肖艷新，劉 巖，許嶺翎，周亞茹*

1.保定市第一中心醫(yī)院 內分泌科，河北 保定 071000；2.河北醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院 內分泌科，河北 石家莊 050051；3.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 內分泌科 國家衛(wèi)生健康委員會內分泌重點實驗室，北京 100730

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝損傷,中國NAFLD患病率高達29.8%。鐵死亡是一種鐵依賴性氧化損傷引起的新型細胞死亡方式,鐵代謝異常、脂質過氧化和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFAs)的聚積都會誘發(fā)鐵死亡。最新研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡在NAFLD的發(fā)病及進展中起關鍵作用,通過螯合鐵、 減少脂質氧化以及清除自由基可以抑制鐵死亡,減輕肝臟損傷[1]。鐵死亡抑制劑可能成為治療NAFLD的新策略。本文就鐵死亡在NAFLD發(fā)病中的作用進行相關綜述。

1 鐵死亡及其調控機制

外周循環(huán)Fe3+與轉鐵蛋白結合后通過細胞膜上的受體進入細胞,Fe3+被還原為Fe2+,儲存于鐵蛋白中。鐵過載時,過量游離Fe2+可通過芬頓反應產生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS),從而觸發(fā)對蛋白和脂質的氧化損傷。PUFAs多存在于細胞膜中,在脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的作用下,被氧化為脂質過氧化氫,從而導致細胞膜的破壞和細胞死亡[2]。胱氨酸/谷氨酸逆轉運蛋白(system Xc-)是抗氧化系統(tǒng)的關鍵蛋白,調節(jié)谷氨酸與半胱氨酸的轉運,參與谷胱甘肽(glutathione,GSH)及谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的合成,抑制鐵死亡。鐵穩(wěn)態(tài)失衡、脂質過氧化及系統(tǒng)性Xc-/GSH/GPX4軸失衡為鐵死亡發(fā)生的標志。

鐵死亡機制復雜,存在多種調控機制,GTP環(huán)氫化酶1/四氫生物蝶呤/二氫葉酸還原酶通路和還原型輔酶Ⅱ/鐵死亡抑制蛋白1/輔酶Q10通路可能通過抑制脂質過氧化、增加膜修復途徑抑制鐵死亡。多種轉錄因子如TP53、NrF2、鋅指蛋白36等可能通過調控GSH合成在鐵死亡中發(fā)揮作用[3]。核受體共同活化因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)是降解鐵蛋白的選擇性載體受體,可增加鐵蛋白降解,導致游離Fe2+水平增加,促進鐵死亡。

2 鐵死亡在NAFLD發(fā)病中的作用機制

2.1 鐵過載在NAFLD中的作用

肝臟是鐵代謝的主要器官,高鐵飲食小鼠出現(xiàn)肝臟鐵過載及肝臟纖維化。將高鐵飼養(yǎng)小鼠的轉鐵蛋白基因敲除后,小鼠肝臟鐵過載和肝損傷更為嚴重,表現(xiàn)為ALT水平、肝臟纖維化標志物進一步升高,給予鐵死亡抑制劑ferrostatin-1治療后,肝纖維化明顯改善[4]。SLC39A14是一種金屬轉運蛋白,當轉鐵蛋白不足時,可以作為轉運蛋白將鐵轉運至細胞,導致細胞鐵超載。敲除SLC39A14基因后,高鐵飼養(yǎng)小鼠肝細胞可以免于鐵死亡。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)患者腸道對鐵的吸收顯著增加,通過放血維持體內鐵輕度缺乏狀態(tài)可降低血清谷丙轉氨酶水平,減輕肝臟鐵蓄積,改善肝臟病理[5]。這些研究提示鐵過載在NAFLD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

鐵過載小鼠出現(xiàn)血清鐵水平升高,同時伴隨氧化應激和脂質過氧化增加,進一步誘發(fā)胰島素抵抗,而胰島素抵抗是NAFLD發(fā)病的重要原因之一。2型糖尿病患者體內鐵負荷增高可能是其發(fā)生NAFLD及肝酶升高的獨立危險因素。在小于45歲女性中,血清鐵/鐵蛋白比值越高,內臟脂肪含量越低,且進展為嚴重脂肪肝的風險顯著降低[6],充足的循環(huán)鐵水平可使肝臟鐵過載減輕,從而減少肝損傷。鐵過載可以誘導miRNA-34a表達增加,miRNA-34a過表達將減少SIRT1轉錄和蛋白表達。給予小鼠尾靜脈注射miRNA-34a慢病毒抑制劑后,小鼠肝臟細胞脂肪變明顯減輕,同時SIRT1和PPARα的表達增加。體外實驗表明,miR-34a通過作用于SIRT1的3′-UTR的兩個候選結合位點抑制SIRT1的表達,提示鐵過載通過miRNA-34a/SIRT1途徑加重肝細胞損傷[7]。 鐵過載還可以激活 Kupffer 細胞產生炎性介質,如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6 等,這些炎性介質可以進一步加劇肝臟胰島素抵抗和脂質代謝紊亂,從而促進 NAFLD 的發(fā)展[8]

鐵調素(hepidin)主要在肝臟合成,能夠引起膜鐵轉運蛋白的內吞和泛素化,從而減少細胞內鐵離子排出;同時可抑制轉鐵蛋白受體,減少對鐵的吸收,因此,對鐵進出細胞具有雙重調節(jié)作用。敲除鐵調素基因,可導致鐵在肝臟大量蓄積。炎性介質可誘導肝細胞鐵調素轉錄,維生素D可以通過調控核因子κB-鐵調素途徑改善斑馬魚肝細胞鐵死亡[9]。鐵過載導致的miR-761/hepidin/GPX4軸失衡也參與了肝細胞損傷[10]。

2.2 脂質過氧化驅動肝細胞鐵死亡發(fā)生

脂質過氧化是鐵死亡的主要特征之一, PUFAs在長鏈脂酰CoA合成酶4(long chainacyl CoA synthetase 4,ACSL4)和脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的催化下發(fā)生脂質過氧化是鐵死亡的最終結局。在NAFLD小鼠模型中,抑制ACSL4表達可促進線粒體有氧呼吸,從而增強肝細胞介導的脂肪酸氧化能力,并通過上調過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferator-activa-ted receptor-gamma coactivator-1α, PGC-1α)減少脂質積聚[11]。人類的LOX家族包括6個成員,其中LOX5、LOX12、LOX15與鐵死亡有關。LOX12可通過與乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl CoA carboxylase 1,ACC1)相互作用誘導鐵死亡,加重NASH進展,抑制ACC1的表達可明顯改善肝臟脂肪聚積和纖維化[12]。磷脂酰乙醇胺結合蛋白1(phosphatidylethanolamine binding protein 1,PEBP1)可以與LOX15形成復合物,誘發(fā)鐵死亡[13],而15-LOX/PEBP1復合物產生的代謝產物可被鈣非依賴性磷脂酶A2β(iPLA2β)清除[14],iPLA2β可能是抑制鐵死亡的調節(jié)蛋白。

2.3 系統(tǒng)性Xc-/GSH/GPX4軸失衡加重肝細胞鐵死亡

系統(tǒng)性Xc-/GSH/GPX4軸在抗氧化應激、減輕脂質過氧化中起重要作用[15]。系統(tǒng)性Xc-由催化亞基溶質載體家族7成員11(recombinant solute carrier family7 member11,SLC7A11)和伴侶亞基溶質載體家族3成員2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)組成。NAFLD患者的血清GSH、GPX4水平高于對照組,提示NAFLD患者體內抗氧化應激系統(tǒng)激活以拮抗氧化應激。核因子2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是調節(jié)氧化應激的關鍵轉錄因子,Nrf2可以上調GPX4、血紅素加氧酶1表達,從而消除ROS聚積[16]。用小干擾RNA干擾GPX4的表達,可導致肝細胞ROS異常聚積[17]。小RNA干擾Nrf2表達后,小鼠肝細胞以及棕櫚酸/油酸誘導的HepG2細胞出現(xiàn)轉鐵蛋白-1、鐵蛋白重鏈-1表達上調以及脂質過氧化等鐵死亡相關表現(xiàn)[18]。高鐵飲食可降低小鼠肝臟GPX4和SLC7A11的轉錄和蛋白表達水平,升高ACSL4的轉錄和蛋白表達。鐵過載可抑制Nrf2與GPX4以及SLC7A11基因啟動子內抗氧化反應元件結合,進而導致其轉錄沉默,誘導鐵死亡發(fā)生[19]。NASH小鼠模型中,鐵死亡先于凋亡發(fā)生,鐵死亡抑制劑可保護肝細胞免于鐵死亡,并減輕細胞死亡后免疫細胞的浸潤和炎性反應。在蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導的NASH小鼠模型中觀察到[20],肝臟GPX4代償性升高,約為對照組1.5倍。繼續(xù)用鐵死亡誘導劑干預后,小鼠肝酶、肝臟脂肪變性、炎性指標進行性惡化,同時肝臟GPX4表達顯著下降、LOX12/15表達增加。應用GPX4激活劑、螯合鐵可降低小鼠NASH的嚴重程度。在NAFLD小鼠模型及AML12肝細胞培養(yǎng)中,發(fā)現(xiàn)誘導型GPX4(iGPX4),iGPX4亞型與經典型GPX對肝臟細胞氧化應激和鐵死亡具有相反作用。敲除小鼠iGPX4基因后給予高脂飲食誘導,小鼠肝臟的氧化應激、鐵死亡和細胞損傷減輕,推測iGPX4可能是GPX4負調控因子[21]。

3 通過鐵死亡途徑干預NAFLD的藥物

3.1 Ferrostatin-1

Ferrostatin-1是經典的鐵死亡抑制劑,可清除烷氧自由基,減少PUFA的氧化,比酚類抗氧化劑更有效地抑制鐵死亡,而且在抑制鐵依賴的脂質過氧化的同時不被消耗。Ferrostatin-1還可與Fe2+絡合、減少細胞內不穩(wěn)定鐵的水平,通過減輕鐵過載,從而抑制鐵死亡,改善NAFLD患者的肝損傷[22]。Ferrostatin-1主要通過有效抑制LOX15/磷脂酰乙醇胺結合蛋白-1復合物抑制鐵死亡,其對LOX15的抑制作用較弱[23]。

3.2 噻唑烷二酮類藥物

噻唑烷二酮(thiazolidinediones,TZD)類藥物如羅格列酮、吡格列酮可以選擇性激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR-γ),調節(jié)脂質代謝,減少內臟脂肪含量。TZD類藥物可抑制ACSL4,減少甘油三酯合成[24]。ACSL4是預測細胞鐵死亡的敏感標志物,羅格列酮、吡格列酮抑制鐵死亡的作用主要通過抑制ACSL4實現(xiàn),而非完全依賴其對PPAR-γ的作用。在PPAR-γ基因沉默的細胞中,羅格列酮也能發(fā)揮抑制鐵死亡作用。此外,TZD的細胞保護作用是預防性的,而非治療性,即只有在鐵死亡出現(xiàn)之前進行治療,才能使磷脂在足夠時間內重塑,從而實現(xiàn)有效保護作用。

3.3 維生素E

維生素E是脂溶性抗氧化劑,能阻止PUFA氧化,減少過氧化脂質的形成。GPX4-/-小鼠出現(xiàn)嚴重肝細胞變性,并在出生不久死亡,而喂食富含維生素E的母鼠所生的GPX4-/-幼崽可存活,但若后續(xù)剝奪維生素E攝入,GPX4-/-幼崽在4周后死亡,維生素E可通過對抗脂質過氧化發(fā)揮肝臟保護作用[25]。小鼠肝細胞原代冷培養(yǎng)后出現(xiàn)鐵死亡特征,而敘利亞倉鼠因能保持血液及肝臟高維生素E水平,從而防止脂質過氧化,對抗冷培養(yǎng)誘導的鐵死亡[26]。

4 問題與展望

鐵死亡在NAFLD發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,可能是NAFLD向NASH進展的誘因,抑制鐵死亡是治療NAFLD及預防NASH發(fā)生的新靶點。但鐵死亡在NAFLD發(fā)病中作用機制復雜,目前對鐵死亡的認知仍然存在許多未知領域,如鐵死亡信號通路及調控因素等,需要進一步的機制及臨床研究。