周啟苓，馬 騫,2*，王劉永，毛非凡，楊二軍，陳 剛,2

(1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524025；2.廣東海洋大學，南方海洋科學與工程廣東省實驗室 (湛江)，廣東 湛江 524025)

硬骨魚體內(nèi)約99%的鈣以碳酸鈣和羥基磷灰石的形式儲存在各種骨組織中[1]。這些骨組織通過形成和再吸收的動態(tài)循環(huán)過程不斷被重塑，以維持魚體的骨穩(wěn)態(tài)，骨骼的這種新陳代謝過程即為魚類的骨代謝。骨代謝的表現(xiàn)形式主要為鈣的生物礦化(骨形成)及再活化(骨吸收)，分別由成骨細胞[2]和破骨細胞[3]來完成。因此，鈣代謝可作為骨代謝的重要表征之一。魚類的骨骼系統(tǒng)由內(nèi)骨骼(頭骨、脊柱和肋骨等)及外骨骼(鰭和鱗)共同組成。鱗是魚類外骨骼的重要組成部分，其在細胞組成方面與其他高等脊椎動物骨骼相似[2-3]。據(jù)報道，硬骨魚類中鱗組織的鈣含量可高達機體總鈣的20%[1,3]。與其他內(nèi)骨骼相比，鱗組織中的鈣化鹽在機體對鈣的需求增加時最優(yōu)先被活化利用[1,3-4]。此外，鱗組織還具有數(shù)量多、易于采集等特點，因此可作為魚類骨代謝研究的優(yōu)良載體。

降鈣素(calcitonin,CT)是由甲狀腺濾泡旁細胞(C 細胞)分泌的一種小分子多肽激素，可特異性作用于破骨細胞上的降鈣素受體，抑制破骨細胞的活性，從而達到抑制骨鹽溶解、阻礙鈣由骨組織中釋出并最終降低血鈣的作用，在維持鈣穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[5-6]。此外，CT 能夠刺激成骨細胞增殖和分化，增強成骨細胞黏附能力；還可通過促進OPG表達，抑制成骨細胞的凋亡，使成骨細胞數(shù)量增加[7-8]。已有研究表明，CT 對骨形成過程的調(diào)節(jié)作用主要通過Wnt/β-catenin 和RANKL/RANK/OPG 信號通路完成[9]。

鮭降鈣素(salmon calcitonin,sCT)主要是從鮭科(Salmonidae)魚類鰓中分離純化而來，具有活性高、半衰期長等優(yōu)點[10]。Gou 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射sCT 可減輕大鼠(Rattus norvegicus)軟骨表面病變并顯著增加其軟骨厚度。在饑餓處理的金魚(Carassius auratus)中，腹腔注射sCT 可降低其血漿中的Ca 含量，并促進鱗、肋骨和咽骨等組織的鈣沉積[12]。腹腔注射sCT 也能夠顯著降低烏鱧(Channa punctatus)血鈣水平，同時顯著提高骨骼中的鈣含量[13]。由此可見，sCT 作為脊椎動物、尤其是硬骨魚類鈣代謝過程的有效鈣調(diào)因子，對于骨代謝水平具有較強的調(diào)節(jié)作用。

miRNA 是一類長約18～25 nt 的具有調(diào)控功能的非編碼單鏈RNA[14]。脊椎動物中，miRNA 可通過與mRNA 的3′端非翻譯區(qū)(UTR)中的互補序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達。已有研究表明，部分miRNA 可通過調(diào)節(jié)成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞等骨細胞的增殖和分化，參與調(diào)控高等脊椎動物的骨代謝過程[15]。例如，在人(Homo sapiens)和大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)中，miR-31 可通過抑制其靶基因OSTERIX[16]、SATB2和RUNX2[17]的表達來抑制成骨細胞分化。在人和小鼠(Mus musculus)的BMSCs 中，miR-204 和miR-211 可通過抑制RUNX2 基因的表達來參與骨代謝調(diào)控[18]。Wang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在人胚胎成骨細胞系(hFOB)中，miR-27 通過激活Wnt 信號通路，從而促進成骨分化，也可通過促進堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素mRNA 的表達來促進成骨。He 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在miR-20b 介導的人間充質(zhì)干細胞(hMSCs)成骨過程中，miR-20b 可通過負調(diào)控PPARγ、BAMBI和CRIM1，提高RUNX2 表達量，分階段激活BMP/Runx2 信號通路，促進成骨細胞分化；miR-140 可通過調(diào)控斑馬魚(Danio rerio)軟骨組織中骨轉(zhuǎn)化因子sox9 來抑制成骨[21]。目前，關(guān)于miRNA 在魚類骨代謝調(diào)控過程中的作用機制鮮有報道。

虹鱒(Oncorhynchus mykiss)屬鮭形目(Salmoniformes)鮭科太平洋鮭屬(Oncorhynchus)，是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的鮭鱒魚類[22]，是sCT 的天然來源生物之一。本研究通過對虹鱒幼魚進行sCT腹腔注射，并于注射后24 h 采集鱗片用于轉(zhuǎn)錄組測序。通過分析注射組及對照組鱗片組織中miRNA 的表達水平，篩選差異表達miRNA (DEMs)，并對其進行靶基因預測。隨后，對預測的靶基因進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析，進一步分析miRNA 在骨代謝過程中的作用機制。最后，采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)對部分DEMs 的表達量進行檢測，驗證測序結(jié)果的可靠性。本研究篩選到的可能參與虹鱒骨代謝調(diào)控過程的miRNA，可為闡明魚類骨代謝的調(diào)控機制提供研究素材。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚來自山東省濰坊市臨朐縣淡水虹鱒養(yǎng)殖基地。實驗開始前置于有效體積為1 000 L(直徑1.6 m，高0.6 m)的PE 桶中，水深約為桶高度的1/2，暫養(yǎng)7 d (鹽度28，水溫14～16 °C)，光周期為12 h∶12 h，每天早上8:00 和下午4:00 投喂配合飼料(總投喂量約為魚體重的3%)。隨后挑選健康且有活力的個體進行實驗。

1.2 鮭降鈣素注射處理及樣品的采集

使用MS-222 麻醉虹鱒幼魚后，注射組(IG)虹鱒腹腔注射sCT (sCT 配制濃度為0.2 μg/mL，注射劑量為2 μg/kg 魚體重)，對照組(CG)腹腔注射等體積生理鹽水[13,23]。注射24 h 后分別刮取兩組虹鱒幼魚[體長(16.33±1.30) cm，體重(52.21±7.24) g]魚體左側(cè)鱗片(背鰭基部下方至尾柄處)，并立即置于液氮速凍，后轉(zhuǎn)移至-80 °C 保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序和qRT-PCR 檢測。實驗過程中操作人員嚴格遵守相關(guān)法律法規(guī)及倫理規(guī)范，并按照廣東海洋大學動物實驗倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.3 總RNA 提取及miRNA 測序

使用TRIzol (Invitrogen，美國)提取IG 和CG 組的鱗組織總RNA。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，使用Nanodrop 2 000 核酸蛋白測定儀檢測樣品的濃度及純度。對檢測合格的樣品，利用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離純化18～26 nt 的小分子RNA。使用TruSeq Small RNA Sample Prep 試劑盒(Illumina，美國)進行miRNA 文庫構(gòu)建。通過Illumina Hiseq 2 500 測序平臺進行高通量測序，測序讀長為single-end (SE)50 nt。miRNA 測序由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理及生物信息學分析

使用miRNA 分析軟件ACGT101-miR (LC Sciences，美國)過濾數(shù)據(jù)，得到堿基長度為18～26 nt 的序列。將剩余序列比對到mRNA、RFam和Repbase 數(shù)據(jù)庫，篩選并剔除mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和重復序列等相關(guān)序列后獲得Valid read。再將Valid read 與miRBase 數(shù)據(jù)庫比對，序列完全匹配的為已知miRNA。根據(jù)miRNA 標志性發(fā)夾結(jié)構(gòu)，通過Pre-miRNA (mirs/MIRs)數(shù)據(jù)庫信息比對，運用miREvo[24]和miRDeep2[25]軟件預測新的3p 和5p miRNA。

計算各樣品中miRNA 的表達量，使用TPM進行歸一化處理。采用t檢驗方法對IG 和CG 組中miRNA 進行差異表達分析，按照表達量倍數(shù)差異(fold change)>2.0 或<0.5 和表達差異顯著性P<0.05 篩選出DEMs。使用TargetScan (篩選閾值為>80)和miRanda (篩選閾值為<–20)數(shù)據(jù)庫對顯著性差異的miRNA 分別進行靶基因預測，取兩數(shù)據(jù)庫的交集作為差異miRNA 的最終靶基因。再利用GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫分別對DEMs 靶基因的集合進行功能注釋和通路富集分析。

1.5 實時熒光定量PCR 檢測

隨機選取8 個DEMs 進行qRT-PCR 檢測。以U6 為內(nèi)參，通用下游引物qPCR-MICRO-R 由SYBR Green QPCR Mix (DF Biotech，中國)試劑盒提供，上游引物由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。所有qRT-PCR 反應(yīng)均為3 個生物重復，每個重復包括4 個技術(shù)重復。根據(jù)試劑盒說明書進行qRT-PCR 檢 測。10 μL 反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×SYBR?Green Supermix 5 μL，ddH2O 3 μL。利用analytikjenaqTOWER 2.2 型qRT-PCR 儀(Analytik Jena AG，德國)進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 °C 預變性3 min；95 °C 變性10 s，60 °C 退火30 s，72 °C 延伸30 s，循環(huán)39 次；閾循環(huán)(Ct)值采用軟件默認設(shè)置，利用2-△△Ct計算各樣品的miRNA 相對表達量[26]。以平均值±標準差(=3)表示差異miRNA的相對表達值。利用SPSS 19.0 軟件中的單因素方差(One-Way ANOVA)法，分析miRNA 表達量在IG 和CG 組鱗片中的差異水平，并進行Duncan氏多重比較，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

表1 用于qRT-PCR 檢測的引物序列Tab.1 Primer sequences used for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 虹鱒鱗片轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

對IG 和CG 組的虹鱒鱗片進行轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)處理，分別獲得27 877 410 和33 156 331條Raw read，經(jīng)多次過濾后，分別獲得14 051 631(唯一序列739 250 條)和15 816 147 (唯一序列783 756 條)條Valid read (表2)。兩組樣品的Valid read 特征相似，其中22 nt 的miRNA 最豐富，分別占IG 和CG 組鱗片miRNA 總數(shù)的24.75%和25.73%，其次是23 nt 的miRNA，分別占兩組樣品miRNA 總數(shù)的22.21%和24.01% (圖1)。

圖1 虹鱒鱗片中表達的miRNA 的片段長度分布Fig.1 Fragment length distribution of miRNA expressed in scales of O.mykiss

表2 虹鱒鱗片中表達miRNA 的原始數(shù)據(jù)及已過濾序列的讀取分布Tab.2 Original data of miRNA expression in O.mykiss scales and the sequence reading distribution of filtered sequences

2.2 虹鱒鱗組織miRNA 鑒定

將Valid read 與miRBase 數(shù)據(jù)庫比對，共鑒定到629 種已知成熟miRNA，分屬于103 個不同的miRNA 家族，其中IG 組包括568 種miRNA，CG 組包括592 種(圖2)。

圖2 虹鱒鱗片中表達的miRNA 的鑒定橙色區(qū)域為共有miRNA，粉色區(qū)域為注射組特異表達miRNA，綠色區(qū)域為對照組特異表達miRNA。Fig.2 Identification of miRNA expressed in O.mykiss scalesThe orange region is the common miRNA,the pink region is the miRNA specific to injection group (IG),and the green region is the miRNA specific to control group (CG).

2.3 差異表達miRNA 篩選及其靶基因預測

根據(jù)篩選標準(|log2(fold change)|>1，且P<0.05)對差異miRNA 進行評估，共獲得24 個DEMs。其中已知miRNA 21 個，新預測的miRNA 3 個。這些DEMs 中有9 個表達上調(diào)，15 個表達下調(diào)(圖3)。利用TargetScan 和miRanda 數(shù)據(jù)庫分別對上述24 個miRNA 進行靶基因預測，共獲得5 376個靶基因，其中每一DEMs 的靶基因預測結(jié)果見表3。

圖3 差異表達miRNA 熱圖Fig.3 Heat map of differentially expressed miRNA

表3 差異表達miRNA 與預測靶基因數(shù)Tab.3 Differentially expressed miRNA and the number of target genes

2.4 差異表達miRNA 靶基因GO 注釋及富集分析

對DEMs 的靶基因進行GO 功能注釋和富集分析。靶基因注釋結(jié)果包括細胞組分(cellular component)、生物過程(biological process)和分子功能(molecular function)三大功能類別(圖4)。在生物過程類別中，注釋到靶基因數(shù)目最多的功能依次為：轉(zhuǎn)錄調(diào)控-DNA 模板、信號轉(zhuǎn)導、多細胞生物發(fā)育和細胞黏附等。在細胞組分分類中，以膜、膜的組成部分、核和細胞質(zhì)等功能注釋靶基因較多。分子功能類別中以金屬離子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA 結(jié)合和鈣離子結(jié)合等功能注釋靶基因最多。最顯著富集的靶基因GO 功能依次為NF-kappaB 輸入細胞核的負調(diào)節(jié)、β-連環(huán)蛋白結(jié)合、宿主對病毒基因組復制的負調(diào)控和TGF-β 結(jié)合等功能(圖5)。

圖4 差異表達miRNA 靶基因的GO 富集1.轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA-模板；2.信號轉(zhuǎn)導；3.轉(zhuǎn)錄，DNA-模板化；4.多細胞生物發(fā)育；5.細胞黏附；6.RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；7.G-蛋白偶聯(lián)受體信號通路；8.蛋白質(zhì)水解；9.Wnt 信號通路；10.運輸；11.神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育；12.磷酸化；13.確定左右對稱性；14.小GTPase 介導的信號轉(zhuǎn)導；15.蛋白質(zhì)磷酸化；16.神經(jīng)嵴細胞遷移；17.RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控；18.經(jīng)典Wnt 信號通路；19.氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運；20.外胚層參與原腸形成及口腔第二次形成；21.氧化還原過程；22.脂質(zhì)代謝過程；23.背/腹模式形成；24.細胞分化；25.基因表達的正調(diào)控；26.膜；27.膜的組成部分；28.核；29.細胞質(zhì)；30.質(zhì)膜；31.質(zhì)膜的組成部分；32.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；33.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；34.細胞外泌體；35.細胞外間隙；36.胞外區(qū)；37.胞質(zhì)溶膠；38.高爾基體；39.蛋白質(zhì)細胞外基質(zhì)；40.線粒體；41.金屬離子結(jié)合；42.蛋白質(zhì)結(jié)合；43.DNA 結(jié)合；44.鈣離子結(jié)合；45.序列特異性DNA 結(jié)合；46.轉(zhuǎn)移酶活性；47.核酸結(jié)合；48.核苷酸結(jié)合；49.ATP 結(jié)合；50.鋅離子結(jié)合。Fig.4 GO enrichment of target genes of differentially expressed miRNA1.regulation of transcription,DNA-templated;2.signal transduction;3.transcription,DNA-templated;4.multicellular organism development;5.cell adhesion;6.regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter;7.G-protein coupled receptor signaling pathway;8.proteolysis;9.Wnt signaling pathway;10.transport;11.nervous system development;12.phosphorylation;13.determination of left/right symmetry;14.small GTPase mediated signal transduction;15.protein phosphorylation;16.neural crest cell migration;17.positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱpromoter;18.canonical Wnt signaling pathway;19.amino acid transmembrane transport;20.epiboly involved in gastrulation with mouth forming second;21.oxidation-reduction process;22.lipid metabolic process;23.dorsal/ventral pattern formation;24.cell differentiation;25.positive regulation of gene expression;26.membrane;27.integral component of membrane;28.nucleus;29.cytoplasm;30.plasma membrane;31.integral component of plasma membrane;32.endoplasmic reticulum;33.endoplasmic reticulum membrane;34.extracellular exosome;35.extracellular space;36.extracellular region;37.cytosol;38.Golgi apparatus;39.proteinaceous extracellular matrix;40.mitochondrion;41.metal ion binding;42.protein binding;43.DNA binding;44.calcium ion binding;45.sequence-specific DNA binding;46.transferase activity;47.nucleic acid binding;48.nucleotide binding;49.ATP binding;50.zinc ion binding.

圖5 差異表達miRNA 靶基因顯著富集的前20 個GO 注釋條目圓圈代表一個GO 條目，圓圈顏色代表P 值，顏色越綠代表顯著富集性越可靠，圓圈越大代表富集的靶基因數(shù)目越多，下同。1.白細胞介素-1β 分泌的負調(diào)節(jié)；2.莖環(huán)結(jié)合；3.參與炎癥的細胞因子產(chǎn)生的負調(diào)節(jié)；4.甲基化-DNA-[蛋白質(zhì)]-半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶活性；5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的外在成分；6.RNA 磷酸二酯鍵水解；7.表皮發(fā)育；8.陰離子運輸?shù)恼{(diào)節(jié)；9.自噬的正調(diào)控；10.軸突再生的正調(diào)控；11.蛋白質(zhì)寡聚化；12.氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運；13.鈣依賴性半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性；14.細胞對酸性pH 值的反應(yīng)；15.脊髓背側(cè)/腹側(cè)模式；16.對活性氧反應(yīng)的調(diào)節(jié)；17.TGF-β 結(jié)合；18.宿主對病毒基因組復制的負調(diào)控；19.β-連環(huán)蛋白結(jié)合；20.NF-kappaB輸入細胞核的負調(diào)節(jié)。Fig.5 Top 20 GO terms with significant enrichment of differentially expressed miRNA target genesThe circle represents a GO term,the color of the circle represents P. The deeper the green color,the more reliable the significant enrichment,and the larger the circle,the greater the number of enriched target genes,the same below.1.negative regulation of interleukin-1 beta secretion;2.RNA stem-loop binding;3.negative regulation of cytokine production involved in inflammation;4.methylated-DNA-[protein]-cysteine Smethyltransferase activity;5.extrinsic component of endoplasmic reticulum membrane;6.RNA phosphodiester bond hydrolysis;7.epidermis development;8.regulation of anion transport;9.positive regulation of autophagy;10.positive regulation of axon regeneration;11.protein oligomerization;12.amino acid transmembrane transport;13.calciumdependent cysteine-type endopeptidase activity;14.cellular response to acidic pH;15.spinal cord dorsal/ventral patterning;16.regulation of response to reactive oxygen species;17.transforming growth factor beta binding;18.negative regulation by host of viral genome replication;19.Beta-catenin binding;20.negative regulation of NF-kappaB import into nucleus,NF-kappaB.

2.5 差異表達miRNA 靶基因KEGG 富集分析

虹鱒鱗片中DEMs 靶基因共富集到315 條通路，其中顯著富集通路79 條。排名前20 的DEMs 靶基因富集通路信息見圖6。最顯著富集的通路是細菌入侵上皮細胞，其次為黑色素生成、甘油磷脂代謝、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、醚脂代謝和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染等通路。

圖6 差異表達miRNA 靶基因顯著富集的前20 條KEGG 通路1.細胞因子-細胞因子受體相互作用；2.長壽通路調(diào)節(jié)-蠕蟲；3.吞噬體；4.阿爾茨海默氏癥；5.咖啡因代謝；6.酮體的合成與降解；7.Hippo 信號通路；8.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工；9.病毒性心肌炎；10.雌激素信號通路；11.化學致癌；12.toll 樣受體信號通路；13.磷酸戊糖途徑；14.麻疹；15.金黃色葡萄球菌感染；16.醚脂類代謝；17.致心律失常性右心室心肌病 (ARVC)；18.甘油磷脂代謝；19.黑色素生成；20.細菌入侵上皮細胞。Fig.6 Top 20 KEGG pathways with significant enrichment of differentially expressed miRNA target genes1.cytokine-cytokine receptor interaction;2.longevity regulating pathway-worm;3.phagosome;4.alzheimer's disease;5.caffeine metabolism;6.synthesis and degradation of ketone bodies;7.hippo signaling pathway;8.protein processing in endoplasmic reticulum;9.viral myocarditis;10.estrogen signaling pathway;11.chemical carcinogenesis;12.Toll-like receptor signaling pathway;13.pentose phosphate pathway;14.measles;15.Staphylococcus aureus infection;16.ether lipid metabolism;17.arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy(ARVC);18.glycerophospholipid metabolism;19.melanogenesis;20.bacterial invasion of epithelial cells.

2.6 miRNA 的qRT-PCR 檢測

隨機選擇8 個DEMs (7 個已知miRNA 和1個新預測miRNA)進行qRT-PCR 檢測。8 個miRNA 在IG 與CG 組鱗片中的表達量差異均極顯著(P<0.01)。8 個差異miRNA 中有3 個miRNA上調(diào)、5 個下調(diào)，各miRNA 的表達模式均與測序結(jié)果一致(圖7)，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。

圖7 差異表達miRNA 的qRT-PCR 檢測Fig.7 qRT-PCR detection of differentially expressed miRNA

3 討論

注射sCT 24 h 后，虹鱒鱗片中共篩選出24個顯著DEMs (9 個表達上調(diào)，15 個表達下調(diào))。表達上調(diào)的miRNA 中，omy-miR-29a-5p 和omymiR-200b-5p 的靶基因主要富集于Wnt、TGF-β 和Notch 等信號通路。據(jù)報道，經(jīng)典Wnt 通路中的部分基因不僅能促進小鼠成骨細胞的分化、骨基質(zhì)的形成及礦化，還能夠抑制破骨細胞的發(fā)生及骨吸收功能[27]。其中，miR-29a/b 靶向基因為成骨細胞外基質(zhì)蛋白編碼基因，是促進成骨細胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。在體外培養(yǎng)的hFOB 中，miR-29a 可通過下調(diào)DKK1、KREMEN2 和SFRP2 等在Wnt 信號通路中起負調(diào)控作用的基因，來增強Wnt 信號轉(zhuǎn)導，進而促進成骨細胞分化[28-29]。而miR-29b 可通過下調(diào)抑制成骨細胞分化的HDAC4、TGF-β3、ACVR2A、CTNNBIP1 和DUSP2 等靶 基因的表達來促進成骨[29-30]。由此可推測，omy-miR-29a-5p 在虹鱒鱗片的骨代謝過程中具有調(diào)節(jié)作用。此外，miR-200b 可通過激活成骨樣細胞系(MG-63)中骨形成信號及軟骨相關(guān)信號通路，促進成骨[31]。在人牙齦上皮細胞Ca9-22 中，miR-200b 還可通過靶向作用于IKKβ和ZEB1 基因來抑制AMTN基因的表達，并抑制IL-6 的表達，抑制破骨細胞活性[32]。本研究中，omy-miR-200b-5p 靶基因預測結(jié)果顯示，該miRNA 靶向作用于bmp4 和bmp15 等骨形態(tài)發(fā)生家族基因，進一步揭示了omy-miR-200b 參與調(diào)節(jié)骨細胞分化增殖過程的作用機制，印證了BMP 和TGF-β 等相關(guān)信號通路在促進成骨過程的重要作用。綜上，上述兩個差異miRNA 及其靶基因富集的信號通路在虹鱒骨代謝過程中具有重要調(diào)節(jié)作用。

表達下調(diào)的DEMs 中，omy-miR-30d-5p 靶基因為蛋白激酶C α (protein kinase C alpha type)基因，該基因的KEGG 富集分析結(jié)果顯示其參與MAPK、Wnt 和VEGF 等骨代謝相關(guān)信號通路的調(diào)控過程。此外，miR-30 家族成員可通過靶向作用于小鼠Smad1 和Runx2 基因，抑制Bmp-2 誘導的成骨細胞分化，從而抑制BMSCs 向成骨細胞分化[33]。因此，可選取該miRNA 家族作為候選基因深入開展魚類骨代謝研究。另一顯著下調(diào)DEMs，omy-miR-138 靶基因包括可促進成骨細胞分化及骨形成的bmp1a和bmp4 基因。miRNA-138 是hMSCs 成骨細胞分化的負調(diào)節(jié)因子，可通過抑制FAKERK1/2 信號通路中與成骨過程密切相關(guān)的RUNX2 和OSX的表達來抑制成骨作用[34]。據(jù)此推測，omy-miR-138 表達水平下降對于維持虹鱒鱗組織中成骨細胞分化過程具有重要意義。omymiR-199b-5p 靶基因為鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ型亞基β (calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit beta)，該基因富集于鈣信號通路和Wnt 信號通路。上述表達下調(diào)的DEMs 其靶基因多富集于Wnt、MAPK 和TGF-β 等信號通路，其在魚類鈣代謝及骨代謝過程的調(diào)節(jié)作用有待進一步研究。

本研究篩選出的DEMs 靶基因多注釋到鈣離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合和G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路等功能上，這些功能在鈣代謝調(diào)控過程中具有重要作用。鈣代謝作為骨代謝的重要表征之一，在一定程度上反映了sCT 對于虹鱒骨代謝過程的調(diào)節(jié)作用。據(jù)報道，小鼠G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路可通過激活Wnt 信號通路，促進MSCs 向成骨細胞方向分化。由此可見，各關(guān)鍵信號通路在成骨細胞分化過程中的作用各異且相互調(diào)節(jié)。此外，DEMs 靶基因極顯著富集在NF-kappaB 輸入細胞核的負調(diào)節(jié)和il-1β分泌的負調(diào)節(jié)功能上。NF-KB在破骨細胞形成、分化、成熟和抗凋亡過程中具有重要作用[35]。IL-1β可通過多種方式促進破骨細胞的增殖分化，促進骨吸收；還可通過抑制OPG的表達，抑制骨形成[36]。據(jù)此，基于GO 注釋結(jié)果篩選出的關(guān)鍵DEMs 可為揭示骨代謝調(diào)控機制提供研究素材。

KEGG 富集分析結(jié)果顯示，DEMs 靶基因主要被顯著富集于Toll 樣受體信號通路、雌激素信號通路等重要的骨代謝調(diào)節(jié)通路。在Toll 樣受體信號通路(TLR 信號通路)中，TLR2 可通過誘導小鼠巨噬細胞分泌TNF-α 或激活Nf-kb促進破骨細胞分化以及介導骨吸收，TLR4 可促進Il-1β過表達，促進破骨細胞形成及骨吸收[37]。雌激素是重要的骨代謝調(diào)控激素，可直接作用于成骨細胞，促進成骨細胞的增殖和抗凋亡；可通過促進膠原及BMP 合成，來促進骨礦化；與雌激素受體結(jié)合抑制破骨細胞活性；或通過抑制成骨細胞分泌IL-6 以及通過調(diào)節(jié)OPG、RANKL和M-CSF等細胞因子的平衡來抑制破骨細胞活性，還可通過促進TGF-β的表達誘導破骨細胞凋亡[36-38]。除此之外，DEMs 靶基因還被富集于各種能量代謝相關(guān)信號通路中，可見該通路中的相關(guān)基因在魚類骨代謝調(diào)節(jié)過程中可能具有重要作用。

本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)對sCT 注射組和對照組虹鱒鱗片進行miRNA 測序，獲得了鱗片miRNA 表達譜，并利用生物信息學方法從中篩選可能參與魚類鈣代謝、骨代謝調(diào)控過程的DEMs?；贒EMs 靶基因功能注釋及富集分析結(jié)果，篩選 到omy-miR-29a-5p、omy-miR-200b-5p、omymiR-30d-5p、omy-miR-138 和omy-miR-199b-5p 等多個目標miRNA，這些miRNA 在表達水平上受到sCT 影響，其對應(yīng)的靶基因不僅在功能上參與骨形成、骨吸收等骨代謝的調(diào)控過程，還多顯著富集于與骨代謝相關(guān)的代謝通路，上述DEMs 的發(fā)現(xiàn)可為揭示魚類骨代謝的調(diào)控機制研究提供素材。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）