海薩·艾也力汗，張 鈺，楊博文，咸玉蘭，高 攀，沈玉幫

(1.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830000；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

白斑狗魚(Esox lucius)隸屬狗魚目(Esociformes)狗魚科(Esocidae)狗魚屬(Esox)。分布于北緯45 °以北的亞洲、歐洲和北美洲的北極圈周邊地區(qū)[1]，中國(guó)境內(nèi)僅分布于額爾齊斯河流域。該流域是我國(guó)唯一的白斑狗魚種質(zhì)資源庫寶庫。白斑狗魚生長(zhǎng)速率快、肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，已成為新疆地區(qū)，乃至河北等地主要養(yǎng)殖品種。由于額爾齊斯河位于白斑狗魚自然分布區(qū)域的最南端，因此全球氣候變暖引起的極端天氣對(duì)我國(guó)境內(nèi)白斑狗魚養(yǎng)殖和野生群體的影響較大。已有研究表明，水溫超過18 °C 時(shí)白斑狗魚受精卵孵化率下降，水溫超過27 °C 幼魚的攝食和生長(zhǎng)受到影響[2]。因此白斑狗魚熱耐受性研究和耐高溫性狀的遺傳改良已成為白斑狗魚種質(zhì)資源保護(hù)和產(chǎn)業(yè)化可持續(xù)發(fā)展亟待解決的問題之一。

基于高通量測(cè)序技術(shù)，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS 分析)方法篩選與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)InDel標(biāo)記和候選基因已廣泛應(yīng)用于牛[3]、山羊[4]、雞[5]、羊[6]等動(dòng)物的遺傳改良研究中。在水產(chǎn)動(dòng)物中，傘利擇等[7]基于卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)基因組重測(cè)序的 InDel 標(biāo)記挖掘與耐低氧性狀關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)InDel 位點(diǎn)接近顯著閾值，注釋分析獲得了9 個(gè)候選基因。陳靜[8]基于全基因組重測(cè)序獲得了魴屬(Megalobrama)魚類高質(zhì)量的SNP、InDel 等變異位點(diǎn)信息，并構(gòu)建了魴屬魚類群體的基因組變異數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫在描述基因型-表型圖譜以及親魚選擇中發(fā)揮了重要的作用。黃智康等[9]基于 InDel 標(biāo)記建立了斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)早期性別鑒定方法。競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR (Kompetitive allele specific PCR，KASP)技術(shù)是英國(guó)政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室(Laboratory of the Government Chemist，LGC)開發(fā)的檢測(cè)SNP 和InDel 的第三代標(biāo)記技術(shù)，具有高通量、成本低、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)[10]，已成為利用 SNP 進(jìn)行育種的首選標(biāo)記[11]。

本研究為了篩選白斑狗魚耐熱性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記和候選基因，通過熱脅迫獲得2 個(gè)極端群體樣品，結(jié)合簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選出與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的InDel 位點(diǎn)，利用KASP 技術(shù)對(duì)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，挖掘與白斑狗魚耐熱性狀顯著關(guān)聯(lián)的InDel 標(biāo)記和候選基因，為白斑狗魚耐熱性狀的遺傳改良和分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

簡(jiǎn)化基因組測(cè)序材料：實(shí)驗(yàn)魚親魚采自額爾齊斯河北屯段、布爾津縣段以及烏倫古湖。2021年4 月12 日至4 月14 日通過人工采集和授精獲得受精卵。受精卵孵化、苗種培育在同一循環(huán)系統(tǒng)的14 個(gè)矩形槽(長(zhǎng)×寬×高：400 cm×60 cm×80 cm)中進(jìn)行培育至幼魚，隨機(jī)挑選450 尾(平均全長(zhǎng)90.45 mm，平均體重5.85 g)作為下一步熱脅迫材料。標(biāo)記驗(yàn)證材料：2022 年4 月通過人工繁育獲得受精卵，與上一步相同的方法培育至幼魚期，隨機(jī)挑選400 尾(平均全長(zhǎng)83.31 mm，平均體重3.96 g/尾)作為下一步的熱脅迫材料。本研究在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例和使用倫理規(guī)范執(zhí)行。

1.2 熱脅迫實(shí)驗(yàn)

苗種培育至幼魚期(2 月齡)后隨機(jī)挑選450尾在一個(gè)長(zhǎng)×寬×高為400 cm×60 cm×80 cm 的矩形槽中暫養(yǎng)7 d 后開展熱脅迫實(shí)驗(yàn)。熱脅迫實(shí)驗(yàn)期間利用3 個(gè)1 000 W 的智能PID 變頻加熱棒控溫，實(shí)驗(yàn)全過程持續(xù)充氣，提供足夠的活體餌料，每天換1/3 相同溫度的水。升溫策略：暫養(yǎng)期間水溫(26.0±0.5) °C，在30.0 °C 之前以1 °C/12 h 的速率升溫，在30.0 °C 之后以1 °C/24 h 的速率升溫至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每2 小時(shí)測(cè)量一次水溫和溶解氧。我們對(duì)實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行了24 h 連續(xù)監(jiān)測(cè)，及時(shí)撈出死魚，記錄體長(zhǎng)、全長(zhǎng)、體重和累計(jì)存活時(shí)間，收集肌肉組織，浸泡于無水乙醇，保存于-20 °C。最早死亡的110 尾和最后死亡的110 尾實(shí)驗(yàn)魚分別被認(rèn)為是熱敏感組和耐高溫組，進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。KASP 驗(yàn)證材料的熱脅迫實(shí)驗(yàn)同上，實(shí)驗(yàn)魚在暫養(yǎng)期死亡13 尾，對(duì)387 尾實(shí)驗(yàn)魚開展熱脅迫實(shí)驗(yàn)。最先死亡的24 尾視為熱敏感組，最后死亡的24 尾視為耐高溫組，采集鰭條組織，用酚-氯仿法抽提基因組DNA，-20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

熱脅迫實(shí)驗(yàn)篩選出的熱敏感組和耐高溫組肌肉組織送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，通過隨機(jī)測(cè)序式基因型檢測(cè)(genotyping-by-sequencing，GBS)技術(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。采用限制性內(nèi)切酶PstI-HF/MspI 對(duì) DNA 進(jìn)行酶切，酶切后的片段兩端用 T4 連接酶加接頭和 barcode；使用改進(jìn)的磁珠回收系統(tǒng)，通過調(diào)整磁珠溶液與連接產(chǎn)物的體積比來回收 300～700 bp 的片段；對(duì)回收片段使用高保真酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；使用 Qubit 測(cè)定 PCR產(chǎn)物濃度，濃度需大于 5 ng/μL；將混好的文庫上機(jī)(Illumina Nova,PE150)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用軟件Stacks 過濾原始測(cè)序條目，以去除接頭序列和低質(zhì)量堿基。去除接頭序列，去除N(非AGCT)堿基大于或等于5 的讀數(shù)，去除低質(zhì)量讀數(shù)(質(zhì)量值Q ≤ 20)。利用 BWA 軟件將 clean reads 比對(duì)到白斑狗魚基因組Eluc_v4 版本(PRJNA221548)上，根據(jù)比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)樣品的測(cè)序深度和參考基因組覆蓋度。使用 GATK4 軟件的 Haplotypecaller 模塊進(jìn)行InDel 檢測(cè)。為了降低InDel 檢測(cè)的錯(cuò)誤率，選用 QD≥2.0 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾，只保留同時(shí)滿足該條件的突變位點(diǎn)。其中 QD 是突變質(zhì)量值(quality)除以覆蓋深度(depth) 得到的比值，實(shí)際上就是單位深度的突變質(zhì)量值，大部分假陽性突變的 QD 值都小于2。使用 vcftools 進(jìn)一步過濾：保留 reads 支持深度不小于 4 的位點(diǎn)，刪除最小等位基因頻率(MAF)小于 0.01 的位點(diǎn)，保留個(gè)體檢出率大于 80% 的位點(diǎn)。使用 SnpEff 軟件對(duì)得到的 InDel 進(jìn)行注釋，以確定 InDel 在基因元件的位置、對(duì)氨基酸的變化影響等。過濾后的InDel 數(shù)據(jù)利用TASSEL5.2.80 軟件進(jìn)行親緣關(guān)系分析，利用R 語言可視化。使用GAPIT3 程序包進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。關(guān)聯(lián)分析時(shí)白斑狗魚耐高溫性狀(UTT)記錄為二元表型數(shù)據(jù)，分別為0=耐高溫組和1=熱敏感組。前2 個(gè)PCA 為協(xié)變量，以MLM 模型(Masked Language Model)進(jìn)行GWAS 分析，以假陽性檢出率(false discovery rate,FDR)校正的P<0.05 為閾值，篩選顯著的SNP 位點(diǎn)。IGV 軟件可視化分析顯著位點(diǎn)的具體位置，統(tǒng)計(jì)InDel 位點(diǎn)在每個(gè)個(gè)體中的分布情況 (表1)。

表1 MLM 模型GWAS 分析中與耐熱性狀顯著關(guān)聯(lián)的InDel 位點(diǎn)Tab.1 InDel sites significantly associated with heat tolerance traits in GWAS analysis of the MLM models

1.5 KASP 驗(yàn)證候選InDel 位點(diǎn)

與白斑狗魚耐高溫性狀顯著關(guān)聯(lián)的InDel 位點(diǎn)前后100 bp 的序列，利用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物 (表2)。每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條正向引物和一條反向引物。兩條正向引物3′為InDel 位點(diǎn)，5′段分別加FAM(5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′)和 HEX (5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′)熒光序列標(biāo)簽。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系按LGC公司KASP TF V4.0 2×Master Mix 96 Std Rox 試劑盒說明配置，反應(yīng)程序包括94 °C 預(yù)變性15 min；94 °C 變性20 s，63～57 °C 復(fù)性/延伸60 s (-0.6/循環(huán))，循環(huán)10 次；57 °C 復(fù)性/延伸60 s，循環(huán)25 次；37 °C 熒光數(shù)據(jù)讀取60 s。根據(jù)分型結(jié)果再次運(yùn)行一下程序：57 °C 復(fù)性/延伸60 s，循環(huán)1～6 次；37 °C 熒光數(shù)據(jù)讀取60 s。反應(yīng)使用CFX96 Real-Time System 完成。

表2 9N del 位點(diǎn)KASP 引物序列Tab.2 KASP primer sequence of 9N del site

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果分析

熱敏感組中第1 尾實(shí)驗(yàn)魚在33 °C 存活8 h 0 min 后死亡，最后1 尾實(shí)驗(yàn)魚在34 °C 存活15 h 40 min 后死亡，時(shí)間跨度為31 h 40 min。耐高溫組中的第1 尾實(shí)驗(yàn)魚35 °C 存活6 h 15 min 后死亡，最后1 尾實(shí)驗(yàn)魚在35 °C 存活13 h 56 min 后死亡，時(shí)間跨度尾6 h 15 min。

本研究利用Illumina 平臺(tái)獲得白斑狗魚熱敏感組109 尾和耐高溫組103 尾個(gè)體的簡(jiǎn)化基因組數(shù)據(jù)。全部樣本比對(duì)率范圍為 91.32%～99.79%，平均測(cè)序深度為 7.98×，覆蓋度范圍為 10.52%～9.9%。經(jīng)過突變位點(diǎn)檢測(cè)并過濾，共獲得 12 821個(gè)InDel 位點(diǎn)，其中插入3 683 個(gè)，缺失為9 138個(gè)。通過對(duì)InDel 位點(diǎn)在基因組上的位置分析，發(fā)現(xiàn)大部分InDel 分布在內(nèi)含子，占所有InDel 位點(diǎn)的63.69%，基因間InDel 位點(diǎn)占9.80%，外顯子只有1.30% (圖1)。獲得的InDel 平均密度為36.67 InDel/Mb，NC_047579 號(hào)染色體密度最大55.41 InDel/Mb，NC_047593 號(hào)染色體密度最小22.59 InDel/Mb(圖2)。

圖1 InDel 在基因組上的分布Fig.1 The distribution of InDel across the genome

圖2 InDel 標(biāo)記在25 條染色體上的分布密度圖Fig.2 The distribution density diagram of InDel markers on 25 chromosomes

2.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

親緣關(guān)系分析結(jié)果顯示，大多數(shù)個(gè)體的親緣關(guān)系介于0.1～0.4，群體中親緣關(guān)系值較均勻(圖3-a)，表明群體結(jié)構(gòu)對(duì)GWAS 分析結(jié)果的影響小。QQ 圖檢驗(yàn)本研究分析的變異位點(diǎn)的有效性，結(jié)果顯示，在橫坐標(biāo)呈現(xiàn)的均勻分布近似于基因組上的隨機(jī)漂變，當(dāng)P-value 小于e-3時(shí)，真實(shí)的GWAS 結(jié)果與均勻分布出現(xiàn)分離(圖3-b)，說明遺傳變異與耐熱性狀相關(guān)性，同時(shí)表明元分析的GWAS 數(shù)據(jù)的可靠性和代表性。

圖3 InDel 標(biāo)記親緣關(guān)系分析圖(a)和QQ 圖(b)Fig.3 Phylogenetic analysis diagram (a) and QQ diagram (b) of InDel markers

曼哈頓圖呈現(xiàn)了GWAS 分析結(jié)果，即12 821個(gè)InDel 位點(diǎn)所在的染色體位置和FDR 值大小，虛線分隔為FDR 校正后的閾值FDR <0.05，實(shí)線分割線為FDR 校正后的閾值FDR <0.01，5 個(gè)InDel 位點(diǎn)通過閾值檢驗(yàn)，表現(xiàn)出與耐熱性狀的顯著相關(guān)性(圖4)。

圖4 InDel 標(biāo)記的曼哈頓圖數(shù)字1～25 依次代表NC_047569.1 至NC_047593.1 的染色體。Fig.4 Manhattan diagram of InDel markersThe numbers 1-25 represent chromosomes from NC_047569.1 to NC_047593-1.

實(shí)驗(yàn)對(duì)25 個(gè)染色體中的InDel 標(biāo)記，以前兩個(gè)PCA 為協(xié)變量，利用MLM 模型與白斑狗魚的耐熱性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)位點(diǎn)與目標(biāo)性狀極顯著關(guān)聯(lián)(FDRP-value<0.01)，1 個(gè)位點(diǎn)為顯著關(guān)聯(lián)(FDRP-value<0.05)。這些位點(diǎn)位于未知基因LOC117593903、CLSTN2、safb基因的內(nèi)含子中。其中，9N del、4N del-1 和4N del-2三個(gè)位點(diǎn)位于NC_047571.1 號(hào)染色體的CLSTN2基因第二個(gè)內(nèi)含子中，9N del 和4N del-1 間有40個(gè)堿基，4N del-1 和4N del-2 間有246 個(gè)堿基。9N del 和4N del-1 位點(diǎn)在熱敏感組中的DI 基因型個(gè)體為37 尾、DD 為72 尾，耐高溫組中DI 基因型個(gè)體為83 尾、DD 為20 尾。4N del-2 位點(diǎn)DI基因型個(gè)體為34 尾、DD 為75 尾，耐高溫組中DI 基因型個(gè)體為80 尾、DD 為23 尾。2N del 位點(diǎn)在熱敏感組中的DD 基因型個(gè)體為21 尾、DI為35 尾、II 為53 尾，耐高溫組中DD 基因型個(gè)體為20 尾、DI 為87 尾、II 為1 尾。3N ins 位點(diǎn)在熱敏感組中DD 基因型個(gè)體為89 尾、DI 為20 尾，耐高溫組中DD 基因型個(gè)體為94 尾、DI為7 尾、II 為2 尾。

2.3 KASP 驗(yàn)證

IGV 軟件可視化分因型為20 尾，4N del-2 位點(diǎn)DI 基因型為80 尾、DD 基因型為23 尾。9N del 和4N del-1 位點(diǎn)在212 尾個(gè)體析顯示，熱敏感組中9N del 和4N del-1 位點(diǎn)DI 基因型個(gè)體為37 尾、DD 基因型為72 尾，4N del-2 位點(diǎn)DI 基因型為34 尾、DD 基因型為75 尾。耐高溫組中9N del 和4N del-1 位點(diǎn)DI 基因型個(gè)體為83 尾、DD基中的基因型分布無差異，4N del-2 位點(diǎn)與前兩者的差異僅為2.83%，212 尾個(gè)體中3 個(gè)位點(diǎn)基因型分布高度連鎖。因此我們針對(duì)9N del、2N del和3N ins 位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以驗(yàn)證群體DNA 為模板，利用KASP 技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，分型結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，2N del 和3N ins 位點(diǎn)未通過驗(yàn)證，9N del 位點(diǎn)在熱敏感組DD 基因型占37.5%(9 尾)，DI 基因型為25%(6 尾)，未知占37.5%(9 尾)，在耐高溫組中DD 基因型占8.3%(2 尾)，DI 基因型為58.3%(14 尾)，未知占33.3%(8 尾)。9N del 位點(diǎn)DD 基因型個(gè)體在熱敏感組中占優(yōu)勢(shì)，DI 基因型個(gè)體在耐高溫組中占優(yōu)勢(shì)，未發(fā)現(xiàn)插入純合(II)，驗(yàn)證結(jié)果與簡(jiǎn)化基因組測(cè)序結(jié)果基本一致。

圖5 KASP 基因分型圖橘色圓圈為缺失純合FAM 基因型(DD)，綠色三角為雜合基因型(DI)，黑色棱形為對(duì)照或未知基因型。Fig.5 Genotyping graph based on KASPThe orange circle represents the missing homozygous FAM genotype(DD),the green triangle represents the heterozygous genotype (DI),and the black prisms represent control or unknown genotypes.

3 討論

本研究對(duì)白斑狗魚109 尾熱敏感組和103 尾耐高溫組個(gè)體進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，經(jīng)過濾后獲得12 821 個(gè)InDel 位點(diǎn)?；蚪M上的位置分析發(fā)現(xiàn)，大部分InDel 分布在內(nèi)含子(63.69%)，外顯子分布的InDel 位點(diǎn)較少(1.30%)。這一結(jié)果符合非編碼區(qū)的InDel 變異多于編碼區(qū)的生物學(xué)特性[12]。GWAS 分析，未發(fā)現(xiàn)與白斑狗魚的耐高溫性狀顯著關(guān)聯(lián)的編碼區(qū)InDel 位點(diǎn)，與耐熱性狀顯著關(guān)聯(lián)的5 個(gè)InDel 位點(diǎn)均分布于內(nèi)含子。由于內(nèi)含子不是編碼區(qū)序列，一度認(rèn)為基因組中的“垃圾序列”。但近幾年研究證實(shí)，內(nèi)含子與基因表達(dá)、細(xì)胞骨架構(gòu)建和動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)[13-14]。在饑餓條件下酵母中大多數(shù)內(nèi)含子可促進(jìn)細(xì)胞的生存[15]，內(nèi)含子保留的mRNA 不僅在細(xì)胞的正常發(fā)育中調(diào)控基因表達(dá)，還在脅迫的應(yīng)答中起著重要的作用[16-17]。隨著內(nèi)含子生物學(xué)功能的不斷證實(shí)，內(nèi)含子區(qū)域的變異也被重視。雖然魚類InDel 標(biāo)記研究較少，但在牛、綿羊、山羊、雞等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)了與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的基因內(nèi)含子區(qū)InDel 位點(diǎn)，并影響了所在基因的表達(dá)。Shi 等[3]在發(fā)現(xiàn)中國(guó)黃牛品種的SMAD3 基因內(nèi)含子中檢測(cè)到1 個(gè)17 bp 的插入片段與SMAD3 轉(zhuǎn)錄水平顯著相關(guān)；大連雪龍牛SREBP1 基因第5 內(nèi)含子InDel變異與背膘厚具有顯著相關(guān)[18]；Li 等[6]在綿羊PRNP基因中發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)內(nèi)含子多態(tài)性，通過關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，4 個(gè)內(nèi)含子InDel 均與綿羊13個(gè)不同生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)；陜西白絨山羊KDM6A基因內(nèi)含子的一個(gè)16 bp 插入/缺失顯著影響KDM6A基因的表達(dá)，并與陜西白絨山羊生長(zhǎng)相關(guān)性狀之間的關(guān)聯(lián)[4]；Wei 等[19]在雞LDB2 基因第2內(nèi)含子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)31 bp InDel 突變位點(diǎn)，通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該InDel 與多個(gè)生長(zhǎng)性狀和胴體性狀顯著相關(guān)，并影響LDB2 基因在肌肉組織中的表達(dá)。由此推斷，本研究中發(fā)現(xiàn)的5 個(gè)InDel 突變可能會(huì)對(duì)白斑狗魚的耐熱性狀產(chǎn)生顯著的影響，可作為白斑狗魚耐熱性狀改良的候選分子標(biāo)記。

對(duì)所發(fā)現(xiàn)的5 個(gè)與白斑狗魚耐熱性狀顯著關(guān)聯(lián)InDel 位點(diǎn)注釋和IGV 可視化結(jié)果顯示，2N del 位點(diǎn)位于未知基因LOC117593903 內(nèi)含子中，3N ins 位于safb基因內(nèi)含子中。與目標(biāo)性狀極顯著關(guān)聯(lián)(FDR <0.01)的9N del、4N del-1 和4N del-2 三個(gè)InDel 位點(diǎn)均位于CLSTN2 基因第3 內(nèi)含子，并9N del 和4N del-1 間僅有40 個(gè)堿基，4N del-1和4N del-2 間有246 個(gè)堿基。上述3 個(gè)位點(diǎn)在212 尾個(gè)體中的基因型分布高度連鎖。在驗(yàn)證群體中KASP 基因分型結(jié)果顯示，9N del 位點(diǎn)DD基因型個(gè)體在熱敏感組中占優(yōu)勢(shì)，DI 基因型個(gè)體在耐高溫組中占優(yōu)勢(shì)。有意思的是我們[20]之前發(fā)現(xiàn)的白斑狗魚耐熱性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)HT1位于4N del-1 和4N del-2 間。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與包括鹽脅迫、冷和熱刺激等非生物脅迫應(yīng)答，并脅迫信號(hào)能改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平[21]。過高的體溫具有直接的細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。因此，跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)被中斷，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子的濃度增加。蛋白質(zhì)和DNA 的合成也在該途徑中不同階段被中斷[22]。CLSTN2(Calsyntenin-2,CLSTN2)是鈣結(jié)合蛋白家族(Calsyntenins，CLSTNs)成員之一，是I 型跨膜蛋白，分布于腦、心臟、骨骼肌、肝臟、胰腺、胎盤和肺組織中[23]。CLSTNs對(duì)Ca2+有高度親和性的蛋白質(zhì)，其能夠通過與Ca2+結(jié)合參與Ca2+的運(yùn)輸、吸收與分泌[24]。此外，白斑狗魚CLSTN2 基因第2 內(nèi)含子為超長(zhǎng)內(nèi)含子(34 365 bp)。王玲平[25]認(rèn)為，超長(zhǎng)的內(nèi)含子通常采用外顯子限定的剪接模式，因此更容易發(fā)生可變剪接；此外，由于內(nèi)含子越長(zhǎng)，伴隨的基因轉(zhuǎn)錄時(shí)間也就越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)錄時(shí)受到干擾而終止的可能性也就越高，因此越長(zhǎng)的內(nèi)含子，其處理的不可預(yù)測(cè)性就越大。由此推斷，CLSTN2 可能是白斑狗魚耐高溫性狀相關(guān)的重要候選基因。與白斑狗魚耐熱性狀顯著關(guān)聯(lián)的3 個(gè)InDel 和1 個(gè)SNP 位點(diǎn)均位于CLSTN2第二內(nèi)含子，而CLSTN2 第二內(nèi)含子為超長(zhǎng)內(nèi)含子，容易發(fā)生可變剪切和轉(zhuǎn)錄終止從而影響CLSTN2 基因的轉(zhuǎn)錄。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）