伍永鴻 奠雅雯 張?zhí)祛?歐文靜 黃喜燕 張明倩 崔 爽 梁五林 張碩峰

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院,北京,102488)

社交行為障礙是許多神經(jīng)發(fā)育障礙和精神疾病的典型特征,表現(xiàn)為與人交往時(尤其是大眾場合下),會不由自主地感到緊張、害怕,以致手足無措、語無倫次,嚴重的甚至害怕見人,稱為社交恐懼癥、人際恐怖癥[1],并常出現(xiàn)于注意力缺陷多動障礙(Attention Deficit Hyperactivity Disorder,ADHD)、抑郁癥、自閉癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder,ASD)等疾病[2]。因此,社交行為的變化就成了判斷精神疾病的標準之一。社交行為亦存在于動物之間,為了在動物模型上研究社交行為的變化,科學家開發(fā)出了一系列的行為學實驗,常見的包括嗅覺適應或不適應試驗、鉆管試驗、食物偏好轉變測試、社會偏好或逃避行為測試、三箱社交行為測試(Three-Chambered Social Test,TCT)等[3]。其中,TCT是評價動物社交行為最常用的實驗方法,主要使用大鼠、小鼠,其原理是基于小鼠天生喜群居、對新物體具有探索傾向的特性[4],用于檢測待測動物的社交探索行為、社交識別和社交趨新能力。但由于評價指標多為觀察者主觀記錄,且觀察時間較短,缺乏客觀的技術參數(shù),難以準確、客觀地評價動物的社交程度。考慮到傳統(tǒng)三箱實驗的以上缺陷和不足,故研究者在其原來的基礎上進行了改進,重新區(qū)域劃分。本實驗采用ADHD大鼠作為社交障礙模型,以WKY大鼠和Wistar大鼠作為對照組,模型動物采用治療ADHD的臨床常用中成藥小兒黃龍顆粒進行治療,以待測鼠在密切交流區(qū)域及有陌生鼠側區(qū)域的時間、頻次、路程及比例作為行為學指標,測試該裝置與評價方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR)24只,雄性,2周齡,體質(zhì)量45～60 g;SPF級同源正常血壓WKY大鼠8只,雄性,2周齡,體質(zhì)量45～60 g;SPF級Wistar大鼠8只,雄性,2周齡,體質(zhì)量45～60 g,均由斯貝福(北京)生物技術有限公司[許可證編號:SCXK(京)2019-0010]提供。動物合格證號:SHR:110324211105414141、11032411106224726,WKY大鼠:110011211111739136、110011211113633112,Wistar大鼠:11032411105414438、110324211106224824。室溫(23±2)℃,相對濕度為65%±5%,給藥前使動物先適應性飼養(yǎng)2 d,自由攝取食水,并且實驗過程中對動物的操作符合醫(yī)學動物倫理學標準(動物實驗倫理審批號:BUCM-4-2022110801-4028)。

1.2 藥物 小兒黃龍顆粒:由重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn),規(guī)格5 g/袋,批號:201002。小兒黃龍顆粒臨床人用量為6～9歲,1袋/次,2次/d;10～14歲,2袋/次,2次/d。按12歲體質(zhì)量32 kg計算,人用量為5 g/32 kg=0.156 25 g/kg。大鼠低劑量用藥量按照人用量的6倍計算,2袋/d,即1.88 g/kg;大鼠高劑量用藥量按照人用量的12倍計算,2袋/d,即3.75 g/kg。

1.3 儀器 AR1140/C型電子分析天平,奧豪斯(上海)公司產(chǎn)品;Ethovision XT 9.0型動物行為跟蹤儀(荷蘭Noldus公司);新三箱社交裝置。

1)立體空間結構圖,裝置的空間結構見圖1。其外側為透明的立方結構(44 cm×44 cm×44 cm),內(nèi)部由中間塑料板和前側塑料板(其塑料板均不透明)以及里側鐵絲網(wǎng)將該裝置劃分為5個不同的腔室,其各腔室位置和所占區(qū)域大小圖中已標明。實驗時,待測動物由入口處進入通道區(qū)域1,并可經(jīng)自由選擇隨機進入?yún)^(qū)域2或區(qū)域3。鐵絲網(wǎng)內(nèi)側區(qū)域被均分為區(qū)域4和區(qū)域5,作為空白區(qū)域和陌生鼠區(qū)域。實驗期間,陌生鼠被隨機放置在區(qū)域4或5,另一側區(qū)域作為空白區(qū)域;待測動物可在區(qū)域1、2、3內(nèi)自由活動,并能通過鐵絲網(wǎng)與陌生鼠進行嗅、靠近、接觸等社交行為。

圖1 新三箱裝置立體空間結構

2)俯視區(qū)域劃分,利用EthoVision XT 9.0軟件對動物社交行為進行分析時,對采集到的畫面進行區(qū)域劃分。見圖2。首先,將通道區(qū)域1標記為K區(qū)域,并將區(qū)域2、3均分為a、b和A、B區(qū)域。b、B區(qū)域為靠近鐵絲網(wǎng)和內(nèi)側陌生鼠的區(qū)域,待測動物在該區(qū)域可與陌生鼠之間發(fā)生頻繁接觸、靠近、攀附鐵絲網(wǎng)(企圖靠近)等親密行為,故可視為待測鼠與陌生鼠的密切交流區(qū)域,而a、A區(qū)域距離內(nèi)側陌生鼠和空白區(qū)域均較遠,動物間的交流減少,通過對交流密切區(qū)域和交流稀疏區(qū)域的劃分,可以反映動物的真實社交程度,達到對動物社交行為的精確量化與系統(tǒng)評價。最后,將區(qū)域4、5在鏡頭下所形成的區(qū)域標記為C、D區(qū)域,作為陌生鼠區(qū)域和空白區(qū)域,實驗時將陌生鼠隨機放入C區(qū)域。數(shù)據(jù)統(tǒng)計時,以a+b、b表示有陌生鼠側區(qū)域和密切交流區(qū)域,其對應空白側的區(qū)域分別為A+B、B,基于以上區(qū)域劃分,對動物社交行為進行系統(tǒng)分析。

圖2 新三箱裝置俯視區(qū)域劃分

1.4 方法

1.4.1 分組 將SHR按體質(zhì)量隨機分為3組,每組8只,即SHR組、小兒黃龍顆粒1.88 g/kg組、小兒黃龍顆粒3.75 g/kg組,另設WKY大鼠組、Wistar大鼠組作為對照,6只雄性、體質(zhì)量相似的Wistar大鼠作為社交實驗的陌生鼠。

1.4.2 給藥方法 各給藥物均按1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給藥,給藥組灌胃用生理鹽水配成的小兒黃龍顆粒溶液,SHR組、WKY大鼠組、Wistar大鼠組灌喂生理鹽水,1次/d,灌胃時間為早上9:00,連續(xù)給藥16 d。

1.4.3 檢測方法與指標 在給藥期結束后的第1天進行社交偏好實驗,每組選取1只進行平行實驗,每次4只。實驗時,先在鐵絲網(wǎng)內(nèi)側的C或D區(qū)域隨機放入1只陌生鼠,將待測鼠由入口處放入所改進的三箱實驗裝置中,使其首先適應環(huán)境1 min,再觀察30 min,所得視頻文件用Noldus動物行為跟蹤儀Ethovision XT 9.0進行分析。每做完1組后,將鼠取出歸籠,清理裝置內(nèi)的尿液和糞便,并用乙醇擦拭,消除殘余氣體,再進行下1組測試。檢測指標:1)區(qū)域交流時間,待測動物在區(qū)域b、區(qū)域a+b所待時間,以及不同區(qū)域的時間百分比,包括:a+b/A+B、b/B、b/a。2)區(qū)域運動路程,待測動物在區(qū)域b、區(qū)域a+b所運動的路程,以及不同區(qū)域的路程百分比,包括:a+b/A+B、b/B、b/a。3)區(qū)域進出頻次,待測動物進出區(qū)域b、區(qū)域a+b的頻次,以及不同區(qū)域的頻次百分比,包括:a+b/A+B、b/B、b/a。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件處理,所有計量數(shù)據(jù)以均值表示,各組計量數(shù)據(jù)先進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗,凡符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù),采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD檢驗;對不符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù),則應用非參數(shù)檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 對幼年SHR社交時間的影響 通過統(tǒng)計待測鼠在改進的三箱裝置中不同區(qū)域所待的時間及時間占比,檢測到WKY大鼠與SHR對陌生鼠的社交偏好程度明顯偏低,表現(xiàn)為在陌生鼠側b區(qū)域、a+b區(qū)域所待時間顯著降低(與Wistar大鼠組比較,P<0.01),不同區(qū)域所待的時間占比如a+b/A+B、b/B、b/a顯著降低(與Wistar大鼠組比較,P<0.01)。小兒黃龍顆粒1.88 g/kg可顯著增加SHR在b區(qū)域、a+b區(qū)域的所待時間以及a+b/A+B、b/B區(qū)域時間占比(與SHR組比較,P<0.05),并能提高b/a區(qū)域時間占比。小兒黃龍顆粒3.75 g/kg可不同程度增加SHR上述各指標數(shù)值,能明顯增加大鼠在b區(qū)域、a+b區(qū)域的所待時間以及a+b/A+B區(qū)域時間占比。見表1。

表1 小兒黃龍顆粒對幼年SHR社交時間的影響

2.2 對幼年SHR社交移動距離的影響 通過統(tǒng)計待測鼠在所改進的三箱裝置中不同區(qū)域所運動的路程及路程占比,檢測到WKY大鼠區(qū)域運動路程比例b/a降低,其中在b區(qū)域、a+b區(qū)域所運動路程以及區(qū)域運動路程占比a+b/A+B、b/B顯著降低(與Wistar大鼠組比較,P<0.01)。SHR組上述各項指標數(shù)值也降低,其中區(qū)域運動路程占比a+b/A+B、b/B顯著降低(與Wistar大鼠組比較,P<0.01)。小兒黃龍顆粒2種劑量組均能不同程度地增加SHR上述各項指標數(shù)值,能明顯增加模型大鼠在b區(qū)域、a+b區(qū)域的運動路程及a+b/A+B、b/B區(qū)域運動路程占比(與SHR組比較,P<0.05)。見表2。

表2 小兒黃龍顆粒對幼年SHR社交移動距離的影響

2.3 對幼年SHR社交頻次的影響 通過統(tǒng)計待測鼠在所改進的三箱裝置中不同區(qū)域的頻次及頻次占比,與Wistar大鼠組比較,WKY大鼠組在b區(qū)域、a+b區(qū)域的頻次以及區(qū)域頻次比例b/a、b/B降低,尤其是a+b/A+B區(qū)域頻次比例顯著降低(P<0.05)。SHR除了在a+b區(qū)域的頻次略高于Wistar組大鼠外,其余各指標數(shù)值均降低。與SHR組比較,小兒黃龍顆粒1.88 g/kg組大鼠上述各指標數(shù)值均增加,尤其是在區(qū)域b、區(qū)域a+b的頻次及區(qū)域頻次比例b/a顯著增加(P<0.05)。小兒黃龍顆粒3.75 g/kg組大鼠的區(qū)域頻次比例b/a顯著增加(P<0.05),其余上述各項指標數(shù)據(jù)均有不同程度的提高。見表3。

表3 小兒黃龍顆粒對幼年SHR社交頻次的影響

3 討論

社交行為障礙是許多神經(jīng)發(fā)育障礙和精神疾病的典型特征,如ADHD、抑郁癥、ASD等[5]。因此評價藥物對實驗動物社交行為的影響,是研發(fā)治療這些疾病的新型藥物和揭示社交障礙發(fā)生機制的重要研究手段。目前,常用的使用方法包括嗅覺適應或不適應試驗、鉆管試驗、食物偏好轉變測試、社會偏好或逃避行為測試、TCT等。其中TCT以其需要設備簡單,易于操作最為常用[6]。但由于多數(shù)指標為觀察者主觀記錄,且觀察時間較短,缺乏客觀的技術參數(shù),難以準確、客觀評價動物的社交情況。

本研究考慮到傳統(tǒng)三箱社交實驗的不足,在原來的空間基礎上做了改進,重新劃分了空間區(qū)域和設定了指標。其主要的設計思路和原理:1)傳統(tǒng)三箱實驗以中央室為起始區(qū)域,左右兩側分別為空白區(qū)域和陌生鼠區(qū)域,為長方形立體結構,但由于中央室兩側擋板的遮擋,待測動物在空白區(qū)域和陌生鼠區(qū)域中的視野暴露不完全,故在本裝置中對其空間布局做了重新規(guī)劃,將其改為矩形的立方結構,空白區(qū)域和陌生鼠區(qū)域由一塊中央擋板隔開,處于整個觀察區(qū)域的中央,無視野死角,并可以直接使用Noldus動物行為分析系統(tǒng)對動物的社交行為進行分析。2)本裝置以區(qū)域a、b、A、B為指標統(tǒng)計的關鍵區(qū)域,其在攝像頭下界限清晰,無視野盲區(qū),通過Noldus動物行為分析系統(tǒng)能準確地統(tǒng)計待測鼠在各區(qū)域內(nèi)的滯留時間、行走路程、出入頻次、運動軌跡等指標。3)在進行區(qū)域劃分時,將區(qū)域2、3分別均分為a、b區(qū)域和A、B區(qū)域,因為b、B為靠近鐵絲網(wǎng)與陌生鼠的一側區(qū)域,動物間的交流接觸更加頻繁,故作為交流密切區(qū)域,而相應的a、A區(qū)域則為交流稀疏區(qū)域,通過對交流密切區(qū)域和交流稀疏區(qū)域的劃分,更能反映動物的真實社交情況。4)通過a、b區(qū)域的劃分,統(tǒng)計動物在這2區(qū)域的出入頻次、滯留時間、行走路程等指標,可以得到動物在局部區(qū)域和整體區(qū)域的社交情況;整個裝置劃分為a+b、A+B、K3個大區(qū)域,待測鼠在有陌生鼠側區(qū)域的滯留時間、行走路程及出入頻次比例a+b/A+B值,以及在密切交流區(qū)域的滯留時間、行走路程及出入頻次比例b/B值,可以評價動物的社交偏好程度;在有陌生鼠側區(qū)域,b區(qū)域更加靠近陌生鼠,待測動物與陌生鼠之間交流密切,而a區(qū)域距陌生鼠較遠,動物間交流減少,b區(qū)域和a區(qū)域各指標的b/a值可以反映動物的真實社交活動程度,從而做到更加系統(tǒng)、全面、客觀地評價動物的社交偏好。5)傳統(tǒng)三箱社交實驗的適應環(huán)境時間為10 min,觀察時間10 min,而在本實驗中將觀察時間增加到30 min,以保證待測動物能夠與陌生鼠之間充分接觸,自由選擇社交或逃避,使結果能更加真實反映動物的社交偏好程度,增加結果的可靠性和減少偶然誤差。

為了驗證本實驗方法的可行性,我們選擇2周齡的SHR及同源的WKY大鼠、Wistar大鼠的進行測試。SHR起源于東京遠交系Wistar大鼠,是OKAMOTO和AOKI[7]在1963年運用選擇性近親交配法培育的WKY大鼠的基礎上,經(jīng)過交叉培育而成,因其10周齡后出現(xiàn)高血壓癥狀而得名,常用于高血壓的研究。而4～10周齡的SHR具有活動異常活躍,易沖動,易怒,學習記憶能力差,注意力不集中等特點[8],與人類兒童注意力缺陷多動障礙的癥狀吻合,故而用于ADHD模型大鼠。行為學研究表明其具有較強的活躍性和沖動性,并且由于沖動、多動的特點,易于陌生鼠間產(chǎn)生摩擦,表現(xiàn)出較弱的社交偏好程度,符合社交障礙模型的條件[9]。ADHD俗稱小兒多動癥,是指兒童和青少年期以注意力缺陷、多動、沖動為主要行為特征的神經(jīng)行為障礙性疾病[10],并常伴隨學習與記憶障礙、品行異常、社交障礙等問題。與正常兒童比較,ADHD患兒更多地表現(xiàn)出焦慮、害羞、退縮,害怕與他人交流,從而影響社會功能的形成與發(fā)展[11]。ADHD兒童的社會功能損害發(fā)生率高達89.8%[12],在情感因素方面存在困難,例如動機延遲和情緒調(diào)節(jié),是兒童社會技能問題的根本基礎[13]。故本實驗選取幼年SHR作為社交行為障礙的模型動物。SHR來源于WKY大鼠,其在10周齡后表現(xiàn)出高血壓的癥狀[14],故在做降壓實驗時常采用正常血壓的WKY大鼠作為SHR的天然對照;且因其比其他品系大鼠自主活動低,在曠場實驗中總運動量下降,在水迷宮實驗中易漂浮不動,故亦常作為ADHD模型SHR曠場實驗時的對照動物[15]。WKY大鼠雖然源自Wistar大鼠,但由于采取了近交維持措施,該品系大鼠已經(jīng)與原先的Wistar大鼠有了差別,常表現(xiàn)出抑郁樣的特征,在行為學方面表現(xiàn)為主動回避行為增加、對新異物體識別能力低,與臨床中抑郁患者興趣降低、認知功能受損、求生欲下降的特點較為相符,故不適用于用來作為幼年SHR社交行為實驗的對照大鼠[16]。由于SHR、WKY大鼠均源自Wistar品系大鼠,故本研究設Wistar大鼠組,亦作為對照,目的是為了增加與SHR社交障礙行為學特征的可比性,客觀反映SHR社交偏好情況。

本研究結果顯示,與Wistar大鼠組比較,WKY大鼠組與SHR組大鼠在b區(qū)域、a+b區(qū)域滯留的時間及時間比例均顯著降低(P<0.01),且在a+b區(qū)域更偏向于待在a區(qū)域,二者與陌生鼠的交流時間均減少;從區(qū)域移動路程結果來看,由于考慮到WKY大鼠自主活動低、運動速度慢,SHR多動、運動速度快的因素,其對區(qū)域運動路程存在客觀影響,故用區(qū)域運動路程占比更具合理性,而結果表明與Wistar大鼠組比較,2組大鼠在b區(qū)域、a+b區(qū)域兩區(qū)域運動路程比例a+b/A+B、b/B均顯著降低(P<0.01),說明WKY大鼠組與SHR組大鼠與陌生鼠交流均減少;同樣,從區(qū)域頻次分析,考慮到各組大鼠自主活動程度、運動速度的不同對區(qū)域頻次的影響,此外若待測動物與陌生鼠接觸時間短暫,則其出入?yún)^(qū)域頻次則增多,故用區(qū)域頻次占比結果來衡量動物的社交偏好程度更好,結果顯示,WKY大鼠組與SHR組大鼠區(qū)域頻次占比a+b/A+B、b/B,與Wistar大鼠組比較均減少,且在a+b區(qū)域里在b區(qū)域頻次占比更小,2組均表現(xiàn)出較低的社交偏好。

研究結果提示,WKY大鼠組與SHR組大鼠均存在社交障礙,且2組差異不大,較難區(qū)分,符合實際情況;Wistar大鼠更適合作為SHR社交障礙行為學實驗的對照動物。本實驗方法能詳細記錄動物的社交行為,并且所選取的指標(b區(qū)域和a+b區(qū)域的時間、路程、頻次及比例)能明顯、客觀、全面地反映不同組間的社交偏好差異,能夠辨別社交障礙動物與社交正常動物。小兒黃龍顆粒為第一個由國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的治療ADHD的中成藥[17],其方組成為熟地黃、白芍、麥冬、知母、五味子、煅龍骨、煅牡蠣、黨參、石菖蒲、遠志、桔梗。陳瑤[18]研究發(fā)現(xiàn),ADHD患兒在使用6周小兒黃龍顆粒治療后,口干咽燥、手足心熱、盜汗、失眠多夢及大便秘結積分均顯著降低;萬源[19]發(fā)現(xiàn)小兒黃龍顆粒能改善多動不寧、神思渙散2項主癥與手足心熱、大便秘結2項次癥,并且未發(fā)現(xiàn)不良反應。此外,在相關動物實驗中,其能改善動物行為學障礙,減少動物多動、沖動等異常行為,促進學習記憶,并能增加SHR對陌生鼠的偏好程度,延長與陌生鼠的交流時間,改善SHR的社交障礙[20]。鑒于小兒黃龍顆粒在臨床ADHD治療方面有著良好的安全性與有效性,并能改善ADHD大鼠模型的社交障礙,故作為本實驗的陽性藥物。

研究表明,小兒黃龍顆?？墒筍HR在b區(qū)域和a+b區(qū)域的時間、路程、頻次及比例均有不同程度增加。提示,在本方法可以評價小兒黃龍顆粒對社交障礙大鼠模型的逆轉作用,說明該方法能準確、系統(tǒng)捕捉動物的社交行為,對其社交偏好情況進行客觀評價。

綜上所述,該方法空間區(qū)域劃分合理,不僅解決了傳統(tǒng)三箱實驗的視野遮擋問題,能夠清晰觀察到待測動物在關鍵區(qū)域的行為情況;并且動物的社交行為可直接使用行為分析系統(tǒng)進行分析,實驗所選取的指標能將動物的社交行為精確量化,真實反映動物的社交偏好程度,區(qū)分社交障礙動物與社交正常動物。本實驗還通過增加觀察時間增強了結果的可靠性和減少偶然誤差,同時也避免了以往社交實驗人為記錄的主觀性,提高了實驗效果。此外,相比于WKY大鼠,Wistar大鼠更適合作為ADHD模型動物SHR社交障礙行為學實驗的對照動物。

利益沖突聲明:無。