞殺滅病原菌的過程中發(fā)揮作用。這也與在大鼠中，異體移植炎癥因子1 促進(jìn)一氧化氮產(chǎn)生相一致[18]。而我們前期研究也顯示，小鼠血液中異體移植炎癥因子1 的提高引發(fā)了血液氧化應(yīng)激[20]。

除了炎癥介質(zhì)以外，細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞在殺滅病原體時(shí)釋放的另一類小分子。細(xì)胞因子可以進(jìn)一步誘發(fā)白細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其向病灶的遷移，也可消除病原體和異常細(xì)胞，而大量的炎性細(xì)胞因子則會(huì)引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，造成組織和器官損傷，甚至是個(gè)體的死亡。在本實(shí)驗(yàn)中，異體移植炎癥因子1 顯著誘發(fā)了炎性細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β 和白細(xì)胞介素6的分泌，而Zhang 等[21]也發(fā)現(xiàn)牡蠣異體移植炎癥因子提高了腫瘤壞死因子、白介素17 和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子的mRNA 水平。上述結(jié)果提示，異體移植炎癥因子1 在免疫激活，尤其是“細(xì)胞因子風(fēng)暴”中承擔(dān)了一定的角色。

綜上所述，本研究顯示脂多糖誘導(dǎo)了草魚外周血白細(xì)胞異體移植炎癥因子1 的釋放，過量的異體移植炎癥因子1 刺激了白細(xì)胞的增殖，抑制了白細(xì)胞凋亡，這可能與線粒體功能的改善相關(guān)。同時(shí)異體移植炎癥因子1 誘發(fā)了炎性介質(zhì)一氧化氮、氧自由基及炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1β 和白細(xì)胞介素6 的分泌，提示異體移植炎癥因子1 參與了草魚外周血白細(xì)胞的激活。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）