徐 旭 蘇江碩 鄧 波 張 飛 陳素梅 房偉民 陳發(fā)棣 管志勇

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀設(shè)計重點(diǎn)實驗室，江蘇南京210095）

植物新品種特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability）測試（以下簡稱DUS 測試）是新品種保護(hù)的技術(shù)基礎(chǔ)和授權(quán)的科學(xué)依據(jù)[1]。建立以DUS 測試技術(shù)為基礎(chǔ)的植物新品種保護(hù)體系對保護(hù)育種者權(quán)益、促進(jìn)植物品種創(chuàng)新具有重要意義。我國目前已經(jīng)制定并完成了50 多種、規(guī)劃研制了100 多種植物測試指南[2]。

菊花（Chrysanthemum morifoliumRamat.）有悠久的栽培歷史，具有很高的觀賞、食用、藥用等商業(yè)價值[3]。各科研院所及高校在菊花品種選育上保持較高的活躍度，不斷推出新品種，2012 年由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所主持發(fā)布的NY/T 2228—2012《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 菊花》（以下簡稱2012 年版測試指南）在菊花品種的測試中發(fā)揮了不可或缺的作用。

測試性狀的篩選是DUS 測試指南研制的核心，國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）相關(guān)文件中指明性狀是指可遺傳表達(dá)的能準(zhǔn)確區(qū)別、識別和描述的植物的特性和特征。測試性狀表達(dá)類型分為數(shù)量性狀、質(zhì)量性狀與假質(zhì)量性狀[4]。2012 年版菊花測試指南頒布使用已近10 年，品種申報單位及新品種測試中心均在使用指南過程中對測試性狀的適用性、易用性有了深切的感受，在使用中不斷優(yōu)化測試性狀可以使得指南更具有科學(xué)性，而測試性狀的優(yōu)化是在對品種資源表型多樣性長期觀察基礎(chǔ)上，對現(xiàn)有測試性狀進(jìn)行補(bǔ)充與刪減實現(xiàn)的。

一方面將具有遺傳穩(wěn)定性、特異性明顯且容易測試的性狀納入指南，或者將表達(dá)狀態(tài)覆蓋完全。如NY/T 2526—2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 丹參》測試指南中就補(bǔ)充了“株高、分枝數(shù)、花序”等重要特征。天麻測試指南研制中，根據(jù)實際表現(xiàn)，花莖顏色除了“淺綠、橙紅、深褐”3 種表達(dá)狀態(tài)，還應(yīng)補(bǔ)充“淡黃、藍(lán)綠”等表達(dá)狀態(tài)[5]。谷子測試指南中幼苗的苗期葉鞘顏色僅包括“綠色、紫色”2 種表達(dá)狀態(tài)，提出“黃色葉鞘”（谷子不育系多為此類型）未列入測試指南的缺陷。此外，谷子葉鞘花青甙顯色強(qiáng)度符合測試性狀的要求，卻未列入測試指南，應(yīng)該補(bǔ)充[6]。在箭筈豌豆新品種DUS 測試指南研制中，研制者提出在UPOV 的指南性狀的基礎(chǔ)上增加8 個具有特異性的性狀[7]。水稻DUS 測試指南研制中對性狀“倒二葉”的界定是：葉片綠色程度的表達(dá)狀態(tài)為極淺到極深，但研究發(fā)現(xiàn)有些水稻品種的倒二葉的顏色為淺紫色或紫色[8]，應(yīng)該覆蓋完全。

另一方面，測試性狀也并非越多越好，當(dāng)前已頒布的指南也存在一些穩(wěn)定性較差且不容易進(jìn)行測試的性狀。如辣椒測試指南中，關(guān)于“花梗姿態(tài)”這一性狀，表達(dá)狀態(tài)為“直立、水平、下彎”，大多數(shù)情況下，花梗從植株基部起逐漸向上彎曲，很難判斷出準(zhǔn)確的表達(dá)狀態(tài)[9]。無髯鳶尾的測試性狀篩選中，研制者通過R 型聚類，刪去對品種區(qū)分貢獻(xiàn)度較小的“雌蕊長、葉長”2 個性狀[10]；六出花屬測試指南研制中棄用了不同測試方式中變異系數(shù)大的“花序梗長度”性狀[11]。

再者，存在性狀劃分不合理或性狀的表達(dá)狀態(tài)表述不合理的情況。如我國蝴蝶蘭DUS 測試指南將UPOV 指南的“萼片：形狀”1 個性狀細(xì)分為“中萼片：形狀”和“側(cè)萼片：形狀”2 個性狀[12]。草莓DUS 測試指南修訂中將原指南的“中心小葉”改為“頂生小葉”，“葉平整度”改為“葉泡狀程度”，“葉緣缺刻”改為“鋸齒”，“果實空心”改為“果實空腔”[13]，使得表述上更符合實際情況。

本研究通過連續(xù)2 年觀測分析210 個形態(tài)多樣的菊花商業(yè)品種，探究2012 年版DUS 測試指南在性狀篩選和確定方面是否也存在上述問題，旨在篩選出遺傳穩(wěn)定、易測、特異性差別明顯的性狀，優(yōu)化調(diào)整相關(guān)性狀，以提高測試指南實用性。

1 材料與方法

1.1 材料試驗材料種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中國菊花種質(zhì)資源保存中心，于2019 年、2020 年連續(xù)2 年觀測品種共210 個，其中，切花大菊70 個品種，切花小菊110 個品種，傳統(tǒng)菊30 個品種。所有試驗材料均定植于溫室大棚中，定植時間為7 月下旬，參照DB11/T 845—2011《切花菊設(shè)施生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行管理。

1.2 調(diào)查方法采用群體測量（MG）、個體測量（MS）、群體目測（VG）、個體目測（VS）等方法觀測性狀77 個，包含2012 年版測試指南全部性狀68 個，以及在本次觀察群體中發(fā)現(xiàn)的多樣性性狀或表達(dá)狀態(tài)9 個，其中花部性狀或表達(dá)狀態(tài)4 個：“頭狀花序舌狀小花類型、管狀小花密集程度（僅適用于托桂型品種）、舌狀小花排列規(guī)律、管狀小花長度（僅適用于托桂型品種）”；葉部的性狀或表達(dá)狀態(tài)5 個：“葉片拱曲程度、葉裂片數(shù)量、葉片邊緣缺刻形狀、葉柄長度、葉片頂生裂片長度”。選擇具有代表性的表達(dá)狀態(tài)拍照記錄，并記錄對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量性狀與假質(zhì)量性狀及表達(dá)狀態(tài)的建議通過對210 個菊花品種2 個全生育期的性狀觀測，發(fā)現(xiàn)2012 年版測試指南未涉及頭狀花序舌狀小花常見的表達(dá)狀態(tài)：貫珠型和龍爪型（圖1），建議增加此性狀的表達(dá)狀態(tài)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種為泉鄉(xiāng)明星、金龍爪。

圖1 增加頭狀花序舌狀小花表達(dá)狀態(tài)：貫珠型和龍爪型

2012 年版測試指南未涉及托桂花型品種中常見的“管狀花密集程度”的多樣性性狀，本研究發(fā)現(xiàn)210 個品種包含40 個托桂花型品種，其中管狀小花“密集”品種31 個、管狀小花“稀疏”品種8 個、管狀小花“極稀”品種1 個（表1），該性狀有“密集、稀疏、極稀”3 種表達(dá)狀態(tài)（圖2a），對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種為南農(nóng)紫金輪、憩風(fēng)車、Belicia。

表1 花部性狀的表達(dá)狀態(tài)占觀察品種總數(shù)的頻次

圖2 增加花部質(zhì)量性狀

對于重瓣性較高品種存在的“舌狀小花排列規(guī)律”多樣性性狀，2012 年版測試指南也未提及，此性狀在傳統(tǒng)菊花中顯著表達(dá)，在觀測的30 個傳統(tǒng)菊花品種中，舌狀小花“逆時針”排列品種5 個，“無”排列品種20 個，“順時針”排列品種5 個（表1），表達(dá)狀態(tài)為“逆時針、無、順時針”3 類（圖2b），對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種為洹水黑旋風(fēng)、禾城春雷、紫宸殿。

2012 年版測試指南未涉及“葉片拱曲程度”性狀的多樣性，在對210 個品種葉片的觀察中發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為“平”的有129 個品種，“拱曲”的有81 個品種（表2），表達(dá)狀態(tài)為“平、拱曲”2 類（圖3a），對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種為Pimento、橙松月。

表2 葉部性狀的表達(dá)狀態(tài)占觀察品種總數(shù)的頻次

圖3 增加葉部質(zhì)量性狀

2012 年版測試指南未提及“葉裂片數(shù)量”的多樣性，210 個品種中葉片“5 裂”的有182 個，“7 裂”的有28 個（表2），表達(dá)狀態(tài)分為“5 裂、7 裂”2 類（圖3b），對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種為南農(nóng)金乒乓、Isis 韓。

“葉片邊緣缺刻形狀”性狀在2012 年版測試指南中也未涉及，本研究發(fā)現(xiàn)210 個品種在該性狀上的分布是：葉片邊緣缺刻“銳尖”的有57 個品種，“尖”的有116個品種，“圓鈍”的有37個品種（表2），建議增加此性狀，表達(dá)狀態(tài)分為“銳尖、尖、圓鈍”3類（圖3c），對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品種為燕山秋韻、Tigerrag、南農(nóng)金乒乓。

2012 年版測試指南“舌狀小花管部截面”性狀給出的表達(dá)狀態(tài)為“圓形、扁圓、平、三角形”，然而在Quinty 和Isis 韓2 個品種舌狀小花管部的不同位置進(jìn)行橫截發(fā)現(xiàn)了心形與梯形不同的形狀（圖4），由此可見該性狀給出的表達(dá)狀態(tài)不穩(wěn)定。并且該性狀要借助體視顯微鏡才能看清確定，不易觀測。因此，建議刪減此性狀。

圖4 舌狀小花管部截面的不同形狀

2.2 增加數(shù)量性狀的建議2012 年版測試指南未涉及“管狀小花長度（僅適用于托桂型品種）”性狀，通過本研究發(fā)現(xiàn)210 個品種性狀分布情況：管狀小花“短”的有71 個品種，“中”的有64 個品種，“長”的有75 個品種（表3），建議增加此性狀，并將其表達(dá)狀態(tài)分為“短、中、長”3 類（圖5）。

表3 數(shù)量性狀表達(dá)狀態(tài)品種占觀察品種總數(shù)的頻次

圖5 增加花部數(shù)量性狀

2012 年版測試指南未涉及葉柄長度，觀察發(fā)現(xiàn)210 個品種中葉柄“短”的有67 個品種，“中”的有74 個品種，“長”的有69 個品種（表3），可將其表達(dá)狀態(tài)分為“短、中、長”3 類（圖6a）。

圖6 增加葉部數(shù)量性狀

葉片頂生裂片長度在2012 年版測試指南也未涉及。本研究發(fā)現(xiàn)210 個品種中葉片頂生裂片“短”的有65 個品種，“中”的有86 個品種，“長”的有59個品種（表3），可將其表達(dá)狀態(tài)分為“短、中、長”3類（圖6b）。上述3 個數(shù)量性狀穩(wěn)定、易測，且均具有遺傳穩(wěn)定性，因此，建議增加。

2.3 測試性狀的適用范圍調(diào)整2012 年版測試指南將舌狀小花數(shù)量的適用范圍局限于單瓣和半重瓣品種，本研究發(fā)現(xiàn)重瓣花品種舌狀小花數(shù)量最少有17 瓣，最多可至526 瓣，平均值為181 瓣，變異系數(shù)高達(dá)77.702%。重瓣類型也可以通過花瓣計數(shù)來設(shè)定更多的級別，如單瓣、半重瓣、重瓣、極多重瓣，并為每個級別設(shè)定大致的花瓣輪數(shù)，建議將其調(diào)整為適用于所有品種。

此外，應(yīng)明確“舌狀小花：花冠筒長度”性狀的限制范圍，用以提高觀測的針對性，應(yīng)將其調(diào)整為：“舌狀小花：花冠筒長度（僅適用于平瓣和匙瓣品種）”。因為當(dāng)舌狀花完全圍合成為管瓣的時候，涉及品種的花冠筒長度就是舌狀花的長度，此時觀測該性狀并不發(fā)揮額外的區(qū)別作用（圖7）。

圖7 舌狀小花出現(xiàn)的平瓣、匙瓣、管瓣3 種類型

3 結(jié)論與討論

隨著菊花育種活躍度的增加和申請品種保護(hù)數(shù)量的激增，根據(jù)測試指南中暴露出的一些問題，對沿用時間過久的測試指南進(jìn)行修訂正是指南不斷完善的機(jī)會。測試性狀的選擇是DUS 測試指南制定的核心，也是提高測試指南實用性的關(guān)鍵[14]。2007年版的玉米DUS 測試指南相對之前的版本，剔除了25 個測試性狀，新增6 個測試性狀[15]；闞畫春等[16]建議對2012 年版棉花DUS 測試指南增加3 個性狀、修改3 個性狀術(shù)語的表達(dá)；張龍等[17]對192 份柱花草種質(zhì)進(jìn)行測試，在原指南基礎(chǔ)上補(bǔ)充了6 個性狀、剔除2 個性狀。

用質(zhì)量性狀區(qū)分品種效率高、易觀測。因此，指南的修訂往往關(guān)注質(zhì)量性狀的補(bǔ)充和調(diào)整。辣椒測試指南修訂中增加了7 個測試性狀，其中有4 個質(zhì)量性狀[18]。黃瓜測試指南的修訂中增加19 個測試性狀，其中有11 個是質(zhì)量性狀[19]。相比UPOV 茄子測試指南，我國的茄子測試指南增加了9 個性狀，其中有6 個質(zhì)量性狀[20]。非洲鳳仙測試指南的研制在UPOV 指南的基礎(chǔ)上增加了9 個測試性狀，其中有7 個質(zhì)量性狀[21]。蝴蝶蘭測試指南性狀的選擇比UPOV 指南多了11 個性狀，其中有9 個質(zhì)量性狀[12]。本研究提出的6 個質(zhì)量性狀或假質(zhì)量性狀易辨識且均有遺傳穩(wěn)定性，增加了區(qū)分品種特異性的依據(jù)。

有些品種的差別在于數(shù)量性狀，少數(shù)指南對數(shù)量性狀進(jìn)行了修訂。劉蕊等[22]為椰子測試指南篩選出19 個數(shù)量性狀。程蓓蓓等[4]通過對中國現(xiàn)有澳洲金合歡亞屬植物11 個品種進(jìn)行實地調(diào)查，篩選出4 個用于該屬新品種測試的數(shù)量性狀。我國研制的工業(yè)大麻測試指南31 個測試性狀中數(shù)量性狀就占了28 個，比UPOV 指南多4 個[23]。通過試驗觀察建議增加3 個易測記的數(shù)量性狀，并且目前就可實現(xiàn)品種區(qū)分，分別是“托桂型品種管狀小花長度、葉柄長度、葉片頂生裂片長度”，在區(qū)別相似品種時使用頻繁且有效。

測試性狀的取舍主要在于能否區(qū)別形態(tài)特異性，這點(diǎn)在不同作物上的體現(xiàn)不盡相同。在研制百合DUS 測試指南的時候以中國品種的實際狀況進(jìn)行抉擇，百合的“葉形、花蕾形狀、花型、斑點(diǎn)顏色、花香”等與觀賞性狀更相關(guān)的形態(tài)特征被沿用，未采用“葉序、葉末梢彎曲、葉片橫切面”等育種家不太關(guān)注的性狀[24]。在UPOV 紫薇測試指南的基礎(chǔ)上，我國的紫薇DUS 測試性狀也增添了14 個合乎于中國紫薇觀賞分類原則的性狀，例如“小枝、花萼、花蕾、瓣爪、雄蕊”等[25]。而菊花測試指南中測試性狀的建議，研究者更多的是發(fā)現(xiàn)其能更有效區(qū)分品種的性狀。

菊花種質(zhì)創(chuàng)新工作一直圍繞花部進(jìn)行，測試性狀的側(cè)重點(diǎn)在花部，2012 年版菊花DUS 測試指南在UPOV 指南基礎(chǔ)上增加了3 個性狀，其中花部2個，葉部1 個；刪減了23 個性狀，其中花部18 個，葉部4 個，其他相關(guān)性狀1 個；調(diào)整8 個性狀，其中花部7 個，葉部1 個。本研究通過連續(xù)2 個完整生育期觀測記錄210 個菊花商業(yè)品種的形態(tài)性狀，又在2012 年版測試指南的基礎(chǔ)之上，增加了9 個遺傳穩(wěn)定、易測且特異性差別明顯的性狀，其中花部性狀4 個，刪減1 個穩(wěn)定性差、不易測的選測性狀，并優(yōu)化2 個花部性狀的描述表達(dá)（表4）。隨著我國菊花育種活躍度的不斷提升，菊花品種的形態(tài)多樣性會不斷出現(xiàn)，菊花測試指南測試性狀應(yīng)及時根據(jù)新品種的出現(xiàn)做出相應(yīng)完善，以更好適應(yīng)區(qū)分品種的需要。

表4 菊花DUS 測試指南性狀修訂